WD-5

Źródła preparatów enzymatycznych:

• Grzyby i drożdże- ponad 50%

• Bakterie- 30%

• Zwierzęta 8%

• Rośliny 4%

Źródłem enzymów są przede wszystkim:

-grzyby strzępkowe (rodzaje: Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Mucor)

-bakterie (rodzaj Bacillus, rzadziej Escherichia)

-drożdże (rodzaj Saccharomyces, Kluyveromyces

Bezpieczne gatunki powszechnie stosowane:

-grzyby: Asperillus oryzae, Asperillus Niger, Trichoderma reesei

-drożdże: Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lactis

-bakterie: Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis

Preparaty mikrobiologiczne podlegają ocenie toksykologicznej m. in.: nie mogą być produkowane przez mikroorganizmy: chorobotwórcze, produkujące toksyczne metabolity, wykazujące aktywność antybiotyczną.

Do produkcji enzymów polecane są szczepy, które produkują enzymy pozakomórkowo.

-Najczęściej oczyszczenie metodą wgłębną (rzadziej powierzchniową).

-Prowadzi się w bioreaktorach- fermentatorach o pojemności od kilku dm³ do kilku m³.

-Stosowanymi źródłami C, N i substancji wzbogacających są: mąka ziemniaczana, kukurydziana, sojowa, mannok kukurydziany, melasa buraczana, otręby pszenne, ekstrakty drożdżowe, mączka rybna lub żelatyna.

-Dla enzymów hydrolitycznych (hydrolaz) stosuje się substancje zawierające typ hydrolizowanego wiązania (Aspergillus na pożywce zawierającej skrobię wytwarza glukoamylazę- rozkłądającą skrobię, hodowla na pożywce tłuszczowej- wytwarzane lipazy rozkładające tłuszcz)

-Podczas hodowli technologicznej krytyczne jest odpowiednie wymieszanie i napowietrzanie.

Schemat otrzymywania preparatu enzymu wewnątrzkomórkowego z mikroorganizmów

Hodowla mikroorganizmów

otrzymanie biomasy metodą powierzchniową lub wgłębną

↓

Oddzielenie komórek od płynu pohodowlanego

głównie wirowanie, filtracja

↓

Dezintegracja komórek

↓

Wirowanie, filtrowanie

↓

Supernat

(w superacie znajdują się wszystkie związki rozpuszczalne w buforze ekstrakcyjnym)

↓

Wstępne podczyszczanie: najczęściej

frakcjonowanie na podstawie różnic w

rozpuszczalności

↓

Wirowanie, filtrowanie

↓

Oczyszczanie metody chromatograficzne

Stabilizacja suszenie rozpyłowe,

aktywności fluidyzacyjne,

enzymatycznej sublimacyjne (liofilizacja)

↓ ↓

Preparat w Preparat w postaci proszku

postaci syropu

Dezintegracja komórek mikroorganizmów:

• Mechaniczne- stosuje się urządzenia z elementami rozdrabniającymi głównie młyny kulowe. Dezintegracja polega na bardzo, bardzo szybkim mieszaniu komórek organizmów z kulkami szklanymi- mechanizm uszkadzania ścian komórkowych

• Fizyczne -ultradźwięki

- prasy wysokociśnieniowe (spręża się komórki w powietrzu, N, CO₂- a następnie szybko rozpręża)

-szok osmotyczny (zmiany ciśnienia osmotycznego)

-kilkakrotne zamrażanie i rozmrażanie (np. w ciekłym N)

• Chemiczne -detergenty

- rozpuszczalniki organiczne (rozpuszczające głównie fosfolipidy) mogą być niebezpieczne w stosowaniu: aceton, alkohol, może powodować denaturację enzymów

• Enzymatyczne- enzymy lityczne rozkładają składniki ściany komórkowej, stosuje się najczęściej: lizozym, glukanazy, hitynazy, glikozydazy

Na skalę przemysłową stosuje się najczęściej:

-dezintegrację ciśnieniową

-mechaniczną (z kulami szklanymi)

Bufor ekstrakcyjny powinien:

-enzym powinien być rozpuszczalny w roztworze ekstrakcyjnym, pH odległe od punktu izoelektrycznego białka (bo wtedy białko łatwo wypada z roztworu)

-mieć odpowiednią siłę jonową oraz pojemność buforową

-temperatura buforu w okolicy +4ºC- ogranicza denaturację białek-hamuje peptydazy (optimum temp. 20-30 ºC

-stosowanie inhibitorów peptydaz

• Pepstatyna- hamuje peptydazy aspartylowe np. chymozyna- w centrum aktywnym zawierają kwas asparaginowy

• Leupeptyna- hamuje peptydazy serynowe lub cysteinowe

• EDTA- hamuje metalopeptydazy lub metaloproteinazy- helatują jony metali

-obecność dodatków stabilizujących cząsteczki białka głównie grupy karboksylowe COO^- i aminowe NH₃⁺, gdyż związki te ograniczają niekorzystne działanie H₂O

• Glicerol

• Sacharoza

• Glikol polietylenowy

Zmuszają białko do przyjęcia struktury zwartej, gdyż są bardziej hydrofobowe od wody, stymulują otoczenie białek w komórce.

-związki redukujące mostki siarczkowe- w centrum aktywnym często występują grupy -SH, aby zapobiec ich utlenianiu i powstawaniu mostków S-S, stosujemy związki zawierające również grupy -SH i to one się utleniają a nie centrum aktywne

• Glutation

• Merkaptoetanol

• DTT (ditiotreitol)

Wstępne podczyszczanie:

W przemyśle enzymy oczyszcza się w ograniczonym stopniu, stosuje się preparaty wstępnie podczyszczone. Jest to możliwe dzięki:

• optymalizacji biosyntezy: warunków hodowli i składników pożywki- aby uwarunkować produkcję na konkretne białko enzymatyczne.

• Mutanty otrzymane metodą inżynierii genetycznej także uwarunkowane na produkcję konkretnego białka

-czasami stosuje się preparaty surowe lub wysuszone- przemysł gorzelniczy, skórzany, tekstylny

-całe drobnoustroje- wypiek ciasta, sery pleśniowe

-w przemyśle farmaceutycznym, do celów analitycznych oraz badania jakości stosuje się wysoko oczyszczone preparaty.

Główne oczyszczanie:

-frakcjonowanie oparte na podstawie różnic w rozpuszczalności a następnie metodą chromatografii jonowymiennej lub sita molekularnego

• Chromatografia jonowymienna- dość tania

• Chromatografia powinowactwa- oczyszczanie nawet kilka tysięcy razy, ale bardzo duże koszty

• Chromatografia sita molekularnego- preparat rozwodniony, długotrwała ale tania

• Chromatografia hydrofobowa- droga

Najczęściej w technice preparowania enzymu zawartość enzymu nas interesującego w nieoczyszczonym preparacie powinna być wyższa niż 10%.

Rozdzielanie białek na zasadzie różnic w rozpuszczalności

1. Frakcjonowanie solami nieorganicznymi- wysalanie białka

Wysalanie białka- wytrącanie białka z roztworu pod wpływem wysokich stężeń soli obojętnych będących elektrolitami. Polega na zniszczeniu płaszcza wodnego wokół białka.

Na powierzchni białka występują aminokwasy hydrofilowe. Cząsteczki białka otoczone są płaszczem wodnym, cząsteczki wody ustawiają się wokół cząsteczki białka. Gdy białko ma dodatni ładunek, to woda ustawia się ujemną stroną i na odwrót. Sprawia to, że białko jest rozpuszczalne w roztworach wodnych.

Gdy do roztworu dodamy np. siarczan amonu (najczęściej stosowany, ale można użyć także siarczan magnezowy lub sodowy), którego cząsteczki silniej przyciągają wodę niż białko, płaszcze wodne tworzą się wokół jonów (analogicznie jak przy białku, gdy jon ujemny, to miałko dodatnią stroną i na odwrót).

Białko pozbawione otoczki wodnej łączy się z innymi białkami w podobnej sytuacji. Powstają agregaty białek, które wytrącają się z roztworu.

Właściwości tych związków wynikają z tzw. Szeregu Hofmeistera przedstawiającego sole zgodnie z rosnącą zdolnością wysalania białka:

Aniony: SCN^-<CIO₄^-<NO₃^-<Br^-<Cl^-<CH₃COO^-<SO₄^2-<PO₄^3-

Kationy: Ba²⁺<Ca²⁺<Mg²⁺<Li⁺<Cs⁺<Na⁺<K⁺<Rb⁺<NH₄⁺

Słabe elektrolity Mocne elektrolity, całkowicie

zdysocjowane

-Jest to proces odwracalny, po usunięciu soli,

-Przeprowadza się w temp. 2-4 ºC,

-pH zbliżone do pH izoelektrycznego białka,

-tani, łatwy proces

-powoduje minimalne straty enzymu

Białka które są bardziej hydrofilowe ulegają wysoleniu w wyższych stężeniach soli.

2. Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi

Rozpuszczalniki organiczne obniżają stałą dielektryczną, zmniejszają stopień uwodnienia lub jonowy co powoduje wzrost siły przyciągania pomiędzy przeciwnie naładowanymi grupami n powierzchni cząsteczki białka. Najczęściej używane: etanol, aceton. Ze względu na niebezpieczeństwo denaturacji białka metoda ta jest rzadziej stosowana niż wysalanie.

3. Frakcjonowanie rozpuszczalnymi polimerami niejonowymi

Np. dekstran i glikol polietylenowy w sposób niezupełnie wyjaśniony mogą wypierać białka i inne cząsteczki z roztworu, czyli przyjęcie zwartej struktury. Wielkość i kształt cząsteczek białka decyduje o rozpuszczalności polimeru.

4. Frakcjonowanie przez denaturację termiczną

Wykorzystuje się różnice w temperaturach denaturacji różnych białek, jedne denaturują w temperaturze 40ºC a inne np. w 60ºC.

5. Wytrącanie w punkcie izoelektrycznym

W pH= pkt. izoelektrycznemu białka najchętniej wypadają z roztworu. Trudno jest zastosować bez pomocy innych metod

Metody chromatograficzne

Chromatografia- metoda rozdzielania mieszanin, których składniki ulegają zróżnicowanemu podziałowi pomiędzy dwie fazy: nieruchomą (stacjonarną) i ruchomą.

w wyniku tego procesu poszczególne składniki migrujące przez złoże chromatograficzne z różną prędkością liniową, uzależnioną od ich powinowactwa do fazy stacjonarnej i fazy ruchomej.

złoże chromatograficzne= najczęściej nośnik (porowata nierozpuszczalna stała substancja) + faza stacjonarna

Faza stacjonarna: ciało stałe (np. adsorbent, jonit), ciecz (np. płyn w porach żelu, płyn wiązany przez celulozę w chromatografii bibułowej)

Faza ruchoma: ciecz lub gaz przepływający przez fazę stacjonarną

Chromatografia cieczowa- faza ruchoma ciecz

Chromatografia gazowa- faza ruchoma gaz (wykorzystywana w badaniach analitycznych)

Techniki chromatograficzne (sposoby prowadzenia chromatografii):

-bibułowa (nośnik= bibuła)

-cienkowarstwowa (nośnik= warstwa nośnika (np. celuloza, żel krzemionkowy) w postaci warstwy na płytce szklanej lub plastikowej)

-kolumnowa (nośnik w kolumnie chromatograficznej)

Najczęściej stosowana do oczyszczania enzymów jest cieczowa chromatografia kolumnowa:

-na kolumnę nakłada się roztwór białka

-przepłukuje rozpuszczalnikiem aby wymusić ruch fazy wodnej

-białka poruszają się z różną prędkością w zależności od powinowactwa do fazy ruchomej i stacjonarnej

-do różnych probówek zbierane różne frakcje białka.

Metody chromatograficzne (na podstawie sił fizycznych decydujących o rozdziale):

1. Chromatografia sita molekularnego- kształt i wielkość cząsteczek

2. Chromatografia jonowymienna- wypadkowy ładunek cząsteczek

3. Chromatografia hydrofobowa- właściwości hydrofobowe

4. Chromatografia powinowactwa- powinowactwo do ligandu

5. Chromatografia podziałowa- odmienna rozpuszczalność w 2 fazach

Techniki chromatograficzne (ze względu na różnice w ciśnieniach przepompowywania fazy ruchomej przez fazę stacjonarną):

-LPLC- low pressure liquid chromatography (niskociśnieniowa chromatografia cieczowa), często ruch fazy ruchomej wymuszany tylko grawitacyjnie

-FPLC- Fast protein liquid chromatography (szybka chromatografia cieczowa)

-HPLC- high performance/pressure liquid chromatography (wysokociśnieniowa.wysokosprawnościowa chromatografia cieczowa)

Techniki te różnią się rodzajem złóż i przyłożonym ciśnieniem, zasada rozdziału jest taka sama:

LPLC < 0,5MPa

FPLC 0,5-5 MPa

HPLC 5-35 MPa

HPLC w stosunku do LPLC

-szybsza metoda

-wysoka wydajność

-stosowanie wysokiego ciśnienia konieczność odpowiednich złóż- odpornych na wysokie ciśnienie. Nośnik w kolumnie ze stali nierdzewnej. Wielkość ziaren nośnika 3-10 μm- z tym związana jest wysoka rozdzielczość i ostrość rozdziałów:

• Im mniejsze ziarna nośnika tym większa powierzchnia czynna z którą ma oddziaływać rozdzielane białko, tym większa zdolność rozdzielcza

• Im mniejsza średnica ziaren tym większy opór dla fazy ruchomej, dlatego trzeba użyć wysokiego ciśnienia do jej pompowania.

Należy znać elementy zestawu do chromatografii:

Chromatogram- zapis sygnałów z defektora przedstawia w sposób ciągły zmiany w składzie eluatu w zależności od jego objętości i czasu.

Eluat- faza ruchoma opuszczająca złoże chromatograficzne zawiera sam rozpuszczalnik, bądź rozpuszczalnik wraz z rozdzielanymi białkami.

Chromatografia sita molekularnego:

• Kryterium rozdziału -na podstawie różnic w wielkości i kształcie cząsteczek

• Zasada rozdziału- rozdział mieszanin substancji o różnych masach cząsteczkowych opiera się na różnej szybkości migracji poszczególnych substancji przez złoże ułożone z granulek żelu o porach o określonej wielkości.

- duże cząsteczki (większe od wielkości porów) nie są w stanie wniknąć w granulki żelu ze względu na rozmiar- szybko przechodzą przez wolne przestrzenie między granulkami i mogą szybko wędrować wraz z czołem rozpuszczalnika

-mniejsze cząsteczki przenikają do wnętrza porów- prędkość migracji jest znacznie mniejsza.

Im cząsteczka mniejsza:

- tym głębiej penetruje pory granulek

-tym dłuższa jest droga migracji

-tym wolniej porusza się przez złoże

-tym później pojawia się w eluacie.

---