BIOTECHNOLOGIA
TEMAT: Drożdże, jako mikroorganizmy wykorzystywane w procesach biotechnologicznych
Drożdże należą do grupy grzybów jedokomórkowych i w klasyfikacji botanicznej dzielimy je na 2 podgrupy:
1.workowce(ascomycetes)-posiadające zdolność rozmnażania generatywnego przez wytwarzanie workow i zarodnikow workowych
2.niedoskonałe(Fungi imperfect)-nie wystepuje tu zjawisko wytwarzania zarodnikow
Jest tez podzial drozdzy ze wzgledu na przeslanki praktyczne:
1.dzikie-spotykane w stadium naturalnym w przyrodzie wykazują aktywność na początku fermentacji winiarskiej,zdolne do wytwarzania małej ilości etanolu,powoduja wady i choroby wina
2.szlachetne-uzyskiwane ze szczepów dzikicg matodami selekcji hodowli inżynierii kom i generatywnych na pozyskiwanie szczepów o ulepszonych cechach biotechnologicznych np.zwiekszonej odporności na stężenie etanolu
Obecnie jest opisanych ok.1500 gat drożdzy ktore maja zastosowanie w:
-procesach biotechnologicznych(winiarstwo,piwowarstwo etc.)
-produkcja biomasy(drożdże piekarskie,paszowe, SCP-single cell protection)
Drożdze:
-Candida kefyr- kefiry, kumys (nie wiem cyz dobrze rozczytałam)
-Cryptococcus sp.- enzymy do koagulacji białek, mleka
- Rhodotorula sp.- karotenoidy
-Sacharomyces cerevisae-drożdże piekarskie,paszowe,SCP,etanol kefir
-S.pasteurianus-produktem jest piwo
-S.bayanus-produktem jest wino
-Candida flareri-produktem są witaminy
W produkcji bioetanolu zastosowanie znajdują drożdże z rdz Sacharomyces gat. cerevisiae(Sacharum-cukier,mycetes-grzyby,cerevisiae-piwo).Drożdże z rdz.Canidia,Endomycops-produkcja mlecznych napojów,enzymów,aminokwasów
Z kolei gatunki takie, jak S. cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis i Schizosaccharomyces pombe stanowią ważne źródło białek heterologicznych w przemyśle farmaceutycznym
Drożdże rozmnażają się przez:
-pączkowanie-wegetatywne
-podział poprzeczny komórki-wegetatywne
-zarodnikowanie-wegetatywne
-kopulacja-płciowe
Wytwarzanie worków i zarodników workowych to forma samoobrony na niesprzyjające warunki środowiska(brak supstancji pokarmowych,wody).Powstające w tych warunkach zarodniki stanowią formę spoczynkową odporną na wysychanie ,brak pokarmy(f.przetrwalnikowa).Gdy są dobre warunki to zaczynają kiełkować.
...............................W tym mjsc mam rysunek u siebie w notatkach wyśle zdjecie z nim w poniedzialek po poludniu bo nie mam kabla w domu do telefonu :P
W procesie pączkowania najpierw tworzy się uwypuklenie zwane PĄCZKIEM, do ktorego przechodzi część cytoplazmy i jedno z jąder potomnych po podziale jądra macierzystego.Wzrastająca kom może się oddzielić i być samodzielna.Po krótkim czasie nabywa zdolność do tworzenia kom potomnych.Pojedyńcza kom macierzysta jest zdolna do wytworzenia 20 kom potomnych i w miejscu oddzielenia się każdej powstaje BLIZNA.Co 90-120 min można zaobserwować podwojenie się liczby kom.
Proces pączkowania dzielimy na:
-pączkowanie wielostronne(multilateralne)-kom potomne powstają na całej powierzchni kom macierzystych
-pączkowanie biegunowe-na końcach komórek,i to wystepuje u form o cylindrycznych kształtach komórek
Schizosaccharomyces- drożdże rozszczepkowe- należą do Ascomycetes- rozmnażanie przez rozszczepienie (podział)- jak u bakterii
Niekiedy komórki potomne tworzą zespoły komórek- sa połączone ze soba, ale funkcjonuja niezaleznie od siebie- są autonomiczne
Kom.drożdżowa ma przeciętnie 75% wody,w skł suchej subst wchodzą:
-białka 45-60%
-węglowodany 25-30%
-tłuszcze 4-7%
-zw.mineralne 6-9%
Zw.mineralne tworzą gł. fosforany,sole potasu,sodu,wapnia i małe ilości np. żelaza,miedzi,cynku.Fosfor wystepuje jako skł estrów cukrowych i zw.pochodnych nukleotydów i kw.tłuszczowych.Bierze udział w przemianach energetycznych i oddechowych.Potas,żelazo,cynk,mangan są czynnikami aktywującymi działalnośc enzymów.Siarka utrzymuje odpowiednią strukture białek i jest skł czynnych grup enzymatycznych.
Ściana kom drożdży-budowa warstwowa,gł subst budulcowe to MANNAN- po zewnętrznej stronie i GLUKAN po wewnętrznej stronie,są też białka,tłuszcze i zw.nieorganiczne
............................................ZNÓW RYSUNEK..............................................
Cytoplazma-gdy jest dużo pokarmu to odkłada się GLIKOGEN-rezerwowy węglowodan i dwucukier TREHALOZA-chroni kom drożdży przed autolizą
Substancje zapasowe:
-wolutyna-substanja o charakterze białkowym
-glikogen-węglowodan,ktory gromadzi się w kom drożdży hodowanych na podłożach zawierających cukry
-tłuszcze-substancje zapasowe
Drożdże należą do chemoorganotrofów,może zachodzić katabolizm glukozy na drodze glikolizy(szlak EMP) lub szlaku heksozomonofosforanowym (szlak HMP)
EMP-produktem końcowym jest pirogronian,który może być redukowany do etanolu(f.alkoholowa) lub ulegać utlenieniu do CO2 i H2O
HMP-zachodzi w warunkach tlenowych i jego produktami są pentozofosforany- prekursorzy syntezy aminokwasów, nukleotydów i kwasów nukleinowych oraz fruktozo-6- fosforan i aldehyd 3- fofoglicerynowy, które mogą być włączane do szlaku glikolizy
Gł.szlakiem fermentacji glukozy jest glikoliza.W warunkach beztlenowych aktywność enzymów cyklu HMP jest bardzo niska.W szlaku EMP glukoza jest przekształcona do fruktozo 1,6-difosforanu,który zostaje rozszczepiony przez aldolazę do aldehydu 3-fosfoglicerynowego i fosfodihydroksyacetony, a te ulegają przemianie do aldehydu octowego i CO2 katalizowanego przez dekarboksylozę pirogronianową.Utworzony aldehyd octowy jest z udziałem dehydrogenezy.......................................
Energia metaboliczna w procesie fermentacji etanolowej jest pozyskiwana jedynie w reakcjach fosforylacji substratowej (2 mole ATP/mol glukozy). Teoretycznie z 1g glukozy powinno powstać 0.51g etanolu i 0.49g CO2 , ale ze względu na wykorzystanie glukozy do syntezy składników materiału komórkowego oraz tworzenie produktów ubocznych powstaje 0.46g etanolu i 0.44 g CO2
Mechanizm(?) tlenowy:
- wykorzystanie glukozy zaczyna się podobnie jak w warunkach beztlenowych od szlaku glikolizy
- slzak HMP służy do tworzenia metabolitów włączanych do szlaku glikolitycznego lub do syntezy polisacharydów, nuleotydów i aminokwasów. Pirogronian utworzony na drodze EMP wskutek dekarboksylacji oksydacyjnej z udziałem koenzymu A i w obecności kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej jest przekształcany do acetylo Co-A. Zaktywowany
acetylo-coA zostaje całkowicie utleniony do CO2 w cyklu Krebsa, który służy utlenianiu
acetylo-coA, ale też tworzeniu prekursorów (np a- ketogluforan, szczawianooctan i bursztynian) do dalszych syntez komórkowych.
Efekt Pasteura
- fermentacja alkoholowa jest zaktywowana przez tlen
- polega to na represji w warunkach tlenowych enzymów szlaku EMP. Dzieje się tak, bo metabolity ATP, jony H+ , cytrynian są inhibitorami fosfofruktokinazy (enzymu regulatorowego glikolizy). Hamowanie w sprzężeniu zwrotnym ma charakter sekwencyjny, bo gromadzenie się glukozo-6- fosforanu obniża aktywność heksakinazy oraz hamuje transport glukozy przez błonę cytoplazmatyczną. Zmiana warunków hodowli z bezltenowych na tlenowe u S. cerevisiae prowadzi do kierunkowego zwiększania się wydajności biomasy.
Efekt Pasteura jest obserwowany u wszystkich drożdży z wyjątkiem browarniczych.
Efekt Crabtree
- w warunkach tlenowych przy nadmiernym stężeniu glukozy w pożywce obserwuje się częściowe hamowanie oddychania komórek drożdży. Inhibicja oddychania jest na zasadzie katabolicznej represji glukozowej i nosi nazwę negatywnego efektu Pasteura i efektu Crabtree. Istota negatywnego ef Pasteura polega na hamowaniu.........................................................................................................................................
FAZY ROZWOJOWE DROŻDŻY
-F.rozmnażania-pączkowanie-wszystkie kom podlegają pączkowaniu,wykazują cytoplazmę rzadką i przejrzystą z połyskiem jedwabistym,dużymi wodniczkami-ta faza odpowiada stadium zafermentowania-jest tutaj znaczne zuzycie tlenu.
-F.fermentacyjna-większość kom.już nie pączkuje,gestrza cytoplazma,pojawiają się kropelki tłuszczu inne subst zapasowe,przezroczystosc cytoplazmy zmniejsza się moze sie pojawic glikogen i tluszcz.Wodniczki scisniete w cytoplazmie.
-F.spoczynku w osadzie-znaczna ilosc martwych kom i wyrazna plazmoliza,cytoplazma ziarnista i nieprzejrzysta przez subst zapaspwe.Faza ta przypada na okres fermentacji głownej i moze oznaczać moment do właściwego obciągu wina.
-F.utleniania-drożdże z osadu przechodzą na powierzchnie gdzie w obecnosci powietrza tworza zbite,przepojone tłuszczem wysepki okrągłych i niekiedy "koronkowo" pączkujących z paru str komórek.Może być widoczny pierścieniowy nalot drożdży.Kom wiążą intensywnie tlen z powietrza i prowadzą procesy utleniania alkoholu.
Faza zarodnikowa
- przy braku składników odzywczych i optimum dostępu powietrza
Wysoko wydajne szczepy drożdży stosowane w biotechnologii pozyskuje się metodami klasycznymi (selekcja, mutacja, hybrydyzacja naturalna, fuzja protoplastów) i nowoczesnymi- rekombinacja DNA
Szczepy musza się charakteryzować:
- krótkim czasem generacji
- wysoką wydajnością i szybkością tworzenia produktu
- brakiem patogenności
-stabilizacją genetyczną i fenotypową
- niskie wymagania pokarmowe i duża tolerancja na zmiany stężenia składników pożywki
- niska wrażliwość na zmiany warunków natlenienia
-toleranca na zmiany temperatury i ciśnienia, pH
Drożdże piekarskie
- wysoka szybkość wzrostu, wysoka aktywność enzymatyczna (szybkie zafermentowanie)
- zdolność do adaptacji do środowiska- zwiększone ciśnienie osmotyczne
- aktywność beta-fruktofuranozydazy, alfa- glukozydazy- do hydrolizy cukrów
-aktywnośc lipaz i proteaz- rozkład lipidów i białek (zapewnia to dobry bukiet zapachowo- smakowy)
- wysoka zawartość trechalozy- większa trwałośc i odporność
- wysoka zawartość białek
Drożdże paszowe
- do ich produkcji można wykorzystać surowce odpadowe- wywary gorzelnicze, melasę, serwatkę itp- najczęściej do ich produkcji wykorzystuje się szczepy należące do S. cerevisiae, Candida utilis, C. tropicalis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, Debaryomyces sp. i inne.
Drożdże paszowe mogą być wykorzystywane do produkcji preparatów białkowych (SCP)
Gorzelnictwo
- surowce roślinne- skrobiowe
- w przemysłowym- melasa lub serwatka
-cechy;
-zdolność szybkiego zafermentowania, działanie w kwaśnym środowisku i temperaturach 34-39 stopni Celsjusza, odpornośc na stężenie etanolu ponad 12% w/v, na podwyższone ciśnienie osmotyczne oraz maksymalna wydajność produkcji etanolu
Do produkcji etanolu z pomocą S. cerevisiae wykorzystuje się glukozę, fruktozę, sacharozę, maltozę, galaktozę, naltotriozę, ale nie są zdolne do rozkładania laktozy i polisacharydów.
Szczepy S. cerevisiae można poddać modyfikacji genetycznej łącząc korzystne cechy technologiczne reprezentowane przez inne rodzaje i gatunki drożdży. Wskutek fuzji protoplastów drożdży S. cerevisiae z hetero.......
Kolejnym kierunkiem doskonalenia szczepów drożdży gorzelniczych są modyfikacje genetyczne zmierzające do zwiększenia tolerancji komórek na podwyższony poziom etanolu, zwiększone ciśnienie osmotyczne- w warunkach stresu wywołanego tymi czynnikami.............................................................................................................
Drożdże winiarskie
-naturalna hybrydyzacja Saccharomyces i potem wyselekcjonowanie w środowiskach produkcyjnych(?)
- wszystkie obecnie otrzymywane izolaty winiarskie tego gatunku powstały w wyniku zmian genotypowych i fenotypowych drożdży krążących pomiędzy winnicami, a winiarniami
-szczepy drożdży przeznacozne do produkcji win powinny się charakeryzować:
- krótkim okresem adaptacji do środowiska......................................................................................................
Browarnicze
- dwa gatunki- S. cerevisiae (górnej fermentacji) i S. pastorianus (dolnej fermentacji)
- S. pastorianus- tworzą enzym alfa- galaktozę- zwykle zdolną do całkowitego metabolizowania trisacharydu rafinozy
działają w temperaturze 5-12 stopni- dlatego dolna fermentacja
- S. cerevisiae- 14-23 stopnie- górna fermentacja, oraz mają zdolność do flokulacji (sedymentacja, zbijanie się)
- cechy:
- szybkość wzrostu i wydajna produkcja biomasy- 3krotny wzrost biomasy w czasie propagacji; zdolność do szybkiej fermentacji brzeczki- ekonomiczniej aby było;) ............................................................
Schizosaccharomyces pombe
- na owocach- w przemyśle alkoholowym
- właściwości:
- fermentacja w wyskoich temperaturach- kraje tropikalne