BIOLOGIA KOMÓRKI ZWIERZĘCEJ

Wykład 1

DNA - cząsteczka o wyjątkowych właściwościach, gdyż koduje informacje o białkach, RNA, jest odpowiedzialna za budowę komórki i informacje genetyczną.

Budowa cząsteczkowa DNA

• zasady azotowe : puryny i pirymidyny

• cukry : ryboza i deoksyryboza

• reszty fosforanowe

W 1953r. Crick i Watson rozszyfrowali strukturę DNA za co dostali nagrodę Nobla

Każda komórka zawiera 6*10 do 9 par zasad, a długość jednej zasady wynosi 3,4*10 do-9m.Mnożąc liczbę zasad przez ich długość otrzymujemy przybliżoną długość nici kwasu nukleinowego ( u człowieka około 2m w pojedynczej komórce, a w całym organizmie 150*10 do 12 m)

Ułożenie względem siebie warstw zasad w podwójnej helisie

• skręt (T)= 34 stopnie w helisie typu beta ( kąt rozchylenia sąsiadujących warstw zasad względem osi podłużnej)Jest także typ helisy alfa (u wirusów i hybryd) oraz Z.

• Obrót( R ) ~ o wartości +20 stopni do -10 stopni

• Przesunięcie (S) = +0,2 do -0,1 nm, ograniczone przez łańcuch fosforanowo- cukrowy

Bruzdy

Na powierzchni podwójnego heliksu przebiegają, owijając się spiralnie wokół podłużnej osi, dwie równoległe bruzdy ( rowki) : rowek mniejszy (1,2nm) i większy (2,2nm). Różnica taka wynika występowania wiązań glikozydowych nie naprzeciw siebie. Bruzdy są asymetryczne, gdyż pierścienie pentozowe cukrów leżą bliżej jednego z dwóch dalszych brzegów każdej z komplementarnych par zasad ( forma beta DNA), a ich rozmiar może być zmienny w zależności od typu helisy. Są to obszary w cząsteczce DNA przez, które inne cząsteczki mogą łatwiejszy dostęp do wnętrza podwójnego heliksu, ważny element rozpoznaczy dla łączących się z DNA ligandów.

Organizacja DNA u Procariota

Pojedynczy chromosom prokariotyczny zawiera prawie całą informacje genetyczną. Zdecydowana większość bakterii ma chromosom kolisty i nie posiada błony oddzielającej go od cytoplazmy co daje możliwość bliskiego występowania procesu produkcji mRNA na matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za biosyntezę białek.

Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesiąt pętli, które mają końce unieruchomione w białkowym szkielecie. Białka występujące w chromosomach bakteryjnych tzw. białka histonopodobne, poza organizowaniem DNA w chromosomie pełnią jeszcze dwie dodatkowe funkcje przypominając działaniem czynniki transkrypcyjne w komórkach eukariotycznych.

Wirus jako element genetyczny nie posiadający organizacji komórkowej. Może on istnieć pozakomórkowo, jednak wtedy nie zachodzą w nim żadne przemiany metaboliczne. Pozakomórkowa forma wirusa, wirion, jest cząsteczką zawierającą kwas nukleinowy i niekiedy posiadającą pewne komponenty makrocząsteczkowe.

Organizacja DNA u Eukariota

Rozmiar 10-100 tyś mpz im więcej genów tym więcej sekwencji powtarzających się, długość genu jest skorelowana z sekwencjami powtarzającymi się.

1. Nukleosom

Pierwsza jednostka upakowania DNA, w skład której wchodzą:

• białkowy rdzeń mający postać dyskowatego oktameru zbudowanego z 4 rodzajów histonów: H2A, H2B, H3 i H4. Oktamer jak nazwa wskazuje składa się 8 podjednostek - każdy z histonów występuje w liczbie 2 cząsteczek. W obrębie rdzenia między histonami obserwuje się dopasowanie przestrzenne przypominające uścisk dłoni w geście powitalnym tzw. shake hand. Oddziaływania te występują między dwoma histonami tworzącymi dimer. Przykładem może być heterodimer H2A-H2B ( hetero - to zbudowany z dwóch różnych rodzajów histonów)

• nić DNA oplatająca dyskowaty oktamer i wchodząca z nim w inerakcje

• białko spinające część wchodzącą i schodzącą dna - oplatającej rdzeń - od strony zewnętrznej. Jest ono również histonem, określanym symbolem H1. Dzięki histonowi H1 stabilizującemu strukturę nukleosomu możliwe jest występowanie całych ciągów nukleosomowych mających postać sznura koralików.

Nić DNA skraca się siedmiokrotnie , a jej średnica z 2 nm wzrasta do 11nm.

2. Solenoid

Łańcuchy nukleosomów organizowane są w struktury wyższego rzędu, a mianowicie w solenoidy: włókna o średnicy 30nm. Przypominają one sprężynę, w której zwoje to koralikowe łańcuchy nukleosomów skręcone tak, że płaskie powierzchnie dysków histonowych (tj. rdzeń) ułożone są równolegle względem osi solenoidu. Na jeden zwój w takiej sprężynie przypada 5-6 nukleosomów, a stopień kondensacji w tej strukturze wynosi 40 ( chodzi tu o pozorne skrócenie długości cząsteczki DNA ). Na poziomie solenoidu nić DNA zajmuje 40 razy mniej miejsca w porównaniu do sytuacji , w której występowałaby w formie rozproszonej cząsteczki.

3. Układ nukleoproteinowy

Efekt silniejszej kondensacji osiągany jest dzięki fałdowaniu solenoidów i dalej spiralizacji powstałych struktur wyższego rzędu, które stabilizowane są przez różnorodne białka niehistonowe. Statecznie mamy do czynienia z chromatyną tj. układem nukleoproteinowym ( DNA + białko ), który w różnych fazach cyklu komórkowego przybiera różną formę. W interfazie - czasie między podziałami : mitotycznymi i mejotycznymi - chromatyna jest mało skondensowana i w mikroskopie można ją obserwować jako kłebowisko drobnych nitek. Podczas podziału chromatyna ulega zdecydowanemu zbiciu formując się początkowo w długie i wiotkie chromosomy, które im bliżej momentu rozdzielenia pomiędzy dwie komórki potomne stają się mniejsze i masywniejsze. Najsilniejszą kondensacje chromatyny a zatem najefektywniejszą redukcję „długości” DNA obserwuje się w komórkach będących w metafazie.

4. Chromosom

W somatycznych komórkach człowieka podczas matefazy cały materiał genetyczny zorganizowany jest w 46 chromosomów o łącznej długości 200 m. W skład chromosomu można następujące elementy:

• centromer - przewężenie pierwotne, którego zewnętrzna część ma postać pierścienia białkowego nazywanego kinetochorem. Jest to miejsce przejściowego wiązania mikrotubul wrzeciona podziałowego. Centromer dzieli chromosom na cztery, różnej długości ramiona chromosomu.

• Satelity - inaczej trabanty, końcowe fragmenty ramion chromosomów oddzielone przewężeniami wtórnymi

• Telomery - końcowe fragmenty chromatyd, zbudowane z powtarzających się sekwencji niekodujących ( TTAAGG)n oraz białek TRF. Telomery stabilizują strukturę chromosomu i podczas każdej replikacji ulegają skróceniu, a następnie odbudowywane przez telomerazę. Skracanie telomerów prowadzi do wiązania się nukleaz z chromosomami i fragmentami DNA.jest to jedna z prawdopodobnych przyczyn starzenia się komórek.

REPILKACJA DNA U PROKARIOTA I EUKARIOTA

( enzymy uczestniczące w tym procesie, białka pomocnicze, widełki replikacyjne, replikon, nić prowadząca i nić opóźniona)

Replikacja jest semikonserwatywna tzn. każda cząsteczka potomna zbudowana jest z jednej nici macierzystego DNA i jednej nici nowo zsyntetyzowanej, zachodzi w fazie ś cyklu komórkowego i jest procesem umożliwiającym zachowanie stałej ilości DNA w kolejnych pokoleniach dzielących się komórek.

Replikacja odbywa się od końca 5' do końca 3' nici DNA, rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu cząsteczki ( miejsce inicjacji )utworzeniem widełek replikacyjnych , a odcinek objęty replikacją to tzw. replikon. Kompleks replikacyjny złożony jest z wielu białek niezbędnych w ruchach widełek replikacyjnych. Taki kompleks nazywany jest replisomem.

Rodzaje widełek replikacyjnych u Prokariota:

• powiększające się oczko

• obracające się oczko

• powiększająca się pętla

Prokariota - miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ściśle określone twz. Ori ( origin of replication ) dla każdego typu bakterii, ponadto podobna jest aranżacja genów zarówno w ori jak i w miejscu terminacji syntezy DNA. Wyznaczane przez sekwencje nukleotydowe np. u E.coli jest to obszar zlokalizowany w locus OriC: 245 pz w jego obszarze 3 powtórzenia 13 pz sekwencji bogatych w A-T oraz bloki swoistych sekwencji 9 pz.

Eukariota - proces podwajania ilości DNA rozpoczyna się w tzw. miejscach inicjacji, których w DNA eukariotycznym ze względu na jego długość jest bardzo wiele ( 1 na 10 do 5 pz ). I tak dla przykładu w największym spośród czterech chromosomów Drosophila liczącym 62 mln pz replikacja startuje z ponad 6 tyś miejsc ( tzw ori ). Ori znajduje się w strefach między genowych i nie są ściśle sprecyzowane jak w przypadku proakriota. Oznacza to, że replikacja określonego fragmentu może rozpocząć się w jednym z kilku miejsc i może wyznaczyć je lokalna struktura chromatyny, oddziaływanie białek pomocniczych z sekwencjami leżącymi w pewnej odległości od rzeczywistego miejsca startu replikacji.

Drożdże - ORE ( miejsce rozpoznania START ) z nim wiąże się ORC ( kompleks 6 białek )

NIĆ WIODĄCA - helikaza wnika pomiędzy nici i rozsuwa je, pomaga w tym primaza. Oba enzymy tworzą tzw. primer przy którym na obu niciach powstają sekwencje startowe. Następnie zaczyna działać polimeraza III która, począwszy od sekwencji startowej, dobudowuje nową nić w kierunku przesuwającego się - od końca 5' do końca 3' - primera.

NIĆ OPÓŻNIONA - równocześnie gdy na nici wiodącej polimeraza III tworzy nową nić, na nici opóźnionej następuje ten sam proces. Istnieje jednak pewna różnica, gdyż na nici opóźnionej nowa nić jest tworzona w postaci tzw. fragmentów Okazaki. Dzieje się tak, gdyż na nici opóźnionej nowo syntetyzowana nić powstaje w kierunku przeciwnym do rozsuwających się widełek replikacyjnych i między sekwencją startową a primerem powstaje przerwa. Przy primerze tworzy się kolejna sekwencja startowa, od której polimeraza III tworzy kolejny fragment nowej nici w kierunku przeciwnym do ruchu primera. Tak więc otrzymujemy na nici opóźnionej dwa nowe fragmenty nici oddzielone od siebie sekwencjami startowymi. Po wytworzeniu pierwszego, a potem drugiego fragmentu Okazaki, zaczyna działać polimeraza I, która zmienia ORI na sekwencje nowej nici, a kolejny enzym ligaza scala oba fragmenty.

HELIKAZY - białka rozwijające podwójny heliks DNA wykorzystujące energie z hydrolizy ATP (należą do ATPaz). Mogą się przesuwać wzdłuż dwuniciowego DNA, rozdzielając nici i poszerzają widełki replikacyjne lub wzdłuż jednoniciowej matrycy. Wyróżniamy dwa rodzaje helikaz:

• działające w kierunku 5'do3'

• działające w kierunku 3' do 5'

PRIMAZY - występują u prokariotów i są odpowiedzialne za syntezę starterów na rozplecionej nici ( u eukariotów są to podjednostki alfa polimerazy)

POLIMERAZA DNA III - dołącza „cegiełki” nowej nici do starej. Synteza przebiega w kierunku 3' do 5', gdyż polimeraza wytwarza wiązania fosfodiesrtowe między resztą fosforanową na „cegiełce” a grupą OH ostatniej „cegiełki” na nowej nici znajdującej się na końcu 3'.

Prokariota mają wiele typów polimeraz ( polimerazy alfa, beta, delta, gama, elipson), które są kodowane przez różne geny.

U eukariotów w komórkach spotyka się tezy typy polimeraz:

1. polimeraza I - monomer, 400 cząstek w komórce, najmniejsza z polimeraz

2. polimeraza II - również monomer, do 40 cząsteczek w komórce

3. polimeraza III - heteromultimer, największa ale najmniej liczna polimeraza w komórce ( 10-20 cząstek)

inne enzymy biorące udział w replikacji:

1. białka SBB ( single-strand binding protein ) - stabilizują jednoniciową strukturę cząsteczki DNA, pokrywają cały obszar szkieletu fosfocukrowego łańcucha. Zbudowane są z 3 podjednostek ( RF -2 eukariontry) lub są tetramerami (E.coli). Duża specyficzność zdolność do łączenia się z innymi białkami ( niezbędne we wszystkich procesach metabolizmu DNA)

2. topoizomerazy - relaksują skręcenie podwójnego helisku ( dodają lub odejmują skręty helisy ). Są dwie klasy topoizomeraz :

1. topoizomerazy nacinające tylko jedną nić podwójnego heliksu

2. topoizomerazy nacinające obie nici DNA jednocześnie np. gyraza

3. ligazy polinukleotydowe - katalizują reakcje syntezy wiązania fosfodiestrowego między sąsiadującymi resztami 3'OH i 5'P nukleotydów połączonych wiązaniami wodorowymi z matrycową DNA. Łączą w replikacji fragmenty Okazaki w jedną nić. U bakterii źródłem energii do ich działania jest NAD, a u eukariotów i bakteriofagów ATP

CZYSTOŚĆ I STĘŻENIE KWASÓW NUKLEINOWYCH

Ocena właściwości spektrofotometrycznych cząsteczek DNA i RNA

1. ocena czystości i pomiar stężenia kwasów nukleinowych - pomiar absorbancji roztworu kwasów nukleinowych przy długościach fal: A260nm ( pochłaniane prze zasady azotowe) , A280nm ( pochłanianie przez aminokwasy aromatyczne). Stosunek A260nm/A280nm = 1,8-2,0 ( poniżej 1,8 to próbka zanieczyszczona białkami, powyżej 2,0 to próbka zanieczyszczona RNA)

2. pomiar stężenia kwasów nukleinowych = A260 * rozcieńczenie *b ( b= 50mg/ml w przypadku dwuniciowego DNA; 40mg/ml w przypadku jednoniciowego DNA, RNA; 20mg/ml w przypadku jednoniciowych oligonukleotydów )

WYKŁAD 2

ETAPY REGULACJI GENÓW

Eukariotyczne DNA można podzielić na kilka klas:

1. geny kodujące białka - u ssaków stanowią one ok. 2% ( czyli bardzo niewiele ) całego DNA; spośród nich wyodrębnia się geny:

• występujące w jednej kopii - np. gen kodujący owalbuminę ( główne białko jaja kurzego ). Godne uwagi jest to ,że jedna kopia genu wystarczy do zsyntetyzowania ogromnej ilości białka kodowanego przez ten gen

• powielone :

1. kilkakrotnie - jak w przypadku genu kodującego podjednostkę hemoglobiny

2. wielokrotnie - geny histonów, np. . u jeżowca występują w liczbie od 300 do 1000, a u człowieka od 30 do 40 kopii.

2. geny nie kodujące białek ( ich końcowym produktem jest RNA) - wielokrotnie powtórzone. Wśród nich wyróżnia się geny na :

• tRNA - transportujący RNA biorące udział w translacji

• rRNA - rybosomalny RNA różnych rodzajów; niektóre z nich zgromadzone są w tandemy

• snRNA - mały jądrowy RNA pełniący istotną rolę w wycinaniu intronów

3. pseudogeny - odcinki DNA przypominające normalne geny występujące w genomie danego organizmu; nie kodują funkcjonalnego produktu

4. powtarzające się sekwencje - których rola w większości przypadków nie jest znana

5. obszary służące do przyłączania czynników regulujących procesy związane z DNA - enhancery, silencery i inne.

Sekwencje kodujące genomów:

GEN- fragment DNA zawierający informacje genetyczną, kodującą cząsteczki RNA i / lub polipeptyd

Gen nieciągły - gen podzielony na eksony i i introny

Ekson - region kodujący genu nieciągłego

Intron - region nie kodujący genu ciągłego

Gen pozachromosomowy - gen w genomie mitochondrialnych lub chloroplastowym

Gen prokariotyczny - gen ciągły, zawiera sekwencje promotorowe i kodujące. Transkrypcji ulegają jedynie sekwencje kodujące - geny występują w skoordynowanych jednostkach - operonach, gromadzących geny całego szlaku metabolicznego i znajdujące się pod kontrolą wspólnego promotora

Gen eukariotyczny - jest najczęściej nieciągły, tzn. zawiera sekwencje kodujące ( eksony) i nie kodujące (introny ) oraz sekwencje promotorowe. Eksony i introny ulegają transkrypcji, introny są następnie wycinane z pierwotnego transkryptu.

Geny zachodzące na siebie - występują w genomach wirusowych. Sekwencje białek zachodzące na siebie nie są podobne ponieważ mRNA podlega translacji w różnych ramkach odczytu.

Val tyr gly

Sekwencje DNA GTT TAT GGT TA

GTTT ATG G TTA

met val

otwarta ramka odczytu ( ORF) = część genu kodującego białko, która ulega translacji

sekwencje mRNA przed ORF = lider lub 5'UTR ( 5' untranslated region)

sekwencje mRNA położone za ORF = 3' UTR ( 3' untranslated region)

Geny w genach - jeden gen znajduję się w intronie drugiego genu. Dość powszechnie w genomach jądrowych np. gen nerwiako -włóknowatości typu I zawierający w obrębie jednego z intronów trzy krótkie geny ( OGMP, EVI2A, EVI2B) Każdy z tych wewnętrznych genów jest również podzielony na introny i eksony

DNA ( gen kodujący białko ) transkrypcja , pre-mRNA ( pierwotny transkrypt) - wycinanie intronów- mRNA - białko

TRANSKRYPCJA

Proces, w którym informacja zawarta w DNA - zapisana w formie sekwencji deoksyrybonukleotydów - przepisana zostaje na język rybonukleotydów w pre-mRNA podczas reakcji katalizowanej przez enzym zwany polimerazą II RNA. Trzy następujące po sobie etapy : inicjacja transkrypcji, elongacja łańcucha pre-mRNA, terminacja

Inicjacja transkrypcji

Inicjacja transkrypcji u procaryota - enzym prowadzący transkrypcje t polimeraza RNA ( tu występuje jeden typ). Polimeraza działa bez dodatkowych białek ( częśc rdzeniowa, zbudowanej z trzech różnych elementów białkowych, oraz podjednostki odpowiedzialnej za rozpoznawanie i wiązanie się do sekwencji promotorowych, czynnik sigma, wykazują specyficzność dla określonych promotorów i wpływają na regulacje ekspresji genów.

Niektóre geny, żeby ulec ekspresji ( ekspresja genu - przepisanie genu na RNA a następnie na białko) muszą być specjalnie uruchamiane. Pewne fragmenty DNA decydują czy w danym momencie dojdzie do transkrypcji czy nie. Są to sekwencje regulatorowe. U procaryota występuje jedna sekwencja regulatorowa. Położona niedaleko promotora.

Inicjacja transkrypcji u Eucaryota - tutaj występują 3 rodzaje polimeraz:

1. polimeraza I prowadzi transkrypcje genów rRNA

2. polieraza II prowadzi transkrypcje genów snRNA i genów kodujących białka komórki. Dzięki niej powstaje mRNA

3. polieraza III prowadzi transkrypcje genów tRNA i niektórych genów snRNA

polimerazy RNA inicjuja transkrypcje przy udziale tzw. czynników transkrypcyjnych ( są to specyficzne białka, które mogą wiązać się z DNA). Czynniki transkrypcyjne często posiadają tzw. - palce cynkowe. Na każdym palcu znajduje się pozbawiony dwóch elektronów atom cynku Zn2+. Reszty fosforanowe DNA mają ujemny znak dlatego Zn chętnie interferuje i wchodzi do nici DNA. Niektóre czynniki transkrypcyjne nie łaczą się bezpośrednio z DNA ale z innymi czynnikami transkrypcyjnymi.

Geny są regulowane w bardziej złożony sposób występuje tu wiele sekwencji regulatorowych. U Eucaryota mogą być one położone daleko od promotora.

Etapy inicjacji transkrypcji:

• przyłączenie się czynnika transkrypcyjnego TFIID ( to wielobiałkowy kompleks w skład którego wchodzi białko TBP wiażace się z kaseta TATA wiele czynników towarzyszących TAF ) to tak zwane kastey TATA ( kaseta box) która znajduje się w obrębie promotora ( około 25 nukleotydów od początku pranskrypcji). „ TATA box” to sekwencja DNA występujących po sobie par nukleotydów TA. Obecność TBP jest niezbędna do inicjacji transkrypcji przez wszystkie trzy polimerazy RNA. Wiąże się z małym rowkiem DNA w rejonie kasety TATA rozplatając DNA i zginając o 45 stopni. Wiązanie TFIID z kasetą TATA jest ułatwione przez TFIIA który zapobiega blokowaniu aktywności TFII2 przez czynniki hamujące

• zmiany przestrzenne w DNA i przyłączenie kolejnego czynnika transkrypcyjnego TFIIB który wiążę się z TFII2 i działa jako pomost do wiązania polimerazy RNA

• przyłączenie polimerazy RNA ( związanej z TFIIF) do czynników TFII2 i TFIIB oraz kolejnych czynników transkrypcyjnych TFIIE, TFIIH, TFIIF. Tworzy się tak zwany kompleks inicjujący transkrypcje

• TFIIH z udziałem ATP fosforyluje C-końcową domene RNA polimerazy II. Reakcja ta powoduje utworzenie aktywnego kompleksu transkrypcyjnego. Polimeraza uwalnia od wiążących ją czynników transkrypcyjnych.

• Uwolniona polimeraza przyłącza do rozplecionej nici DNA nukleotydy ( U, A, G, C) rozpoczyna się transkrypcja z wytworzeniem nici pre-mRNA

Elongacja transkrypcji

Wydłużenie łańcucha RNA ( komplementarnego do matrycowej nici DNA ). Biorą w niej udział trifosfonukleotydy RNA ( posiadaja trzy reszty fosforanowe miedzy którymi znajdują się wysoko energetyczne wiązania - elongacja to duży wydatek energetyczny). Łańcuch RNA rośnie od końca 5' do 3' z prędkością 30 nukleotydów na sekundę

Czynniki elongacyjne dla polimerazy RNA II - białka które wiążą się z polimerazą po opuszczeniu przez nią promotora i przyłączeniu się czynników transkrypcyjnych.

Czynnik elongacyjny S2 - przeciwdziała pauzowaniu polimerazy RNAII, które może wystąpić wówczas kiedy enzym przeprowadza transkrypcje rejonu gdzie komplementarne zasady mogą łączyć się ze sobą w obrębie jednej nici ( np. powstawanie struktury spinki do włosów).

ELL ( elongina TFIIF) - zapobiega zatrzymaniu się polimerazy RNA i przedwczesnego uwalniania końca 3' transkryptu.

Terminacja translacji

Transkrypcja kończy się w ściśle określonym miejscu DNA zwanym terminatorem. Zachodzi oddysocjowanie polimerazy RNA od DNA.

Mechanizmy terminacji transkrypcji procaryota:

Polimeraza RNA odłączą się od łańcucha DNA po napotkaniu odpowiedniej sekwencji. Sekwencja ta jest bogata w zasady C i G co umożliwia jej tworzenie struktury - szpilki do włosów na nici RNA. Mechanizm zależy od pewnego białka zwanego czynnikiem uwalniającym. Białko to wiążę się z określoną sekwencją na DNA umożliwiając tym samym dalszą elongacje.

Mechanizmy terminacji transprypcji u Eucaryota :

Nie stwierdzono czynników uwalniających, inne są również sekwencje odpowiedzialne za zakończenie transkrypcji. Jednocześnie brak danych na temat terminacji nie pozwala na dokładną charakterystykę miejsc końca transkrypcji

DOJRZEWANIE mRNA

W wyniku transkrypcji powstaje pre-mRNA zawierające sekwencje kodujące ( eksony ) i nie kodujące (introny).

Dojrzewanie mRNA polega na wycinaniu intronów w syntezie tz. Kapu ( z ang. Cap) na końcu 5' i syntezie tak zwanego ogona poliA na końcu 3'. Kapu i poliA zapewniają transport RNA do cytoplazmy i chronią przed działaniem nukleazy, która tnie kwasy nukleinowe.

Obróbka pre-mRNA

1. dodanie ekstra guanozyny na końcu 5'

• czapeczka GTP reaguje z końcem 5' mRNA z wytworzeniem wiązania trifosforanowego.

• Końcowa zasada G podlega metylacji przy azocie numer 7( metylotransferaza guanizowa) czapeczka typ 0

• U wyższych eucaryota są jeszcze dwa typy czapeczek Kapu: czapeczka typu I ( metylacja wodoru w grupie 2'-OH drugiego nukleotydy) i czapeczka typu II ( metylacja wodoru w grupie 2'-OH trzeciego nukleotydu )

2. poliadenylacja

w tym procesie mają udział sekwencje sygnałowe 5' AAUAAA - 3' ( między 10 a 30 nukleotydem przez miejscem adenylacji)

• wiązanie czynników stymulacji cięcia CstF oraz czynnika specyficzności cięcia i poliadenylacji ( CPSF)

• łączenie polimerazy poliA z wyżej wymienionymi czynnikami i innymi czynnikami białkowymi.

Między elementami sekwencji sygnałowej ( AAU i AAA ) wywołany jest sygnał rozcięcia, którego dokonuje specyficzna endnukleaza. Następnie w rozcięte miejsce dodawany jest ogonek poliA ( łączenie adeniny pochodzącej z ATP)

3. Wycinianie intronów ( splicing)

Introny muszą mieć jakieś wspólne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z porównania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobienstwa : na 5' końcu zawierają zawsze kolejno resztę guaninową i uracylową ( 5'-GU) a na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona adeninową ( AG-3') : wewnątrz zawierają tak zwane miejsce rozgałęzienia w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy ( posiadającą w pozycji 2' grupę OH)

Spliceosom - to kompleks składający mRNA ( po wycięciu intronów trzeba połączyć ze sobą eksony)

Zbudowany jest z snRNA U1, U2, U4, U5 i U6.

U1 -U6 są to liczące 106-185 nukleotydów cząsteczki które wiążą się z czynnikami białkowymi tworząc małe jądrowe rybonukleoproteiny ( snRNP ) funkcją snRNP jest prawidłowe rozpoznanie miejsca splicingowego ( granica między intronem a eksonem ) w prekursorach jądrowego mRNA i katalizowanie precyzyjnego usunięcia intronów.

Przebieg splicingu

Do pre-mRNA zawierającego introny i eksony przyłącza się czynnik U1, czynnik ten przyłącza się na końcu 5' intronu zawierającego reszty guaninową i uracylową ( GU). Następnie tzw. miejsca rozgałęzienia przy reszcie adeninowej (A) z udziałem ATP wiążę się czynnik U2. Utworzenie takiego kompleksu powoduje zgięcie intronu i utworzenie z niego pętli tak że miejsce splicingu 5' łączy się z 3' ( GU na końcu 5' jest blisko na końcu 3').

Co tak przygotowanego intronu przyłączają się kolejne czynniki U5 i U4 i powiązane z U6 tworzy się spliceosom a następnie rearanżacja oddziaływań RNA. W wyniku podwójnej transestryfikacji oba końce splicingowe łączą się ze sobą, a intron zostaje wycięty. Kompleks splisingowy odciąga intron od złączonuch eksonów które się prostują. spliseosom uwalnia intron w postaci lassa i rozpada się znów na pojedyncze czynniki. Intron ulega rozłożeniu a czynniki splisingowe są gotowe do ponownego wycinania intronu.

Transesryfikacja

1. rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' ( tj. na 5' końcu intronu - następuje uwolnienie końca 5' fosforanowego egzonu

• cięcia między nukleotydami zachodzą na łączących je resztach grup fosforanowych

• grupa 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozgałęzienia ) atakuje grupę fosforanową nokleotudu guaninowego na końcu 5' intronu. Między nukleotydami adeninowymi z miejsca roagałęzienia i guaninowymi z końca 5' powstaje wiązanie fosfodiesrtowe. Nukleotyd adeninowy ( z miejsca rozgałęzienia ) mając grupę 3'-oh wykorzystaną w „normalnym” wiązaniu fosfodiestrowym do interakcji z resztą fosforanową 5' intronu aranżuje grupę 2'-OH. Tworzy się tu wiązanie 2'-5'fosfodiestrowe. Ekson odłącza się od końca 5' intronu i posiada na swoim końcu 3' ( połączonym wcześniej z końcem 5' intronu ) wolną grupę 3'-OH, która jest ustawiona do wiązania fosforanowego między intronem a egzonem w miejscu splicingowym końca 3' ( koniec 3' intronu jest połączony resztą fosforanową z końcem 5' eksonu )

• atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu na 5' grupę fosforanową egoznu. Oba egzony łączą się ze sobą wiązaniem 3'-5' fosfodiestrowym. Intron uwalniany jest w postaci lassa, gdzie jego koniec 5' związany jest z końcem 2'-5'fosfodiesrtowym z miejscem rozgałęzienia. Od miejsca rozgałęzienia odchodzi koniec 3' intronu w wolną grupą 3'-OH na końcu łańcucha.

Splicing autokatalityczny RNA : odbywa się w dwóch etapach, przez dwie kolejne reakcje transestryfikacji. Mechanizmy splicingu przebiegającego w intronach grupy I i II różnią się, gdyż w intonach grupy I splicing rozpoczyna się związaniem do sekwencji intronowej guanozyny lub GTP, które są kofaktorami tej reakcji, a w jej wyniku uwalnia się intron w formie liniowej. Natomiast w splicingu intronów grupy II następuje utworzenie przejściowego związku kształtu lassa. Introny tej grupy nie potrzebują do splicingu kofaktorów gdyż zawierają szczególnie reaktywną resztę adenylanową

4. Redagowanie RNA

To szczególny rodzaj dojrzewania mRNA - modyfikacje chemiczne stwarzają możliwość zmiany właściwości kodujących transkryptu, prowadząc w efekcie do odpowiedniej zmiany sekwencji aminokwasowej zakodowanego białka. Redagowanie RNA występuje u wielu różnych organizmów i obejmuje różnorakie zmiany nekleotydowe. Przykładem jest redagowanie mRNA ludzkiej apolipoproteiny B, która w komórkach wątroby jest polipeptydem złożonym z 4563 aminokwasów, z po zredagowaniu już w komórkach jelita z 2153 aminkowasów.

TRANSLACJA - DRUGI ETAP REGULACJI GENÓW

Proces w którym następuje odczyt informacji genetycznej z mRNA i synteza białka. Biorą w nim udział oprócz martycy mRNA i aminokwasów także : dostarczające aminokwasy cząsteczki tRNA, rybosomy oraz szereg czynników wspomagających. Przetranspotrowany do cytoplazmy mRNA może ulec translacji, bądź zostać szybko zdegradowany, jeśli białko które koduje mRNA występuje w komórce w dostatecznej ilości.

RYBOSOMY

Translacja i synteza białka zachodzi w rybosomach. Rybosomy w cytoplazmie mogą występować w formie wolnej translacja białek cytosolowych lub związanej ( translacja białek eksportowanych do wnętrza retikulum i na zewnątrz komórki ). Obydwa rodzaje rybosomów zbudowane są z dwóch podjednostek : małej, której stała sedymentacji wynosi 40S i dużej o współczynniku sedymentacji równym 60S (cały rybosom ma współczynnik sedymentacji 80S ). Podjednostki składają się z rybosomalnego RNA ( 18S rRNA mała podjednostka ; 5S, 5,8S i 28S rRNA duża podjednostka ) oraz kilkudziesięciu białek, których skład różni się między obydwiema „częściami” rybosomu ( mała podjednostka zawiera 33 białka, a mała duża 48 białek ). W obrębie rybosomu wyróżnia się trzy istotne miejsca: E ( exit - tedy wychodzi „zużyty” tRNA ) , A ( aminokwasowe, wiązane tRNA niosącego aminokwas ) i P ( peptydowe, wiążące tRNA związany z syntetyzowanym peptydem ). Podjednostki rybosomalne wiążą się ze sobą tylko podczas translacji, kiedy nie syntetyzują białek są w postaci wolnej.

Rybosomy procaryota zbudowane są nieco inaczej.Współczynnik sedymentacji rybosomu wynosi 70S i składa się z podjednostki małej 30S i dużej 50S. Mała podjednostka zbudowana jest z 16S rRNA i 21 białek, a duża 5S, 23S rRNA i 34 białek.

Translacja mRNA zachodzi w kierunku 5'-3', zatem pierwszy aminokwas syntetyzowanego polipetydu zakodowany jest przez kodon leżący bliżej 5' końca transkryptu. Natomiast najwcześniej wbudowanymi aminokwasami powstającego białka są te, które stanowią jego N-terminalną część. Wynika to z mechanizmu tworzenia wiązań peptydowych między sąsiadującymi aminokwasami.

Translację podzielić można na trzy zasadnicze etapy: inicjacje, elongację, terminację

INICJACJA

1. przyłączenie mRNA do mniejszej podjednostki rybosomu (40S) w obecności inicjatorowego tRNAi szeregu czynników inicjujących ( u eukariotnów pierwszym kodonem ulegającym translacji jest kodon AUG - tzw. kodon START, kodujący metioninę ). W poszukiwaniu pierwszego tj. inicjacyjnego kodonu metioninowego biorą udział czynniki zwane elF3 i elF4, z których pierwszy przyłącza do struktury czapeczki kompleks białkowy tzw. CBP oraz odszukuje AUG, natomiast drugi -elF4 dostarcza energii do poszukiwań

2. zanim jednak rybosom ze związanym białkiem elF3 zacznie kroczyć po mRNA w poszukiwaniu AUG, do podjednostki 40S związany zostaje inicjatorowy amino-tRNA tj. tRNA niosący cząsteczkę aminokwasu - tu metioniny. Gdy przesuwająca się po mRNA podjednostka 40S ze związanym Met-tRNA natrafi na kodon „start” następuje przyłączenie większej podjednostki rybosomu ( 60S ). Związanie aminoacylo-tRNA jest możliwe dzięki obecności kompleksu elF1-GTP, tez wiąże się z aminoacylo-tRNA i tworzy kompleks, który rozpada się po związaniu tRNA w miejsce A rybosomu. Połączenie możliwe jest dzięki rozpadowie ( defosforylacji ) GTP związanego w kompleksie ( powstaje elF1-GTP, który szybko się rozpada, a wole ElF1 znów wiąże się z GTP )

Nazwa czynnika	Funkcje czynnika
ElF1	Przyłączenie do podjednostki 40S inicjacyjnego aminoacylo-tRNA
ElF3	Udział w przyłączaniu do końca 5' końca mRNA białek CBP; odszukanie kodonu inicjacyjnego; uniemożliwienie asocjacji podjednostek rybosomowych pod nieobecność innych czynników inicjacyjnych
ElF4	Dostarczanie energii niezbędnej w działaniu elF3 z hydrolizy ATP
ElF5	Indukcja uwolnienia elF2 i elF3 kosztem energii z hydrolizy GTP ( związane z elF2)

Po złożeniu rybosomu, tj. przyłączeniu podjednostki 60S do powstałego układu, przez odpowiednie tRNA dostarczane są kolejne aminokwasy. Rybosom przesuwa się stopniowo ( co trójkę nukleotydów ) wzdłuż nici mRNA, do której na zasadzie komplementarności dopasowują się cząsteczki aminoacylo-tRNA. Dopasowanie to dotyczy obszaru antykodonu tj. trójki nukleotydów ( z tRNA) „pasujących” do kodonu mRNA. I tak z kodonem CAC oddziaływać będzie tRNA zawierający antykodon GUG i niosący histydynę. W mijescu A znajduję się pierwszy tRNA komplementarny do kodonu startowego i zawierający mietioninę. Rybosom przesuwa się o trójkę nukleotydów i met-tRNA znajduję się teraz w miejscu P rybosomu, a do miejsca A wiązany jest kolejny aminoacylo-tRNA niosący jakiś aminkowkas np. histydyna. Do histydyny przyłącza się metionina z aminoacylo-tRNA znajdującego się w miejscu P ( jest to transpeptydacja ). Aminokwasy wytwarzają między sobą wiązanie peptydowe. Po wywtoerzniu wiązania wolny od aminokwasów tRNA z miejsca P jest usuwany w procesie translokacji - kompleks elF2- GTP „wyciąga” tRNA z miejsca P, następuje defosforylacja TP i rozpad kompleksu elF2-GDP. Ostatecznym produktem translokacji jest wolny tRNA, GDP i P i elF2, które zaczyna tworzyć kompleks z kolejnym GTP. Rybosom przesuwa się o kolejną tróję nukleotydów, tRNA wiążący dipeptyd met-his znajduje się teraz w miejscu P,a miejsce A oczekuje na kolejny tRNA niosący aminkowas.

Do kolejnego aminokwasu dostarczonego w miejsce A rybosomu przez aminoacylo-tRNA przyłącza się za pośrednictwem grupy karboksylowej wcześniej odczytany aminokwas występujący w danym momencie ( jeszcze w postaci związanej z tRNA) w miejscu P rybosomu tnz. Jeśli pierwszym kodonem jest AUG, drugim CAC, a trzecim UUU będziemy mieli do czynienia z następującymi zmianami na terenie rybosomu :

1. do dostarczonej jako drugiej w kolejności histydyny przyłącza się inicjacyjna metionina. Na tRNA histydynowym ( w miejscu A ) tworzy się dipeptyd met-his i rybosom przesuwa się o trójkę, tRNA jest teraz w miejscu P

2. do przyłaczonej jako trzeciej fenyloalaniny grupą karboksylową przyłączy się dipeptyd met-his i powstanie trójpeptyd met-his-phe, przemieszczany jak poprzednio w miejsce P

ELONGACJA

Dołączanie kolejnych aminokwasów do powstającego polipeptydu w rybosomie. Polipeptyd się wydłuża aż do wystąpienia na mRNA tzw. kodonów: STOP kończących translację.

TERMINACJA

Translacja kończona jest w miejscu, w którym wystąpi jeden spośród trzech kodonów terminacyjnych tzw. kodonów „stop” ( UAG, UGA, UAA).Wymienione trójki nokleotydowe rozpoznawane są w odróżnieniu do całej reszty nie przez aminoacylo-tRNA, a przez tzw. czynnik uwalniający eRF. Czynnik ten aktywuje enzym rozcinający wiązanie między polipeptydem a cząsteczką tRNA, która dostarczyła ostatniego aminokwasu, czego skutkiem jest uwolnienie łańcucha polipeptydowego. Zdarzenie to jest uwieńczeniem szeregu procesów, jakie obejmuje ekspresja informacji genetycznej.

KIEROWANIE BIAŁEK

• mechanizm translokacyjny ( translokon) jest oligometryczną strukturą złożoną z błonowych białek integralnych i peryferycznych

• bramkowanie kanałów przewodzących białka przez peptydy sygnałowe sprawia, że kanały otwierają się tylko wtedy, gdy rosnące białka są gotowe do translokacji

• translokacja jest kierowana przez sekwencje sygnałowe i sekwencje zatrzymania translokacji.

• Optymalnymi substratami dla translokacji poprzez błonę ER są rozfałdowane łańcuchy polipeptydowe

modyfikacja	Modyfikacja aminokwasowa	Przykładowe białko
Acetylacja	Lizyna	Histony
Metylacja	Lizyna	Histony
Fosforylacja	Seryna	Białka sygnałowe
Hydroksylacja	Prolina, lizyna	Kolagen
N- formalacja	N-końcowa dlicyna	Melityna
Glikozylacja O	Seryna, treonina	Białka wydzielania i błonowe
Glikozylacja N	Asparagina	Białka wydzielania i błonowe
Acylacja	Seryna, treonina, cysteina	Białka błonowe
N- mirystylacja	N-końcowa glicyna	Niektóre kinazy

WYKŁAD 3

BADANIE CZASTECZKI DNA ( poznawanie genów )

Nowe strategie ekperymentalne - ( rekombinacyjna technologia DNA - inżynieria genetyczna ) zawdzięcza się dostępność enzymów rozcinających DNA ( łączących jego fragmenty, katalizujących jego replikacje i odwrotną transkrypcje RNA) oraz technologii tworzenia par przez zasady - rozpoznawanie się fragmentów kwasów nukleinowych. Jednakże problemem było wyodrębnienie poszczególnych genów z chromosomu, a jego rozwiązaniem odkrycie klasy enzymów bakteryjnych - endonukleaz resrtykcyjnych

EZNYMY RESRTYKCYJNE ( RESRTYKTAZY)

W latach 50-tych zaobserwowano, ze niektóre szczepy bakteryjne są odporne na zakażenia bakteriofagami. W 1962r Arber i Dusoix opracowali model resrtykcji i metylacji, który przedstawił zasady działania resrtyktaz.

1. istnienie w komórkach bakteryjnych 2 enzymów : restryktaz i metylaz, które rozpoznają te same sekwencje

2. resrtyktaza przecina DNA w obrębie rozpoznawanej sekwencji, natomiast metylaza modyfikuje te sekwencje, w taki sposób, że stają się one niedostępne dla restryktaz

3. Obcy DNA ( niezmodyfikowany ) jest atakowany i niszczony przez enzymy restrykcyjne, podczas gdy DNA gospodarza jest chroniony

Fragmentacja DNA może się odbywać na różny sposób np. stosując ultradźwięki rozbijamy DNA w sposób chaotyczny na odcinki krótsze. Stosując resrtyktazy można ciąć DNA w określonych miejscach.

CHARAKTERYSTYKA ENDONUKLEAZ RESTRYKCYJNYCH

Restryktazy można podzielić na klasy w zależności od mechanizmu działania, substratów, produktów i kofaktorów.

KLASA I - restryktazy o aktywności nukleaz, ich kofaktor to ATP, Mg2+ i S- adenozylometionina. Rozpoznają specyficzne sekwencje DNA, ale przecina DNA nie specyficznie w pewnej odległosci od rozpoznawanej sekwencji. Przykładowy enzym to EcoAIEcoBIStySBI

KLASA II - rozpoznają sekwencje palindromową w dwuniciowym DNA i przecinają cząsteczkę w jej obrębie lub określonej odległości od niej. Odległość sekwencji rozpoznawanej od sekwencji przecinanej jest dla danego enzymu stała i wynosi średnio 25 nukleotydów. Kofaktorem jest Mg2+, S-adeozulometionina nie jest wymagana, ale zwiększa aktywność enzymów tej klasy. Np. EcoRIHindIIIKpnIMboIIFokl.

KLASA III - kofaktorami są Mg2+ i ATP, rozpoznają sekwencje złożone z 4-6 nukleotydów i charakteryzuje się dwustronną symetrią ( sekwencje palindromowe ). Przecinają DNA w miejscach znajdujących się naprzeciwko siebie ( tepe końce )lub w dwóch różnych miejscach ( lepkie końce ). DNA w takich miejscach znajduje się w odległości kilku do kilkunastu nukleotydów od rozpoznawanej sekwencji. Np. EcoPIHinfIII

1. tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie, wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu.

2. Lepkie końce - 3' lub 5' ssDNA ( jednoniciowe ) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie, komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA, co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł. Na jednym końcu ( dłuższym ) jest odcinek ssDNA komplementarny do odpowiedniego odcinka na długim końcu DNA drugiej nici.

Sekwencje palindromowe - sekwencje w których obie nici odczytywane zgodnie z polarnością cząsteczki w przeciwnych kierunkach ( od końca 5' do 3' ) mają taką samą sekwencje np.: 5'GGCC3' lub 5'GGATCC3'

3'CCGG3' 3'CCTAGG5'

enzymy resrtykcyjne i sekwencje przez nie rozpoznawane

Organizm	Nazwa enzymu	Sekwencja rozpoznawana	Uwagi
Haemophilus agsgytius	HaeIII	5'...GG CC...3' 3'...CC GG...5'	Powstają tępe końce
Thermus aquaticus	TaqI	5'...T CGA...3' 3'...AGC T...5'	5' jest lepkim końcem
Haemophilus haemolyticos	HhaI	5'... GCG C...3' 3'... C GCG...5'	3' jest lepkim końcem
Desylfovibrio desulfuricans	DdeI	5' ... C TNAG...3' 3' ... GANT C...5'	Gdzie N jest dowolną puryną lub pirymidyną
Moraxxela bovis	MboII	5'...GAAGA(N)3 ...3' 3'...CTTCT (N)7 ...5'	Enzym tnie poza sekwencją rozpoznawaną
Escherichia coli	EcoRV EcoRI	5'...GAT ATG...3' 3'...CGA TAG...5' 5'...G AATTC...3' 3'...CTTAA G ...5'	Powstają tępe końce 5' jest lepkim końcem
Providencia stuarti	PsfI	5'...CTGCA G...3' 3'...GA CGTC...5'	3' jest lepkim końcem
Microcoleus	MsfII	5'... GC TNAGC...3' 3'... GGANT CC ...5'	Gdzie N jest dowolną puryną lub pirymidyną
Nocardia otitidis-cavarium	NotI	5'... GC GGCCGC...3' 3'... CGCCGG CG...5'	Rzadko tnący enzym rozpoznający 8-nukleotydową sekwencje

Resrtyktazy naturalnie występują u bakterii jako system resrtykcji modyfikacji ( coś jak MHC u ssaków ) - bakteria modyfikuje kilka nukleotydów swojego DNA, tworząc charakterystyczny wzór znakowania. Obce DNA jest rozpoznawane i niszczone z użyciem resrtyktaz. Po podziale komórkowym bakteria ma zreplikowane DNA złożone z nici macierzystej (znakowanej ) i nowej ( nie znakowanej ), dzięki czemu nić nie jest cięta przez restryktazy. Po pewnym czasie i nowa nić jest znakowana

NAZEWNICTWO ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH

Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii z której wyizolowano enzym, dwie następne to określają gatunek. Następnie jest skrót od nazwy serotypu i numer enzymu otrzymanego z danego gatunku bakterii np. Eco RI - enzym z escherichia coli o serotypie R

Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej :

1. czwórkowe - rozpoznają sekwencje DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki

2. szóstkowe - rozpoznają sekwencje DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce resrtykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA, w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie

3. ósemkowe - stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko

IZOSCHIZOMERY - enzymy rozpoznające tę samą sekwencje, mogą przecinać ją w ten sam sposób lub inny np. Acc65I, Asp718I i KpnI są izoschizomerami, ale dwa przecinają w ten sam sposób : 5'G/GTACC3', a trzeci inaczej. Dwa enzymy mogą rozpoznawać różne sekwencje, ale generować takie same końce np. eco47I 5'G/GTCC3' i CpoI 5'C/GTCCG3'. Rozpoznawana sekwencja zazwyczaj nie może znajdować się na samym końcu cząsteczki.

ZASTOSOWANIE ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH

• sporządzanie fizycznych map genomów wirusowych, mitochondrialnych czy bakteryjnych ( fizyczne mapowanie polega na ustaleniu liczby i wielkości fragmentów DNA uzyskiwanych w wyniku działania enzymami restrykcyjnymi, a następnie odtworzenie kolejności ich ułożenia w całej cząsteczce DNA) - powstaje mapa ujawniająca rozmieszczenie poszczególnych miejsc restrykcyjnychi czyli jest to mapa restrykcyjna

• izolacja i identyfikacja genów

• sekwencjonowanie DNA

• porównywanie DNA z różnych organizmów

• rekombinowanie i klonowanie określonych genów lub fragmentów genomu

• diagnostyka chorób infekcyjnych

• w transplantologii do ustalenia zgodności tkankowej

• w medycynie sądowej do ustalenia pokrewieństwa

• diagnostyka chorób genetycznych i niektórych typów chorób nowotworowych

RFLP ( polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych ) - badanie dziedziczenia wybranych genów czyli różnorodności genetycznej w populacji ( polimorfizmu ); mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych zmieniają długość fragmentów restrykcyjnych i ich położenie elektroforetyczne - wykrywanie np. mukowiscydozy, anemii sierpowatej, fenyloketomurii i innych chorób genetycznych. Wykrywanie sprzężeń genetycznych wybranych obszarów genomu. Zdarza się, że z genomu coś wypadnie a sklonowana sonda wiążąc się do tego regionu daje różne wzory. Restryktazy przecinają miejsca w DNA które rozpoznają i nie przecinają miejsc zmutowanych, co pozwala nam szybko określić połozenie zmutowanego genu, gdyż RFLP leży blisko genomu.

Fragmenty DNA po cięciu restryktazami można rozdzielić metodą elektroforetyczną i wybarwić bromkiem etydyny lub przeznaczyć do autoradiografii. Pocięte fragmenty mogą posłużyć do identyfikacji określonej sekwencji we fragmencie resrtykcyjnym DMA metodą hybrydyzacji z sondą ( metoda Southera i inne )

CLONNING

Klonowanie - to proces tworzenia wielu identycznych kopii. Polega na izolowaniu szczególnego odcinka DNA ( genu ) i oddzielenie go od reszty komórkowego DNA, a następnie umieszczenia go w bibliotece genomowej i cDNA.

Dna jest wstawiane do wektora za pomocą enzymów restrykcyjnych które tną DNA plazmidu w odpowiednich miejscach, a następnie z udziałem ligaz odtwarza się wiązania między DNA, tego wprowadzanego w wektorowy. Wektor zamieszcza się w komórce bakterii w obecności chlorku wapnia i przeprowadza się hodowlę tych bakterii na pożywce selekcyjnej np. zawierającej antybiotyki. Komórki które nie pobrały plazmidu nie rosną na tej pożywce. Rosną stransformowane komórki które się namnażają tworząc kolonie, które zawierają zrekombinowany plazmid. Wprowadzany gen w wyniku ekspresji może zacząć produkować interesujące nas białko.

WEKTOR - ( łac. Przenośnik ) - czynniki pozwalające na wprowadzenie DNA do komórki bakteryjnej lub eukariotycznej, tak aby utrzymały się w komórce i uległy namnożeniu. Wektorem może być cząsteczka DNA, które posiada zdolność autonomicznej replikacji w danym typie komórek.

1. zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie, a czasami także wydajną syntezę kodowanego przez gen białka ( w tzw. wektorach ekspresyjnych )

2. typy wektorów zależą od tego w jakich komórkach zamierzamy klonować gen

3. najważniejszym elementem warunkującym specyficzność wektora są sekwencje ori odpowiedzialne za inicjację replikacji

4. najprostsze wektory posiadają wyłącznie jedno, unikalne miejsce restykcyjne, w które można by wprowadzić obcy DNA; obecnie najczęściej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA, w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych przez różne restryktazy.

5. Wektory zazwyczaj posiadają geny markerowe czyli geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany, aby istniała możliwość selekcji tych komórek, do których wniknął.

6. Konstrukcja nowych cząsteczek DNA ( kombinacje naturalnie występujących fragmentów DNA)

7. Możliwość badania białek występujących w niewielkich ilościach w komórce

8. Maksymalna wielkość DNA, który może byś sklonowany w wektorach: plazmid do 10 kb, bakteriofag 9-25, kosmid 35-45 kb i YAC - 500kb.

WEKTORY EKSPRESYJNE:

Zawierają odpowiednio usytuowany silny promotor umożliwiający ekspresje na wysokim poziomie białka, którego gen znajduje się na tym wektorze

1. plazmidowe wektory ekspresyjne zawierające silne, regulowane promotor. Taki silny, regulowany promotor powoduje że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę np. promotor laktozowy. Transkrypcje wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG ( analog laktozy )

2. plazmidowe wektory ekspresyjne zawierające promotor późnych białek faga T7. Promotor genu RNA polimerazy faga T7 to specyficzne sekwencja 23 bp, składająca się z dwóch elementów. W zrakombinowanych komórkach E.coli, zawierających gen kodujący T7 RNA polimerazę wstawieny za promotorem laktozowym zachodzi synteza dużej ilości RNA polimerazy, gdy do pożywki dodane jest IPTG . komórki te są transformowane wektorem plazmidowym, który niesie kopię promotora T7 i cDNA genu kodującego wybrane białko. RNA polimerazy wiąże się z promotorem T7 na wektorze plazmidowym co katalizuje transkrypcje wstawionego cDNA

3. eukariotyczne systemy ekspresyjne. Jest to szczególnie istotne gdy chcemy otrzymać aktywne białko, w którym prawidłowo zostały przeprowadzone modyfikacje potranslacyjne

Komórki procaryotyczne nie zapewniają takich modyfikacji RNA i białek zapisanych w genach, jak eucaryotyczne ( mogą powstać białka o niewłaściwej strukturze i niezdolne do pełnienia swoich funkcji ).

Im większe pokrewieństwo między organizmem z którego DNA pochodzi a organizmem dającym wektor tym większa szansa, że produkt będzie taki sam jak w organizmie wyjściowym.

Białko - oznaczenie sekwencji aminokwasowej - synteza sondy DNA - przeszukiwanie biblioteki genomowej lub cDNA - gen - insercja do wektora ekspresyjnego - wprowadzenie do komórki E.coli lub komórek innego gospodarza - białko

BIBILOTEKI DNA

Bank ( inaczej biblioteka ) DNA - to zespół fragmentów DNA danego organizmu połączonych z cząsteczkami wektorów. Bibliotekę można poddać screeningowi czyli przeszukaniu przy pomocy różnych metod w zależności od tego czym dysponujemy i czego szukamy. Dobrze skonstruowany bank genów to taki, w którym każda sekwencja genomowego DNA ma swoją reprezentacje w postaci klonu.

Biblioteka genomowa - izolacja cząsteczek DNA z tkanki i łączenie ich z wektorami

Biblioteka cDNA - izolacja RNA z tkanki i oddzielnie z całości uzyskanego materiału mRNA, następnie z użyciem odpowiedniej transkryptazy syntetyzuję się z cDNA który łączony jest z wektorem.

Cecha	Biblioteka genomowa	Biblioteka cDNA
Materiał wyjściowy	DNA	RNA
Stopień trudności wykonania	Niższy	Wyższy
Biblioteka obejmuje	Całość DNA	Odcinki cDNA odpowiadające mRNA obecnych w tkance w chwili izolacji
W wektorach znajdują się i są dostępne do badań	Geny ( z odcinkami nie kodującymi) fragmenty genów i inne	Odcinki kodujące poszczególne geny
Reprezentacja poszczególnych fragmentów	Równomierna	Nierównomierna
Przydatność do stosowania w wektorach ekspresyjnych	Niewielka	Wysoka

Biblioteki genomowe - fragmentacji poddawany jest cały DNA danego organizmu, łączy się go z cząstkami wektora.

1. po transformacji komórek gospodarza banku w każdej z nich znajduje się jeden wektor. Potomstwo komórki wyjściowej będzię zawierało ten sam fragment czyli zostanie on namnożony.

2. Biblioteka reprezentuje cały DNA organizmu zarówno kodujący ( geny, egzony genów ) jak i nie kodujący ( introny ) a także sekwencje regulatorowe, ruchome i inne o nieznacznym znaczeniu.

Zalety i wady:

Jeżeli dobrze przygotujemy taką biblitekę mamy bardzo duże szanse na znalezienie interesującego nas genu lecz może on zostać przecięty przez restryktazy. Gdy szukanym przez nas odcinkiem DNA nie jest gen ale np. promotor enhancer czy inna sekwencja regulacyjna biblioteka genomowa jest niezastąpiona

Biblioteki cDNA - z komórek izoluje się mRNA a następnie przy użycie odwrotnej transkryptazy przepisuję się mRNA na DNA tworząc cDNA.

Wady:

Biblioteka tych genów, które są w danym momencie i w danej tkance aktywne transkrypcyjnie, dlatego należy dobrze przemyśleć wybór tkanki i czas izolacji, problemu nie ma gdy poszukiwany gen jest genem podstawowym i we wszystkich tkankach ulega ekspresji. Reprezentacja w różnych ilościach kopii różnych odcinków cDNA ponieważ nie we wszystkich komórkach transkrypty danego genu będą występować tak samo licznie.

Zalety:

Pewność, że każda cząsteczka cDNA zawiera informacje genetyczną odpowiadającą dokładnie jednemu genowi czyli każdy klon to jeden gen - brak intronów co można wykorzystać kiedy chcemy produkować dane białko w komórkach bakterii, która normalnie nie przeprowadza splicingu

Gdy zależy nam na wyodrębnieniu pojedynczego, konkretnego genu jakiegoś organizmu to po utworzeniu banku genów tego organizmu i stransformowaniu nim odpowiednich komórek gospodarza należy zidentyfikować klon komórek, w którym znajduje się ten gen.

Przeglądanie bibliotek:

To nic innego jak szukanie igły w stogu siana czyli szukanie określonego fragmentu DNA w mieszaninie miliona podobnych

METODY HYBRYDYZACYJNE

Metody hybrydyzacyjne stosuje się w przypadku dysponowanie sondą molekularną Dnową lub Rnową homologiczną do poszukiwanej sekwencji w różnym stopniu ( niekoniecznie w 100%). Nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja sklonowanego genu w komórkach gospodarza.

Hybrydyzacja - to powstanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydów. Specyficzność hybrydyzacji zależy od sekwencji i składu nukleotydów, siły jonowej stosowanych buforów oraz temperatury. Operując tymi parametrami możemy uzyskać hybrydyzacje cząsteczek, których homologia nie przekracza 50%

Sondy - fragment DNA, cDNA lub RNA poszukiwanego przez nas genu sklonowanego wcześniej z innego gatunku dość blisko spokrewnionego. W tym celu wybieramy region ewolucyjnie konserwowany w DNA danego genu ( czasami nawet dość odległych ewolucyjnie gatunków ). Warunki hybrydyzacji muszą być odpowiednio dobrane. Syntetyczne oligonukleotyd o sekwencji komplementarnej do odcinka DNA kodująceog fragment białka jeśli znana jest sekwencja aminokwasowa tego białka. W praktyce oznacza to zsyntetyzowanie całej rodziny takich oligonukleotydów z powodu zdegenerowania kodu genetycznego, z których tylko cześć będzie idealnie komplementarna do poszukiwanej sekwencji.

Sondy związane z DNA/RNA można wykrywać poprzez znakowanie różnymi metodami:

1. radioaktywnie - do sondy jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem. Detekcja opiera się na autoradigrafii przy zastosowaniu filmów wrażliwych na promieniowanie

2. nieradioatywnie - np. metodami fluorescencyjnymi ( rodamina, kumaryna, czy fluoresceina )

3. immunochemicznie - cytochemicznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem ( biotyną, digcksyeniną, fluoresceiną ). Detekcja odbywa się przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenu. Przeciwciała są sprzężone z umożliwiającymi ich uwidocznienie cząsteczkami : alkaiczną fosfatazą, peroksydazą, barwnikami fluorescencyjnymi czy koloidalnym złotem.

4. Enzymatycznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z cząsteczką enzymu. Detekcja opiera się na reakcji barwnej katalizowanej przez enzym markerowy.

1. Hybrydyzacja typu Southerna ( DNA-DNA )- analizowany obiekt: to DNA ( np. genomoey DNA) po pocięciu enzymem restrykcyjnym, a używana sonda to radioaktywnie wyznakowane DNA o sekwencji komplementarnej do analizowanego DNA. Fragmenty otrzymane po cięciu restryktazami umieszcza się w żelu agarozowym i przeprowadza się ich elektroforetyczny rozdział. Otrzymujemy paski różnych długości z których każdy zawiera pewną ilość kopii cząsteczek DNA o określonej długości. Większe fragmenty lokalizują się bliżej katody a mniejsze bliżej anody. Po wypłukaniu żelu w roztworze, który równocześnie wywołał miejscową denaturacje DNA, fragmenty przenosimy Na filtr nitrocelulozowy. Następnie przeprowadzamy hybrydyzacje zdenaturowanych fragmentów DNA z sondą DNA lub RNA znakowaną radioaktywnie. Sonda zawiera sekwencje komplementarne z badanym DNA i łączy się z nim. Tak przygotowany filtr nakłada się na błonę fotograficzną i umieszcza w aparacie Rentgena. Na kliszy wywołane zostają ciemne elementy, które odpowiadają odcinkom DNA zawierającym sekwencje komplementarne do sekwencji sondy.

2. Hybrydyzacja typu Northern (RNA-DNA) - analizowany obiekt to RNA, a sonda to wyznakowany radioaktywnie DNA lub RNA o sekwencji komplementarnej do analizowanego RNA. Northern jest standardową techniką stosowaną do identyfikacji oraz określenia wielkości analizowanych transkryptów RNA. Najistotniejsze różnice odróżniające Northern od Southern to elektroforeza w warunkach denaturujących strukturę drugorzędową RNA, brak etapu denaturacji RNA za pomocą NaOH oraz powszechne stosowanie formamidu w buforach do hybrydyzacji.

Autoradigrafia - jeśli sonda jest radioaktywna to można wykryć promieniowanie radioaktywne ponieważ naświetla ono kliszę rentgenowską. Taki film naświetlamy przykładając do niego ( w ciemności) filtr po hybrydyzacji. Najczęściej naświetla się go od kilku minut do kilku tygodni. Po wywołaniu miejsca nie naświetlone są przeźroczyste a w miejscach w których promieniowanie z radioaktywnych punktów na filtrze naświetliło film zaobserwujemy ciemne plamy, których intensywność będzie proporcjonalna do ilości wiążącego sondę RNA

3. hybrydyzacja kolonijna - po transformacji komórek bakteryjnych bankiem plazmidowym. Po wysianiu na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr. Wykonuje się szereg czynności, które mają na celu przytwierdzenie bakterii, ich lize i denaturacje in situ a następnie poddaje się hybrydyzacji i autoradiografii. Dzięki zachowaniu szlaki wzorcowej jesteśmy w stanie określić dokładnie kolonię, w której znajduje się hybrydyzujący

4. hybrydyzacja łysinkowa - po transformacji komórek bakteryjnych bankiem fagowym i wysianiu ich na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr. Przytwierdza się przeniesione fagi do filtru i hybrydyzuje z sondą i poddaje autoradiografii. Także w tym przypadku dzięki szalce wzorcowej jesteśmy w stanie zidentyfikować łysinki, których pozycje odpowiadają zaczerwienieniom na kliszy.

Proces ten przebiega następująco : na pożywce w szalce Petriego wyhodowano baterie E.coli, które potraktowano bakteriofagami. W wyniku działalności fagów na powierzchni pożywki zaczęły się formować łysinki. Umieszcza się filtr celulozowy na szlace w celu przeniesienia fagów z każdej z łysinek..Filtr inkubuję się w alkaicznym roztworze, aby dokonać lizy fagów i denaturacji uwolnionego w ten sposób DNA. Jednoniciowy DNA faga przyczepia się do filtru i przeprowadza hybrydyzacje z sondą znakowaną radioaktywnie. Sygnał pojawia się w tmy miejscu w którym zachodzi komplementacja DNA faga do sondy.

5. hybrydyzacja fluorescencyjna in situ - FISH ( fluorescent in situ hybridization ) - lokalizacja sekwencji kwasu nukleinowego ( DNA,RNA) w komórce różnych tkanek z sondą ze znacznikiem fluorescencyjnym. Można lokalizować sekwencje genów w odpowiednim regionie chromosomu.

1. znakowanie sond znacznikiem fluorescencyjnym lub izotopowym

2. hybrydyzacja znakowanych sond z całymi chromosomami uprzednio umieszczonymi w roztworze o wysokim pH w celu oddzielenia od siebie komplementarnych nici

3. wiązanie sondy z określonym regionem chromosomu

4. uwidocznienie hybrydyzacji

hybrydyzacja umożliwia także identyfikacje genów nawet odlegle spokrewnionych. Można opisać przebieg ewolucji nowych genów poprzez duplikacje genów wcześniej istniejących i kombinacyjne wykorzystanie fragmentów starych genów.

Rodziny genów - to znana sekwencja jednego genu, gen ten posłuży jako sonda dla innych genów z tej rodziny np. wykorzystanie genu z jednego gatunku ( np. myszy ) jako sondy do izolacji genów innego gatunku ( np. człowieka )

6. „CHIP” DNA - przeprowadzanie jednocześnie wielu eksperymentów hybrydyzacyjnych.

1. krzemową płytkę poddaje się działaniu światła ultrafioletowego

2. zastosowanie przesłony UV - promieniowanie UV dociera tylko do wybranych miejsc na chipie i aktywuje je

3. przyłączenie do płytki nukleotydów

4. wiązanie nukleotydów tylko z miejscami chipa wcześniej pobudzonymi przez światło

5. kilka cykli naświetlania i dołączania nowych nukleotydów prowadzi do powstania na chipie dużej ilości różnorodnych cząsteczek DNA o pożądanych przez nas sekwencjach

Zastosowanie Chip DNA

• chipy do analizy znanych już sekwencji. Dzięki nim można diagnozować choroby genetyczne wywołane przez określone mutacje w obrębie znanych już genów. By skonstruować taki chip musimy znać sekwencje obszaru DNA, który chcemy analizować i dla każdego genu ( grupy genów ) potrzebny jest oddzielny chip np. chip do analizy sekwencji wirusa HIV lub chip do analizy mutacji w genie p53, odpowiedzialny za ponad połowę znanych nam nowotworów

• chipy za pomocą których można analizować dowolny fragment DNA o nieznanej wcześniej sekwencji, czyli po prostu sekwencjonować kwasy nukleinowe. Są to chipy uniwersalne, jeden chip można stosować do wielu różnych sekwencji. Problemem jest ograniczona długość fragmentu DAN, który może być poddany analizie za pomocą DNA-chipu

• chipy, których zadaniem jest nie tylko analiza sekwencji, ale także śledzenie ich aktywności. Wiadomo bowiem, że większość genów obecnych w naszych komórkach jest włączana i wyłączana zależnie od potrzeb. Inne geny są czynne u osoby zdrowej a inne u chorej ( np. Alzheimer). Działanie tego rodzaju chipów polega na wykrywaniu obecności cząsteczki mRNA, będących swego rodzaju kopiami aktywnego genetycznie genu.

METODY IMMUNOLOGICZNE

mogą być stosowane do detekcji każdego białka jeśli tylko możemy uzyskać przeciwciała ( przeciwciała wiążą się jedynie z niewielkimi fragmentami białka - epitopami, które mają charakter przestrzenny ) i wymagana jest właściwa konformacja białka przy reakcji

warunkiem użycia tego typu metod jest ekspresja poszukiwanych genów w komórkach gospodarza

szczególnie skuteczne w przypadku biblioteki cDNA

umożliwia znalezienie genu w przypadku gdy dysponujemy oczyszczonym białkiem a szukamy genu je kodującego.

Metody immunologiczne to : western - blotting ( białko - przeciwciało)

METODY SELEKCJI BEZPOŚREDNIEJ

Stosowane w przypadku gdy znany jest bezpośredni efekt fenotypowy klonowanego genu i gdy jego ekspresja powoduje zmiany morfologiczne lub fizjologiczne transformowanych komórek

Przykłady

• poszukujemy genu kodującego beta - galaktozydazę, po transformacji komórek E.coli bankiem genów i wysianiu ich na podłoże X-gal ( niebieskie zabarwienie kolonii wytwarzających ten enzym ), do transformacji używamy komórek nie wytwarzających tego enzymu ( klony komórek ) do których trafi wektor z poszukiwanym genem staną się niebieskie

• komplementacja mutacji - poszukujemy gen kodujący jeden z enzymów na szlaku biosyntezy argininy i drożdży, transformujemy szczep drożdży arg i wysiewamy na pożywkę bez argininy. W tym przypadku wyrosną tylko te komórki, w których będzie eksprymowany gen kodujący odpowiedni enzym z tego szlaku

• poszukujemy genu kodującego hemolizynę, bank genów wysiewamy na podłoże w krwią. Klon zawierający poszukiwany gen ujawni fenotypowy efekt hemolizy erytrocytów wokół kolonii

SPRZĘŻENIE GENÓW

Spacer po chromosomie ( poszukiwane geny występujące z innymi genami ). Koniec jednego odcinka służy jako marker o znanej sekwecji ( np. sonda RFLP ) do wychwytywania poszukiwanego odcinka chromosomu. Taki odcinek zawierający znany gen klonujemy, a jego koniec służy do wychwytywania kolejnego odcinka chromosomu. Taką procedurę powtarzamy aż do momentu gdy w którymś z poszukiwanych odcinków nie znajdzie się poszukiwany gen.

PCR łańcuchowa reakcja polimeryzacji

To szukanie geny bez tworzenia bez tworzenia biblioteki genomowej. Jeżeli znamy w przybliżeniu sekwencje nukleotydową szukanego genu możemy zastosować zdegenerowane startery tzn. mieszaninę starterów o podobnych ale nie identycznych sekwencjach i przeprowadzić PCR w łagodnych warunkach ( temp. Przyłączenia starterów na tyle niska, aby te które nie są na 100% komplementarne się nie przyłączyły ). Możliwosc namnożenia określonych odcinków DNA w ogromnych, praktycznie nieograniczonych ilościach. PCR oparte jest na replikacji DNA in vitro i przebiega w trzech procesach.

1. Denaturacja - rozdzielenie nici DNA w temp. 94 stopnie C i otrzymanie jednoniciowego DNA stanowiącego martycę do syntezy nici komplementarnych.

2. Renaturacja - hybrydyzacja komplementarnych oligonukleotydów ( primery, startery) do jednoniciowego DNA w temp 54 stopnie C. Pirmery wiążą się jadnocześnie na obu rozplecionych niciach w miejscach komplementarnych. Startery są dobierane tak, aby uskrzydlały odcinek DNA który ma ulec replikacji.

3. Elongacja - wydłużenie przyłączonych starterów, jest to replikacja DNA z udziałem taq polimerazy która przyłącza nukleotydy do starej nici między starterami i buduje nić komplementarną. Proces zachodzi w temp 72 stopnie C

Taki cykl jest powtarzany kilkukrotnie i po n- cyklach otrzymujemy 2 do n nowych nici Dna będących kopiami sekwencji zawartej między starterami. W każdym cyklu liczba DNA podwaja się, a efektem końcowym jest aplifikacja niewidocznego materiału genetycznego.

Zasadnicze czynniki wpływające na PCR :

1. fizyczne

• rodzaj termocyklera ( grzanie od góry, dokładne utrzymanie parametrów)

• zmiana temperatur - powtarzalność , łatwość programowania

• próbówki ( cienkościenne do PCR muszą pasować do aparatu, do 25 lub 50 ml)

2. składniki reakcji

polimeraza taq - jej ilość jest najważniejszym z czynników podlegających optymalizacji. Izolowana z thermus aquaticus. Jest termostabilna i nie traci aktywności po denaturacji. wymaga obecności bufora.

Matryca - wolna od obecnego DNA - RNA nie zdegradowana, łatwo pozyskiwana

MgCl2 - wpływa na aktywność enzymu tworzy kompleksy z dNTP dając substraty dla polimerazy wolny Mg2+ zależy od składników wiążących ( dNTP, PPi, EDTA )

dNTP

równomolowa mieszanka czterech trójfosforanów deoksynukleotydów, nie zrównoważony skład obniża dokładność polimerazy i jej błędy podczas amplifikacji

Startery - krótkie fragmenty jednoniciowego Dna o sekwencji od 12 do 30 nukleotydowej. Najczęściej to ich sekwencja i stężenie decyduje o powodzeniu reakcji. Projektując startery musimy uważać aby:

• nie tworzyły wewnętrznych struktur dwurzędowych np. szilki do włosów ( ostatnie sekwencje na końcu 3' są sobie komplementarne )

• powinny mieć wyrównane rozmieszczenie domen G /C i A/ T ( po 50%)

• koniec 3' nie powinien zawierać fragmentów komplementarnych do siebie samych i do innych starterów

• nie mogą zbyt silnie wiązać na 3' końcu

• do 5' można dodawać fosforanową z radioaktywnym izotopem ( możliwa detekcja startera )

Temperatura

W denaturacji wpływa na aktywność polimerazy, po kilku cyklach można ją obniżyć, gdyż rozpad krótszych łańcuchów DNA jest znacznie łatwiejszy. Na temperaturę renaturacji mają wpływ startery - im więcej CG w sekwencji startera tym temperatura procesu powinna być wyższa. Temperatura elongacji zależy od pochodzenia i termostabilności polomerazy.

Hot start - unikanie niespecyficznej amplifikacji podczas pierwszego cyklu (94 C )

1. wkładać próbówki do gorącego bloku

2. dodawać polimerazę lub startery do gorącej mieszaniny

3. odseparować startery od reszty reakcji parafiną

4. korzystanie z polimerazy zabezpieczonej przeciwciałem

kłopoty z subklonowaniem produktu PCR:

1. po taq polimerazie zostaje od 70% końców tępych, a reszta ma jedną zasadę wystającą na końcu 3' ( zwykle A ) - można ligować na lepko

2. większość starterów zdefosforylowanych na końcu 5'

specyficzne zastosowanie PCR i innych reakcji cyklicznych

nested - „zagnieżdżony” PCR

multipleks PCR - jednoczesna amplifikacja kilku fragmentów ( dłuższe startery ), równoczesne wykrycie kilku poszukiwanych genów obecnych w jednej probówce lub wykrycie jednego z wariantów genów

in situ PCR ( genomowy i RT ) - w tkance bez naruszenia jej struktury. Można sprawdzić w których komórkach określone geny a w powstałym produkcie sprawdzić intensywność barwy

RT-PCR - PCR w użyciu z odwrotną transkryptazą, materiałem wyjściowym jest mRNA lub RNA wirusa. PCR jest poprzedzone odwrotną transkryptazą, czyli przepisanie informacji z RNA na cDNA i zachodzi in situ w preparacie na szkiełku mikroskopowym. Możliwe jest wykrycie nawet niewielkiej ilości RNA w komórkach. Wywołanie odbywa się przez reakcje barwną, a intensywność tej reakcji jest proporcjonalne do ilości cząsteczek po PCR

RAPD-PCR ( przypadkowy PCR) wykorzystywane są krótkie przypadkowo dobrane startery które wiążą się z określonymi sekwencjami DNA, otrzymujemy namnożenie pewnego fragmentu DNA. Można ustalić starter który wytworzy produkt o określonej długości u osoby chorej, a nie zdrowej ( lub odwrotnie ). Po elektroforezie otrzymuję się obraz prążków charakterystycznych dla danego osobnika. Tą metodą możemy się posłużyć w kryminalistyce lub ustaleniu ojcostwa.

ZASTOSOWANIE PCR

1. wykrywanie zakażeń wirusowych, bakteryjnych, grzybiczych pasożytniczych

2. wczesnego wykrywania chorób dziedzicznych

3. wykrywanie predyspozycji do rozwoju nowotworu ( np. raka jelita grubego, raka piersi)

4. wczesnego wykrywania nowotworów ( np. białaczek)

5. badanie odporności na leki ( bakterii na antybiotyki, komórek nowotworowych na chemioterapeutyki )

6. dopasowanie dawców i biorców przeszczepów np. .szpiku kostnego

7. ustalenia ojcostwa : próba składa się z DNA matki ( dajacej córce 50% swego DNA więc połowę sekwecji będą miały te same ) córki ( mając po 50% DNA od obu rodziców ) i ojców ( dając pozostałe 50 % DNA)

8. wykrywanie sprawców przestępstw ( genetyczne odciski palców )

Wiele osób utożsamia diagnostykę molekularną z diagnostyką prenatalną, tym czasem jest ono tylko jednym z możliwych zastosowań technik molekularnych w diagnostyce. Bada się tu materiał genetyczny rozwijającego się płodu, uzyskany najczęściej z płynu owodniowego. Można w ten sposób wykryć np. zespól Downa.

Genetyczny odcisk palca - bardzo przydatna technika do analizy podobieństwa genomów. Technika oparta na występowaniu w genomach sekwencji powtarzalnych DNA nazwanych sekwencjami minisatelitarnymi. Ustalono, że satelitarny DNA podlega gwałtownej ewolucji i jego organizacja w genomie jest wysoce polimorficzna.

Wzór uzyskany po rozdziale elektroforetycznym i autoradigrafii poddanego hybrydyzacji satelitarnego DNA jest swoisty dla danego osobnika i niepowtarzalny ( jak odcisk palca )

Wizualizacja produktów PCR

1. elektoforeza w żelu agarozowym

Zel zawiera bromek etydyny, który interkaluje do DNA. EtBr po związaniu z cząsteczką DNA fluoryzuje, kiedy jest eksponowany na światło UV

2. Real-Time PCR

Polimeraza taq znajduje starter- laser wzbudza fluorescent na starterze- fluorescencja jest absorbowana przez cząsteczkę wygaszacza - detektor nie wykrywa reakcji - od startera dobudowana jest komplementarna nić przez polimerazę taq - polimeraza napotyka cząsteczkę fluorescencyjną - polimeraza analizuje napotkany starter - następuje odłączenie cząsteczki fluorescencyjnej wygaszacza - PCR jest kontynuowany przyłączone startery zdegradowane, a cząsteczki fluorescencyjne uwalniane i akumulowane - detektor rejestruje wzrost fluorescencji jako pomiar zaawansowania amplifikacji.

Różnice między PCR a replikacją

1. Startery DNA a nie startery RNA

2. Namnażanie fragmentów DNA a nie całości

3. Teromstabilna polimeraza

4. Denaturacja termiczna DNA a nieenzymatyczna

PIROSEKWENCJONOWANIE

1. Rejestruje kolejność wbudowywanych nukleotydów

2. Wbudowanie nukleotydu powoduje uwolnienie pirofosforanu, który przkeształacając się za pomocą sulfurylazy daje błysk chemoluminescencji

3. Nukleotydy dodawane są pojedynczo, nie wbudowany nukleotyd ulega degradacji przez nukleodazę

METODA SANGER'A

Przebiega jak zwykły PCR, po przyłączeniu starterów rozpoczyna się synteza nowej nici. Do roztworu w którym zachodzi PCR dodaje się dideoksyrybonukleotyd A ( ddNTPA przy węglu 3' rybozy zamiast grupy OH- jest H+).Synteza nowej nici kończy się po wyłączeniu ddNTPA i otrzymujemy pule cząstek, które są zakończone A

Metoda chemicznej degradacji Maxhama i Gilberta (1977)

1. znakowanie cząsteczki DNA na końcu 5'

2. przyłączenie grupy metylowej do danej zasady azotowej ( metyolowana jest pirewsza zasada w cząsteczce ), metyluję się siraczanem dimetylu

3. piperydyna - usuwa zmetlowaną zasadę i przecina wiązanie fosfodiestrowe przed miejscem pozbawionym zasady

4. otrzymujemy dwie pule cząstek wyznakowanych i niewyznakowanych

5. dalej jak w metodzie Sangera ( trudności z metylowaniem AT i często przeprowadza się degradacje w czterech reakcjach G, A+G, C i C+T) - nie ma na to wpływu wierność odczytywanej sekwencji.

Zastosowanie klonowanego DNA

• sekwencjonowanie DNA i uzyskanie informacji o sekwencji białka

• izolacja i analiza promotorów genów i innych sekwencji regulatorowych

• badanie funkcji białka / enzymu / RNA poprzez produkcje na dużą skalę form normalnych i zmienionych ( mutageneza ukierunkowana ) tych cząsteczek

• identyfikacja mutacji np. uszkodzeń genów, prowadzących do rozwoju chorób

• biotechnologia - produkcja na dużą skalę w celach komercyjnych, białek i innych cząstek ważnych biologicznie ( insulina, hormon wzrostu)

• inżyniera białek prowadząca do zmiany ich właściwości

• inżyniera zwierząt i roślin - terapia genowa

ORGANIZMY TRANSGENICZNE

Zmodyfikowane genetycznie organizmy, które mają wbudowany fragment obcego genomu w swój własny, przez co organizm nabiera cech, które posiada, inny organizm. Obcy Dna jest wprowadzany metodami inżynierii genetycznej poprzez wektory do komórek bakterii, zapłodnionych komórek jajowych zwierząt lub komórek zarodka w początkowej fazie rozwoju zarodkowego. GMO mają zastosowanie praktyczne (np. wyposażenie roślin w cechy nadające im wyższą odporność lub umożliwiające im życie w niesprzyjających warunkach środowiska ) lub poznawcze ( np. badanie nad funkcjonowaniem genu ). Trasgenizacja zwierząt hodowlanych prowadzona jest w celu

• stymulacji zwiększenia masy ciała ( geny hormonu wzrostu ) i wydajności mlecznej

• modyfikacja genotypu przez wprowadzenie nowych genów

• poprawa żywotności zwierząt dzięki wprowadzeniu genów odporności lub tolerancji na określone patogeny

• organizmy jako bioreaktory produkujące białka, hormony, enzymy np. wydzielane od mleka białek ludzkich alfa1antytrypsyna ( leczenie degeneracji płuc) czynniki krzepliwości krwi do leczenie hemofili

Modyfikowane cechy - tolerancja na herbicydy, odporność na cechy wirusowe, odporność na owady, jakość plonu ( odpornosć na zimno, zmiany w składzie aminkowasów i tłuszczów ) wysoko wydajna produkcja białek heterologicznych ( ziemniaki produkujące ludzką albuminę surowicy krwi ), odporność na zakażenia grzybicze

LEKOODPORNOŚĆ

Leki podane do ustroju ulegają kolejnym procesom. Najpierw uwalniają się ze swojej formy, tzn z tabletki, drażetki czy czopka. Następnie wchłaniają się z miejsca podania : z przewodu pokarmowego przy podaniu doustnym czy doodbytniczym, z tkanki podskórnej lub domieśniowej przy podaniu dotkankowym. Leki mogą również przenikać przez skórę lub inne śluzówki poza błoną śluzową przewodu pokarmowego, np. w pochwie czy worku spojówkowym. Pary, gazy oraz drobne cząsteczki ciał stałych w postaci areozoli i drobnych zawiesin mogą się wchłaniać przez płuca

TRANSPORT

Zarówno wchłanianie jak i przenikanie leków do tkanek polega na ich przechodzeniu przez różne błony biologiczne.

Rozróżniamy następujące rodzaje transportu leków przez błony:

• dyfuzję bierną - przenikanie przez błonę lipidową cząstek niezjonizowanych i rozpuszczalnych w tłuszczach

• dyfuzję prosta przez pory ( transport konwekcyjny )

• transport przenośnikowy ( transport czynny i dyfuzję ułatwioną ) - do jego przeprowadzenia niezbędna jest energia, a szybkość tego transportu zależy m.in. od liczby cząsteczek przenośnika

• pinocytozę

podstawowe znaczenie ma dyfuzja prosta i transport czynny

MECHANIZMY LEKOODPORNOŚCI

Istnieje wiele mechanizmów powstawania lekoopdorności, mogącym powstać w każdym etapie interakcji leku w organizmie:

• wzrost inaktywacji / obniżenie aktywacji leku przez zdrowe tkanki

• obniżona akumulacja leków w komórce

1. obniżony napływ leków do komórki

2. zwiekszenie usuwania leku z komórki ( działanie transporterów ABC)

3. zmieniona dystrybucja w komórce

• obniżenie aktywności leku /zwiększenie inaktywacji leku w komórce

• zmiana celu komórkowego ( ilościowa lub jakościowa)

• zmniejszona naprawa uszkodzeń wywoływanych przez lek

• zaburzenie efektów leku ( szlaki sygnałowe i apoptyczne )

TRANSPORTERY ABC

Nadrodzina białek transbłonowych ABC ( ATP -binding casette - kaseta wiążąca ATP) należy do największych klas protein spotykanych u organizmów żywych. Białka te występują u wszystkich dotychczas zbadanych organizmów, zachowując wysoki stopień konserwatywność, co przemawia za ich istotnym znaczeniem biologicznym. Fizjologiczna funkcja transporterów ABC związana jest z błonami biologicznymi. Są to białka przezbłonowe związane z transportem różnych substratów na zewnątrz lub do wnętrza komórek. Fizjologicznie pełnią funkcje eksporterów ( u eucaryota ) lub impotrerów ( u procaryota ) różnych substancji wykorzystując energię z hydrolizy ATP. Rosnąca liczba danych wykazuje na ich rolę w regulacji homeostazy komórek porzez udział w metabolizmie ksenobiotyków, transporcie białek, lipidów i jonów, przekazywaniu sygnałów wewnątrzkomórkowych

Ludzka nadrodzina ABC została podzielona na 7 podrodzin zawierających bialka o zbliżonej strukturze :

• podrodzina A ( ABCA , dawna nazwa ABC1 )

• podrodzina B ( ABCB , dawna nazwa MDR/TAP ) np. glikoproteina P

• podrodzina C ( ABCC , dawna nazwa CFTR/MPR)

• podrodzina D ( ABCD, dawna nazwa ALD)

• podrodzina E ( ABCE , dawna nazwa OABP)

• podrodzina F ( ABCF , dawna nazwa GCN20)

• podrodzina G (ABCG , dawna nazwa White )

Sekwencja aminokwasowa transpotrerów ABC zawiera charakterystyczne motywy: Walker A, Walker B „ signature region”. Białka transportowe nadrodziny ABC mają interesujący układ strukturalny zawierający domeny przez błonowe ( transmembrane domain, TMD) oraz domeny wiażące nukleotydy ( nucleoide binding domain, NBD). TMD składają się najczęściej z 6 fragmentów przezbłonowych i prawdopobodnie tworzą kanał w błonie komórkowej. NBD, położone wewnątrzkomórkowo, odpowiadają za wiązanie i hydrolizę ATP. Poszczególne transportery ABC mogą zawierać różną liczbę domen TMD i NBD. Z dotychczasowych badań wynika iż funkcjonalnie kompetentny transporter musi być zbudowany z przynajmniej 4 podjednostek : 2 TMD i 2 NBD jest nazywane pełnym transporterem ( full tranporter ). Natomiast białka ABC zawierają jedną TMD i jedną NBD określa się jako hemitransportery ( half - transporter ). Hemitransportery zyskują aktywność tworząc hetero lub homodimery

ZNACZENIE TRANSPORTERÓW ABC W OPDORNOŚCI LEKOWEJ

Prawdopodobnie istotną funkcją częsci spośród transporterów ABC jest ochrona różnych tkanek przez toksycznymi ksenobiotykami. Substratem dla niektórych z nich ( obecnie ponad 10 białek ) mogą być leki, w tym leki przeciwnowotworowe. Wykazano, że w niektórych odpornych liniach nowotworowych nadekspresja transporterów ABC jest związana w wystąpieniem feontypu odporności wielolekowej. Wydaje się, że wysoka ekspresja tych białek może być najczęstszą przyczyną obserwowanej klinicznie lekoodporności, w której obniżona jest akumulacja cytostatyku w komórkach nowotworu.

• leki cytotoksyczne są substratem dla różnych białek ABC ( P-gp, BCRP)

• nadekspresja transporterów ABC koreluje z obniżoną akumulacją leków w komórkach nowotworowych

• stwierdzono wzrost ekspresji niektórych transporterów ABC w opornych liniach nowotworowych

• niektóre badania wykazały związki ekspresji i czynności transporterów ABC ( np. P-gp) z niższym odsetkiem odpowiedzi na leczenie i niekorzystnym rokowaniem w wielu chorobach nowotworowych

Pierwsze badania były prowadzone z glikoproteiną ( pgp), który transportuje leki z / do komórki. Nadekspresja tych białek w komórkach nowotworowych wiąże się z mniejszym gromadzeniem leku w komórce. Glutation wiąże się z lekiem i łatwo jest usuwany z komórki, dodatkowo transferazy sprawiają że jest on mniej toksyczny

ABC działają na kilka sposobów :

• klasyczna pompa błonowa działająca jak kanał przez który wchodzą i wychodzą leki

• odkurzacz molekularny - zasysanie obcych substancji z wnętrza komórki na zewnątrz

• flipaza - transport z wewnątrz na zewnątrz komórki ruchem flip-flop błony komórkowej

• kanał chlorkowy- zmiana pH w komórce prowadzi do zmiany potencjału komórki a tym samym zmienia się rozkład leku

WYKŁAD 4

Cykl komórkowy

Pojedynczy cykl komórkowy można podzielić na kilka głównych faz, które reguluje tykający zegar biologiczny:

1. Interfaza - okres pomiędzy podziałami komórki

• faza G1 - wysoka aktywność metaboliczna, wzrost komórki - komórka wykonuje zadania, do których została powołana i przygotowuje się do skopiowania swojego materiału genetycznego, czyli replikacji DNA

• faza S (synteza ) - replikacja DNA

• faza G2 - końcowe przygotowania do podziału

• faza G0 - komórki znajdujące się w fazie G0 też pełnią funkcje, do których zostały powołane przez organizm, ale przestają się dzielić ( takimi komórkami są np. dojrzałe neurony ). Niektóre komórki mogą wracać z fazy Go do cyklu komórkowego i dalej się dzielić, jeśli zostaną odpowiednio pobudzone na przykład przez hormony albo czynniki wzrostowe

2. podział mitotyczny - faza M ( mitoza ), podział w którym powstają dwie komórki potomne o tej samej liczbie chromosomów

REGULACJA AKTYWNOŚCI BIAŁEK POPRZEZ CHEMICZNĄ MODYFIKACJE

( kowalencyjne przyłączenie grup chemicznych do aminokwasów w białkach )

regulacja cyklu komórkowego odbywa się poprzez uruchomienie kaskadowych reakcji fosforylacji i defosforylacji białek. Fosforylacja jest katalizowana przez różnorodne kinazy białkowe, defosforylacja przez fosfatazy. Substratami kinaz są różne białka jądrowe i cytoplazmatyczne, a najczęściej fosforylowanymi aminokwasami są tyrozyna i treonina. Aktywacja kinaz zachodzi w dwóch przedziałach cyklu komórkowego: pod koniec fazy G2 ( przejście do fazy M i zapoczątkowanie mitozy ) i w fazie G1 ( przejście do fazy S z zapoczątkowaniem syntezy DNA ). Fosforylacja polega na dołączeniu reszty fosforanowej przez kinazę białkową, co jest mechanizmem regulacji aktywności białek potrzebnych w cyklu komórkowym . jest to proces odwracalny poprzez działanie fosfataz białkowych. Regulacja cyklu komórkowego może zachodzić także dzięki acetylacji i glikozylacji białek. Także proteoliza białek ma wpływ na aktywność.

Proteoliza białek:

• degradacja białe do aminokwasów w lizosomach bądź proteosomach ( białka regulatorowe )

• proces katalizowany przez proteazy ( kompleks proteosomu )

• regulacja cyklu komórkowego oberjmująca degradacje regulatorów

REGULACJA CYKLU KOMÓRKOWEGO

1. punkty restrykcyjne ( start ) - późna faza G1 ( dzielić się czy nie dzielić, oto jest pytanie )

1. komórki drożdży podejmują decyzję na podstawie wielkości komórek, która jest uzależniona od dostępności składników odżywczych

2. komórki zwierzęce podejmują decyzje na podstawie obecności białkowych czynników wzrostowych zwanych mitogenami, które symulują wzrost komórki

2. kompleksy CDK ( cyklinozależne kinazy )

heterodimeryczne kinazy białkowe regulujące cykl komórkowy. Składają się z podjednostki regulatorowej ( cyklina ) i podjednostka katalityczna ( CDK kinaza ). Są różna kompleksy CDK dla różnych faz cyklu komórkowego :

FAZA G1 - CDK4/cyklina D1, CDK4/cyklina D2,CDK6/cyklinaD3

FAZA S - CDK7/cyklina H, CDK2/cyklinaA

FAZA G2 - CDK1/cyklina A, CDK1/cyklina B

Mitoza - CDK1/cyklina A

Kompleks CDK w fazie G1 jest blokowany przez inhibitor CDI, co uniemożliwia komórce wejść w fazę S i zreplikować swoje DN. Usunięcie inhibitora zaktywuje kompleks CDK, a tym samym rozpocznie się replikacja. Jest to możliwe dzięki znakowaniu przez enzymy ( tu ubikwityna ) inhibitora. Ubikwityna dołącza się do inhibitora i rozpoczyna proces poliubikwitacji. Ubikwitowany inhibitor odłączony zostaje od kompleksu i trafia do proteosomu, gdzie jest rozkładany przez protezy, a ubikwityna powraca do cytoplazmy.

Po zniknięciu inhibitora białko CDK staje się aktywne i pobudza syntezę DNA

1. Cykliny

• cykliny to białka, których poziom w komórce zmienia się w różnych fazach cyklu komórkowego

• cykliny łączą się ze swoimi kinazami cyklinozależnymi ( fosforylacja ) i zmieniają ich aktywność

• degradowane w procesie proteolizy w specyficznych punktach cyklu komórkowego

Rodzaje cyklin i ich funkcje

Typ cykliny	Typ kinazy	Funkcja kompleksu
D1, D2, D3	CDK4, 6	Fosforylacja w fazie G1
E	CDK2, 3	Fosforylacja na granicy faz G1/S
A, B	CDK 2	Fosforylacja w fazie G1 i S
A i B	CDK 1 (p34)	Fosforylacja na granicy faz G1/S i G2/M
H	CDK 4	Fosforylacja kinaz CDK, wszystkie fazy

2. Kinazy

W cyklu komórkowym funkcjonują kinazy zależne od cyklin. Kinazy to enzymy, które przyłączają grupy fosforanowe do innych cząsteczek, czyli przeprowadzają fosforylacje tych cząsteczek. Słowo „cyklinozależne” wskazuje na to, że aktywność tych kinaz jest regulowana przez cykliny. Kompleksy CDK są specyficzne dla danej fazy cyklu komórkowego. Mamy więc kompleksy CDK fazy G1, fazy S, fazy G2 i mitotyczne kompleksy CDK tzw. MPF

Kompleksy fazy G1

Faza G1 to okres pomiędzy podziałami komórki a replikacją DNA. Jej czas jest najbardziej zmienny i trwa na ogół 6-12 godzin. Charakteryzuje się intensywnymi procesami anabolicznymi - wzrasta ilość RNA i białek. Komórka syntetyzuje białka enzymatyczne ( potrzebne do replikacji ) i strukturalne, syntetyzowane jest także RNA. We wczesnej fazie G1 komórka osiąga punkt restrykcyjny i po jego przekroczeniu aktywowany jest sygnał do replikacji, komórka przygotowuje się do fazy S- następuje fosforylacja czynników transkrypcyjnych, które podwyższają transkrypcje genów kodujących enzymy wymagane przy procesie replikacji DNA. Jednakże jeśli nie przekroczy punktu R to wchodzi w fazę G0

Kompleksy fazy S

W fazie S (syntezy ) następuje początkowa regulacja procesu replikacji DNA, które podwaja ilość DNA w komórce. Replikacji ulega niemal całe jądrowe DNA. Synteza DNA przebiega w sposób programowany ( zaprogramowany genetycznie ) i nie programowany ( następstwo uszkodzeń i mutacji, nie związana z cyklem komórkowym ). Trwa 6-8 godzin i w tym czasie masa i objętość komórki znacznie wzrasta. Oprócz ńą syntetyzowane są także inne składniki chromatyny min. Białka histonowe i niehistonowe, spada natomiast synteza RNA. Aktywność kompleksów fazy S jest regulowana przez specyficzny inhibitor : kompleksy CDK fazy G1 powodują degradacje inhibitorów kompleksów fazy S w późnej fazie G1, której wynikiem jest aktywacja tych kompleksów. Ufosforylowane w fazie G1 białka przyłączają się do miejsc ori replikacji, której wynikiem jest jedna runda powielania DNA.

Fazę S można przedstawić następująco:

Kompleksy APC - niszczenie cyklin - ładowanie białek na kompleksy ori faz S, G1, i M - przygotowanie miejsc inicjacji replikacji do uruchomienia w fazie S.

Kompleks fazy G1

Faza G2 nazywana preprofazą to okres poprzedzający podział komórki. Komórka przygotowuje się poprzez wzmożoną syntezę RNA i białke budujących wrzeciono podziałowe ( tubuliny tworzącej mikrotubule ). Intensywna synteza składników potrzebnych do odtworzenia błon otoczki jądrowej i wytworzenia przegrody pierwotnej. Jest to najkrótsza faza interfazy trwająca 3-4 godziny. Pod koniec fazy aktywowany jest kompleks p34/cyklina ( kinazy fazy M ), co początkuje kaskadę fosforylacji i defosfowylacji białek. Prowadzi to do rozpoczęcia i przeprowadzenia mitozy.

Kompleksy mitotyczne CDK

Mitoza to podział komórki kończący cykl komórkowy. Składa się z dwóch głównych etapów: kario- o cytokinezy. W kariokinezie można wyznaczyć cztery fazy : profaza, metafaza, anafaza i telofaza. Podział komórki i cykl komórkowy kończy się wytworzeniem dwóch potomnych komórek, które wchodzą w fazę G0. Aby doszło do uruchomienia procesu mitozy komórka musi być odpowiednio przygotowana w interfazie, a następnie musi dojść do aktywacji kinazy fazy M ( aktywacja następuje pod koniec fazy G2). Kinaze tą nazywa się MPF ( mitosis promoting factor - czynnik promujący mitozę ). Wysoki poziom MPF wywołuje kondensację chromosomów, uszkodzenia otoczki jądrowej, tworzenie wrzeciona i aktywacja kompleksów anafazy. Niski poziom MPF sprawia, że chromosomy się segregują, dekondensują, odtwarzana jest otoczka jądrowa a DNA jest replikowane. MPF powstaje w fazie G2 z połączenia cykliny B i białka p34, a rozpadowi ulega pod koniec anafazy. W takim kompleksie p34 ma właściwości kinazy, a cyklina nadaje kompleksowi powinowactwo do substratu. MPF odpowiedzialna jest za :

1. laminy jądrowe - we wczesnej profazie MPF fosforyluje specyficzne reszty serynowe i treoninowe w laminach powodując ich depolimeryzacje, a w konsekwencji dezintegracje jądra.

2. Fosforylacja histonu H1 i innych białek rusztowania chromosomu

3. MPF fosforyluje miejsca w łańcuchu lekkim miozyny, przez co hamuje aktywność ATPazy i wiązanie z elementami aktywowanymi - blokowanie cytokinezy we wczesnej fazie mitozy

Mitotyczna regulacja kompleksu CDK

W interfazie syntetyzowana jest cyklina B, której poziom rośnie do metafazy. W metafazie kompleks MPF ( złożony z cykliny B i p34) fosforyluje kompleksy APC powodując ich aktywacje ( ulegają defosforylacji w późnej fazie G1). W trakcie gdy komórka przechodzi kolejne etapy mitozy kompleks MPF ulega puliubikwitynacji i w późnej anafazie cyklina B związana z ubikwityną odłącza się od kompleksu MPF i jest rozkładana w proteosomach. W telofazie jest bardzo niski poziom cykliny B w komórce przez co nie tworzą się kompleksy MPF i komórka może spokojnie wejść w interfazę

KOMPLEKSY APC

To kompleks promujący anafaze ( anaphase - promoting complex ). Aktywowany jest przez mitotyczne kompleks MPF. Decyduje, które z białek ma ulec degradacji : inhibitor anafazy czy MP. Kompleks ten pozwala na rozejście się siostrzanych chromatyd.

Regulacja APC - APC jest aktywowane w metafazie poprzez fosforylacje wywołaną przez kompleks MPF. Aktywowany kompleks APC rozkłada inhibitor anafazy i umożliwia przejście komórki w anafazę natomiast w późnej telofazie powoduje degradacje cykliny B. APC jest inaktywowane w późnej fazie G1 przez kompleks CDKC

Inhibitory białkowe kompleksów CDK-cykliny

Dodatkowy poziom regulacji i jeszcze bardziej kompleksowa kontrola cyklu komórkowego

Nazwa rodziny inhibitorów	Cel inhibitora
Rodzina p16
P16/INK4a, p15/INK4b, p18/INK4c, p19/INK4d	Kinazy CDK4 i 6
Rodzina p21
P21, p27, p57	Wszystkie kompleksy cyklina/CDK
Inne
P40, Fae1	Kinaza cdc28

Punkty kontrolne w regulacji cyklu komórkowego

W cyklu komórkowym jest kilka punktów kontrolnych w których działają czynniki regulujące, odpowiedzialne za naprawy nieprawidłowości. Mamy więc punkty kontrolne fazy:

• G1 - uszkodzenia DNA ( białko p53)

• S - niezreplikowane DNA

• G2 - uszkodzenia DNA

• M - nieprawidłowe tworzenie wrzeciona podziałowego

• Wysoki poziom MPF prowadzi do profazy i aktywacji APC

• Aktywacja APC to dezaktywacja inhibitorów anafazy i wejście w anafazę

Punkty kontroli cyklu z udziałem białka p53 i Rb

Występują między fazą G1 i S w tzw punkcie kontrolnym G1-S oraz między fazą G2 i M w punkcie kontroli G2-m. W obu punktach działają białka regulatorowe p53 i Rb

Białko p53

Białko nazywane „strażnikiem genomu” . w zdrowych komórkach nie można znaleźć wielu cząsteczek białka p53, ale uszkodzenia materiału genetycznego, które mogą nastąpić w fazie G1 iG2 ( dlatego białko p53 występuje w punktach kontroli po tych fazach ), co prowadzi do gwałtownego nagromadzenia się p53 w jądrze komórkowym. Białko p53 dowiaduje się o uszkodzeniach od specyficznych enzymów, które uaktywniają się po rozpoznaniu uszkodzonych miejsc w DNA i przyłączają grupy fosforanowe do p53 i innych białek. Aktywacja p53 powoduje ekspresje genu Mdm2, który produkuje białko Mdm2. Białko Mdm2 reguluje aktywność białka p53: jeżeli jest nieufosforylowane to Mdm2 rozkłada je natomiast jeżeli p53 jest w formie ufosforylowanej nie dochodzi do tworzenia kompleksów Mdm2, a tym samym p53 jest wciąż aktywne. Doczepienie grup fosforanowych do p53 i do Mdm2 utrudnia białku Mdm2 niszczenie cząsteczek p53. Okazało się, że fosforylacja Mdm2 nie zapobiega wiązaniu się tego białka z p53, jednak fosforylowane białko Mdm2 przestaje kierować p53 na drogę zniszczenia o gromadzące się w jądrze komórkowej cząsteczki p53 modą zacząć działać. Białko p53 ma za zadanie zatrzymanie cyklu komórkowego, uaktywnienie enzymów naprawiajacych DNA i skierowanie na drogę apoptozy ( programowanej śmierci ) komórek, których nie da się zreperować. Więc p53 chroni organizm przed mutacjami i powstaniem komórek nowotworowych.

DZIAŁANIE BIAŁKA p53

Aktywowany na skutek uszkodzenia DNA czynnik ATM fosforyluje ( lub nie ) białko p53. Nieufosforylowane p53 jest wiązanie przez Mdm2 i rozkładane w proteosomie po poliuikwitiyzacji. Ufosforylowane p53 blokuje podziały komórki i wymusza naprawy uszkodzonego DNA. Blokowanie podziałów następuje poprzez wytworzenie białka p21 i GADD45, które hamują fosforylację kompleksów Cdk odpowiedzialnych za aktywacje innych białek biorących udział w przebiegu cyklu komórkowego. Brak fosforylacji kompleksów Cdk równe jest z niemożliwością przechodzenia w kolejne fazy cyklu komórkowego. Jeżeli uszkodzenia są na tyle duże, iż nie da się ich naprawić to białko p53 nie tylko zatrzymuje podziały komórki ale również powoduje wzrost w komórce białek z rodzin bcl ( bac i bcl-2), a te prowadzą komórkę na szlak apoptozy.

BIAŁKO Rb

Rb to główny hamulec cyklu komórkowego, który mocno podtrzymuje czynniki transkrypcyjne potrzebne komórce do podziału ( np. czynnik transkrypcyjny c-myc ). Na początku fazy G1wiele czynników transkrypcyjnych (np. E2F) potrzebnych w kolejnych fazach cyklu wiąże się z białkiem Rb. Uruchomionie kinazy cyklinozależne fosforylują białko Rb i uwalnia związane czynniki transkrypcyjne, a to pozwala komórce przygotować się do podziału ( białko Rb jest znanym genem supresorowym nowotworów; jego uszkodzenie pozwala rozregulować cykl komórkowy). brak Fosforylacji białka Rb po mitozie ( wiąże czynniki transkrypcyjne ) zapewnia wejście komórki w fazę G0, a fosforylacja Rb wyzwala komórke z tej fazy. Fosforylacja białka Rb musi zajść aby komórka wyszła z fazy G0 oraz umożliwia przejście komórki z fazy G1 do S. Rb jest defosforylowane pod koniec fazy G2 i wiąże czynniki transkrypcyjne, które nie się potrzebne w mitozie. W fazie S białko Rb jest w pełni ufosforylowane, dzięki czemu nie ma żadnych problemów w replikacji DNA i syntezie białek.

Leki przeciwnowotworowe - RFT - uszkodzenia DNA - p534 - naprawa i przeżycie komórki lub w stanie stresuoksydacyjnego: indukcja antyoksydatów w odpowiedzi genowej - modulacja komórkowego REDOX - przeżycie komórki lub generowanie RFT - sygnały proapotyczne - śmierć komórki

8 października 2001r. Komitet Noblowski przy szwedzkim Instytucie Karolinska ogłosił nazwiska laureatów Nagrody Nobla w dziedzinie medycyny i fizjolofgii - Leland H. Hartwell z USA oraz R.Timothy Hunt i Paul M. Nurse z Wielkiej Brytanii - za odkrycie podstawowych regulatorów cyklu komórkowego w organizmach eukariotycznych

WYKŁAD 5

Regulacja cyklu komórkowego

Białkowy kompleks CDK2-CE fosforyluje kompleks białkowy pRb-E2F. Ufosforylowane białko pRb odłącza się od kompleksu pRb-E2F a uwolnione E2F posłuży jako enzym do syntezy DNA. Wtedy komórka przechodzi z fazy G1 do S. Jeżeli powstanie uszkodzenie DNA, to aktywowane jest białko p53, które aktywuje białko p21. Białko p21 łączy się z kompleksem CDK2-CE i blokuje fosforylacje właściwości tego kompleksu. Białko pRb nie ulega fosforylacji a tym samym nie dochodzi do uwolnienia enzymów potrzebnych w syntezie DNA. Związanie się białka p21 z kompleksem CDK2-CE uniemożliwia syntezę DNA, a tym samym komórka nie może wejść w fazę S cyklu komórkowego.

Szlaki zmian w obrębie komórki

W normalnej komórce, na skutek działania pewnych czynników, może dojść do uszkodzenia DNA. W komórce z uszkodzonym DNA może być aktywowane białko p53, co wywoła blokadę podziału komórki ( komórka przestaje się dzielić ) i następuje naprawa uszkodzonej nici. Po naprawieniu DNA białko p53 jest inaktywowane, zostaje zniesiona blokada podziału komórki oraz następuje aktywacja genu myc. Normalna komórka z naprawionym DNA zaczyna się dzielić. Jednakże nie zawsze uszkodzone DNA jest naprawiane. Uszkodzenia mogą być na tyle poważne iż nić DNA jest nie do naprawy. Wtedy z komórką zaczynają dziać się różne rzeczy. W komórce dochodzi do aktywacji genu białka p53, dezaktywacji genu myci blokady podziału komórki. Dodatkowo następuje wzrost poziomu białek bax i bcl-2, co prowadzi do apoptozy komórki. Jednakże w komórce nie może dojść do blokady podziały komórkowego, a zaburzenia na poziomie produkcji białek bax i bcl-2 sprawiają iż komórka staje się nieśmiertelna. Taka komórka dzieli się mimo uszkodzonego DNA, uszkodzenia są gromadzone oraz dochodzi do mutacji, a w ostateczności komórka staje się nowotworowa.

RODZAJE SMIERCI KOMÓRKI

Nekroza - ( martwica ) - zachodzi pod wpływem działania na komórkę różnych czynników mechanicznych, fizycznych, chemicznych i biologicznych, dochodzi do obrzęku komórki, naruszenia ciągłości błony plazmatycznej, uszkodzenia organelli, postępującej dezintegracji strukturalno - funkcjonalnej, będącej przyczyną nieodwracalnego uszkodzenia procesów istotnych dla życia komórki. Efekt to stan zapalny. Martwicą dotknięta jest przeważnie duża część tkanki. Następuje zwiększenie rozmiarów komórki, rozpad organelli komórkowych, zmiany w chromosomie z niespecyficzną fragmentacją DNA. W wyniku tych procesów komórka się rozpada, a cytoplazma wraz ze zniszczonymi organellami wylewa się poza komórkę. Fragmenty komórki są fagocytowane w wywołaniem stanu zapalnego.

Apoptoza - ( z gr. `apo' `ptosis' - opadanie płatków ) to śmierć komórki, która jest procesem aktywnym, wymagającym olbrzymich nakładów energii związanych z aktywacją określonych genów i inicjacją zdarzeń biochemicznych i strukturalnych. Dotyczy jednej komórki. Następuje zmniejszenie rozmiarów komórki, chromatyna kondensuje się do postaci półksieżyca, następuje specyficzna fragmentacja chromatyny z wytworzeniem ciał apoptycznych. Fagocytoza bez stanu zapalnego.

„APO” - pozorne wyciekanie umierających komórek „PTOSIS” - usunięcie zniknięcie komórek z tkanki.

Apoptoza to programowana lub aktywowana śmierć komórki, nazywana śmiercią fizjologiczną lub samobójczą, zależną od indukcji specyficznych genów.

• embriogeneza ( między palcami u płodu jest błona pławna, której komórki ulegają apoptozie )

• morfogeneza

• tkanki proliferujace ( skóra, nabłonki )

• komórki układu odpornościowego ( dojrzewanie limfocytów CD4+)

• dojrzewanie limfocytów: tymocytów, komórek krwiotwórczych, rozwój komórek nerwowych w mózgu

• neurodegradacja, choroba : Alzheimera, Huntingtona, Parkinsona

• zaburzenia neurorozwojowe : autyzm, schizofrenia, limfocyty CD4+ (AIDS)

komórki nowotworowe umierają śmiercią samobójczą wywołaną spontanicznie lub indukowaną przez promieniowanie jonizujące i cytotoksyny

APOPTOZA= SAMOBÓJCZA ŚMIERĆ	NEKROZA = MARTWICA
Proces aktywny z wykorzystaniem ATP	Proces bierny, nie wymagający energii
Brak stanu zapalnego, cytopolazma umieszczona w ciałkach apoptycznych	Występuje stan zapalny, komórka pęka, cytoplazma wylewa się, wewnątrzkomórkowe antygeny są rozpoznawane przez układ immunologiczny jak obce i niszczone
Proces obejmujący jedną komórkę, polegający na programowaniu śmierci przez komórkę lub pobodzony w komórce przez komórki układu immunologicznego	Proces obejmujący wiele komórek, wywołany pojawieniem się czynnika uszkadzającego komórkę ( wirus, bakteria, toksyny)
Naturalny element życia komórki, nie związany z odpowiedzią immunologiczną	Śmierć przypadkowa wywołana dużą dawką czynników, zawsze związane z odpowiedzią immunologiczną
Komórka kurczy się ( traci wodę ), nienaruszone organella	Komórka pęcznieje ( nabiera wody ), ma naruszone organella
Kondensacja chromatyny w kształt półksiężyca	Chromatyna nie kondensuje się
Specyficzna fragmentacja DNA tej samej długości - oligomery nukleosomu DNA nawinięty na rdzeń histonowy	Niespecyficzna fragmentacja DNA cięte jest w różnych miejscach i fragmenty mają różną długość
Błony zachowują ciągłość, rozpadowi ulega tylko błona jądrowa	Pękają wszystkie błony w komórce łącznie z jądrową

Czynniki wywołujące apoptozę:

Przyczyn promujących programowaną śmierć komórki jest wiele są to czynniki:

• fizyczne - promieniowanie jonizujące, UV, szok termiczny

• chemiczne - cytostatyki, wolne rodniki tlenowe

• biologiczne - glukokortykoidy, czynnik martwicy nowotworów (TNF), przeciwciała anty Fas/Apo-1, niedobór substancji wzrostowych

w zależności od rodzaju czynnika, dawki i długości ekspozycji komórki na niego, a także typu komórki może dojść do aktywacji programu autodestrukcji, bądź komórka może ulec śmierci przypadkowej

ZMIANY MORFOLOGICZNE I BIOCHEMICZNE W KOMÓRCE I METODY ICH BADANIA

Błona komórkowa - obkurczanie się komórek, pofałdowanie błony widzialne w mikroskopie świetlnym.

1 wykrywanie zaburzeń w transporcie błonowym

• barwienie jodkiem etydyny, 7-aminoaktynoglicyną, jodkiem propidyny. Komórka zdrowa nie będzie się barwić, gdyż jodek zostanie wytransportowany na zewnątrz. W komórce we wczesnej fazie apoptozy również nie będzie zabarwienia, gdyż nadal działa transport błonowy, ale ze zmniejszoną sprawnością. W komórce apoptycznej/nekrotycznej zabarwienie już występuje

• badanie potencjału : pomiar lub zabarwienie

• rodamina B wnika tylko do żywych komórek

• w żywej komórce istnieje system esteraz, które zmieniają pochodne fluoresceiny (FAD) we fluorescencje, które świeci w mikroskopie fluorescencyjnym

2 zmiany w układzie fosfolipidów błony komórkowej

• fosfatydyloseryna w żywej komórce jest wew., w komórce we wczesnej apoptozie na zewnątrz komórki, a w zaawansowanej apoptozie na zew. Ciałkach apoptycznych

• cytometria przepływowa: próbka komórek przepuszczana jest przez cytometr, segregowana i zliczona. Odbywa się to na zasadzie światła rozproszonego, które im bardziej jest rozproszone tym jest więcej komórek. Do fosfatydyloseryny można przyłączyć aneksynę lub jodek pirydyny. Komórka żywa będzie wykazywać nieznaczne ( zerowe lub w przybliżeniu zera ) zabarwienie. W komórce we wczesnej fazie apoptozy wzrasta tylko pokrycie aneksyną, ponieważ prezentowana jest fosfatydyloseryna, ale pransport błonowy działa sprawnie. W komórce apoptycznej i nekrotycznej wzrasta pokrycie aneksyną i zabarwienie jodkiem potasu ( prezentacja fosfatydyloseryny z zaburzonum transportem błonowym). Komórki są liczone a wynikiem jest wykres z zaznaczonymi komórkami w różnych stanach. Komórki mogą znajdować się pomiędzy p0oszczególnymi stanami, gdyż mają różny transport błonowy. Występują płynne przejścia pomiędzy pokrywaniem fosfatydyloseryny i zaburzeniami transportu. Dzięki cytometrii można obliczyć % stadiów

ORGANELLA KOMÓRKOWE

1. Mitochondria

• zmiany potencjału w komórkach apoptycznych ( spada i rośnie ), u nekrotycznych tylko spada

• barwniki fluorescencyjne ( np. rodaminę 123) - w komórki wczesnej fazy apoptozy intensywnie świecą a nekrotyczne nie świecą wcale

• otwieranie kanałów VDCA i wypływ cytochromu c i białek diablo

• pęcznienie mitochondriów

• poziom wapnia w mitochondriach komórek apoptycznych wzrasta

2. Lizosomy - wybarwianie oranżem akrydyny, który wnikając do lizosomów komórki normalnej lub wczesnej fazy apoptozy, w ich kwaśnym srodowisku staje się czerwony

3. Jądra komórkowe - kondensacja chromatyny w postaci półksiężyca, widać w mikroskopie po barwieniu np. DAPI

• elektroforeza i drabinka apoptyczna, fragmenty jednakowej długości w apoptycznej komórce ( w nekrotycznej są różnej długości)

• cytometria przepływowa - wykrywanie zaburzeń w cyklu komórkowym, nie dochodzi do rozdzialania materiału komórkowego

• metody immunohistochemiczne - dołączanie znakowanych nukleotydów do końca 3'-OH nici DNA np. TUNEL z wykorzystaniem terminalnej transferazy

Aktywność enzymów i białek apoptycznych

• bardzo wiele metod badania, można badać aktywność kaspaz, endonukleaz, wykrywać białka biorące udział w apoptozie

ENZYMY BIORACE UDZIAŁ W APOPTOZIE

Rodzina kaspaz ( caspase - cysteine aspartic acid-specific enzymes) to układ proteaz, który aktywowany przez rózne czynniki, prowadzi do autodesrtukcji komórki. Zwiększenie aktywności kaspaz prowadzi do cięcia wybranych białek. Niektóre z tych białek są w ten sposób niszczone i inaktywowane, a inne przeciwnie w wyniku proteolizy stają się aktywne. Do substratów kaspaz należy wiele ważnych białek komórki. Większość tych białek uczestniczy w procesach molekularnych związanych z cyklem komórkowym i apoptozą. Kaspazy trawią między innymi takie białka jak:

1. podjednostka kinazy DNA-PK ( DNA- activated protein kinase ). Kinaza DNA-PK uczestniczy w wykrywaniu uszkodzeń jądrowego DNA komórki: aktywność enzymatyczna DNA-PK zwiększa się, kiedy materiał genetyczny ulegnie nagłym zniszczeniom. DNA-PK fosforyluje dużo różnych białek, między innymi słynne białko p53, które zatrzymuje cykl komórkowy i aktywuje białka uczestniczące w naprawie uszkodzeń DNA

2. białko PARP - które również może brać udział w rozpoznawaniu uszkodzeń i naprawie DNA

3. białko ICAD ( inhibitor of caspase-activated DNAse - inhibitor kaspaz aktywujących DNAze), które w żywych komórkach wiąże się z białkiem CAD ( caspase-activated DNAse -kaspaza aktywująca DNAze) i hamuje jego aktywnośc. Proteoliza białka ICAD pozwala na uruchomienie białka CAD, którego zadaniem jesi cięcie DNA umierającej komórki na fragmenty

4. białko Rb, które kontroluje przechodzenie komórki przez kolejne fazy cyklu komórkowego

5. białko Mdm2 - które wiąże się z białkiem p53 i reguluje jego stabilność: zwiększenie produkcji MDM2 prowadzi do przyśpieszonego niszczenia p53

6. Acinus (apoptic chromatin condensation inducer in the nucleus - induktor apoptycznej kondensacji chromatyny w jądrze ) - niedawno odkryte białko odpowiedzialne za kondensacje chromatyny jądrowej, która podczas apoptozy przybiera postać zbitych grudek gromadzących się przy obrzeżach jądra komórkowego

7. Niektóre białka szkieletu komórki np. laminy ( białka wyściełające wewnętrzną powierzchnię otoczki jądrowej ) aktyna i fodryna

8. Inne cząsteczki kaspaz

RECEPTORY ŚMIERCI

• receptory śmierci -TNFR, Fas/CD 95/Apo-1, DR3/TRAMP

• swoiste ligandy -TNF, Fas L, TRAIL

• białka uczestniczące w przekazywaniu sygnału apoptozy ( TRADD, FADD)

• domeny śmierci (dd)

• czynnik jądrowy (NK-kb)

receptor Fas znajdujący się na powierzchni komórki musi związać się z ligandem (FasL). Wytworzenie kompleksu ligand - receptor ( kompleks Fas-L) powoduje aopptoze komórki. Do cytoplazmatycznej strony receptora wiązane jest białko adaptorowe FADD, które zawiera dd (domenę śmierci). Dołączane są kolejne elementy do kompleksu np. pro-kaspazy powodujące uwalnianie enzymów z organelli komórkowych. Pro-kaspaza 8 działa na mitochondria uwalniając cytochrom c i kaspazę - eff, które tworzą kompleks powodujący degradacja białek i aktywacje DNAz co prowadzi do śmierci komórki.

Receptor TNF-R1 łącząc się z ligandem TNF, tworzy kompleks ligand - receptor aktywujący białko TRADD, które działa na mitochondria, dalej apoptoza przebiega jak w przypadku receptora Fas.

ENDONUKLEAZY

Podczas apoptozy występuje fragmentacja DNA na odcinki stanowiące wielokrotność nukleosomów ( 180 -200 par zasad )

Fragmentacja DNA nie występuje we wszystkich komórkach ulegających apoptozie

Przebieg fragmentacji możemy podzielić na dwa etapy:

Etap I - początkowo DNA jest cięte na fragmenty o długości 300 -50 tysięcy par zasad. Prawdopodobnie za ten proces odpowiedzialna jest topoizomeraza II

Etap II - wysokocząsteczkowe fragmenty są degradowane do nukleosomów i ich oligomerów, za fragmentację DNA odpowiedzialne są endonukleazy katalizujące rozerwanie wiązań międzynukleosomalnych.

Nie zidentyfikowano specyficznej endonukleazy odpowiedzialnej za fragmentacje DNA w komórkach ulegających apoptozie, choć bierze się pod uwagę trzy enzymy : NUC - 18, DNAzę I, DNAzę II

Aktywacja endonukleaz wymaga obecności jonów wapniowych i magnezowych, natomiast jony cynku silnie hamują ten proces. W apoptozie obserwujemy wzrost stężenia jonów wapniowych w cytozolu, co mogłoby powodować aktywacje endonukleaz

DFF40/CAD - czynnik fragmentacji DNA / kaspaza aktywująca DNAze

DFF45/CAD - inhibitor czynnika fragmentującego DNA / inhibitor kaspazy aktywującej DNAze

MITOCHONDRIA W APOPTOZIE

Rola mitochondriów w procesie uruchomienia programowanej śmierci jest szczególnie istotna. W mitochondriach znajduje się cytochrom c, będący składnikiem łańcucha oddechowego na wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Cytochrom c oprócz przenoszenia elektronów ma jeszcze jedną ważną funkcje - występując w cytoplazmie wywołuje apoptozę komórki. Cytochrom c łączy się w cytoplazmie z białkiem Apf -1 oraz proenzymem kaspazy 9. Taki kompleks nazywany jest apoptosomem i aktywuje kaspaze 9, uruchamiana jest kaskada i apoptoza komórki. Mitochondria mają w swojej błonie białka z rodziny bcl

Białka rodziny bcl-2

1. komórkowa grupa białek bcl -2 zawiera ponad 10 białek o przeciwstawnym działaniu np. Białka bcl -2 i bcl - xl blokują apoptoze natomiast białka bax i bak działają proapoptycznie

2. w grupie tych białek występuje homologia w zakresie określonych fragmentów ( domen ) łańcucha białkowego. Są to domeny BH1, BH2, BH3, BH4. Komórkowe bcl - 2 działa głownie przez domenę BH3

3. białka tej rodziny łączą się między sobą tworząc homo i heterodimery. Przewaga homodimerów , np. bcl - 2 decyduje o przeżyciu komórki, natomiast przewaga białek działających proapoptycznie ( bax, bak ) prowadzi do śmierci komórki.

4. Wirusy ( adenowirusy ) kodują białka o właściwościach podobnych do komórkowego bcl - 2. Są to białka krótkie, nie posiadające homologii w zakresie domen BH3 i BH4, dzięki czemu - naśladując działanie bcl-2 komórkowego - unikają możliwości tworzenia heterodimeru z proapoptycznie działającymi białkami

5. Bcl-x(L) może podtrzymywać przeżycie komórki poprzez regulowanie przepuszczalności międzykomórkowych błon, do których został wprowadzony

6. Gen supresorowy nowotworu, którego ekspresje zaobserwowano w PCD jest gen p53, rosnąca ilość białka p53 wpływa na aktywność genu bcl-2, powodując jego zmniejszenie, co jest równoznaczne z osłabieniem sygnałów przeżyciowych komórki

Działanie białek proapoptycznych

Niegdyś uważano, że białka z rodziny bcl łączą się z błoną mitochondrialną i tworzą w niej pory przez które wydostaje się cytochrom c. Jednakże dalsze badania wykazały, że białka bak i bax łączą się białkiem kanałowym błony mitochondrialnej VDCA ( voltage dependent chanel - napięciozależny kanał jonowy ). Kanał VDCA otwierany / zamykany jest przez napięcie elektryczne lub polianiony. Wg. Teori Shigeomi i Shimizu kanał ten w normalnych warunkach jest zamknięty i nieprzepuszczalny, dopiero po związaniu się z bak i bax ulega otwarciu, poszerzeniu tak aby mógł się wydostać do cytoplazmy cytochrom c. Wg innej teorii VDCA, bak i bax tworzą duży kanał błonowy.

Działanie białek blokujących apoptozę

Białko bcl-2 działa odwrotnie niż białka bak i bax. Przyłączając się do VDCA zamuka go i cytochrom c nie wydostaje się poza mitochondrium. W innej hipotezie bcl-2 łączy się z bax i hamuje jego działanie

Inne białka mitochondrialne uczestniczące a apoptozie

Bialko BIM - jest podobne w budowie do bcl -2, ale ma krótszą domene BH3. Bim występuje w limfocytach i biorą udział w przekazywaniu sygnału do apoptozy w limfocytach agresywnych i syntetyzujących duże ilości przeciwapoptycznego bcl-2. Limfocyty nie produkujące Bim są odporne sa sygnały i nie ulegają apoptozie. Aktywność białka bim jest potrzebna i do prwaidłowego rozwoju zarodkowego i do eliminowania nieprawidłowych komórek układu immunologicznego.

Białko AIF - niedawno odkryte białko biorące udział w apoptozie. AIF to białko będące czynnikiem indukującym apoptozę ( apoptic Inducting Factor ), nie wiadomo co do końca robi, ale gdy zablokowano je przeciwciałami powstrzymano niszczenie DNA, a tym samym zatrzymano apoptoze.

DIABLO - białko uwalniane z mitochondrium i w cytoplazmie atakuje białko IAP ( inhibitor apoptozy ). IAP jest zdolne połączyć się z kaspazami, hamując ich apoptyczne działanie . Diablo składa się z dwóch cząsteczek łączących się ze sobą w formule łuku. Kompleks ten łączy się na jednym koncu a białkiem IAP, a na drugim z kaspazami. Kaspazy uwolnione spod IAP łączą się z cytochromem c i Apfp-1 dając apoptozę.

Niewiele prac ukazało się na temat mechanizmów usuwania aopoptycznych komórek, jednakże mechanizmy te związane są ze zmianami w błonie komórek apoptycznych tj.:

1. Utratą terminalnych kwasów sialowych z glikoprotein znajdujacych się na powierzchni błony. Odsłonięte w wyniku tego procesu łańcuchy N-acetyloglukozaminy i galaktozy mogą reagować z błonowym receptorem lektynowym makrofaga usuwającym komórkę apoptyczna.

2. Utratą asymetrii fosfolipidowej, w wyniku której następuje ekspozycja fosfatydyloseryny na powierzchni komórki apoptycznej. Z odsłonięta fosfatydyloseryną łączy się receptor makrofagów, dając sygnał do apoptozy.

3. Tworzeniem się mostków molekularnych pomiędzy komórką apoptyczną a fagocytującą. Mostki te mogą powstawać na skutek wiązania receptora trombospondynowego znajdującego się na błonie komórki apoptycznej z trombospondyną związaną z receptorem witronektynowym vb3 ( białko z rodziny integryn ), połączonym z cząsteczką CD34 i znajdującej się na komórce fagocytującej.

SZLAK APOPTYCZNY

Limfocyty T mają na swojej błonie receptory Fas które łączą się z receptorami Fas komórek podejrzanych. Związanie ligandu przez receptor Fas aktywuje FADD. Białko FADD po związaniu z kompleksem FAS-L aktywuje kaspazę 8, a ta rozpoczyna szlak kaspaz. Kaspaza 8 działa na mitochondria, które uwalniają cytochrom c , który tworzy kompleks apoptyczny z Apaf-1 i kaspazą 9. Taki kompleks oddziałuje na pro-kaspazę 3. Aktywowana kaspaza 3 wywołuje zmiany morfologiczne w komórce i działa na kaspaze 6. Aktywna kaspaza 6 wnika do jądra powodując zmiany w chromatynie, która się kondensuje w kształt półksiężyca. Podobny efekt daje białko CAD, które dzięki kaspazie 3 jest uwalniane z kompleksu ICAD-CAD ( nastepuja aktywacja inhibitora kaspaz aktywujących DNAze). CAD aktywuję DNAze, która tnie DNA na specyficzne fragmenty ( zabezpieczenie przed niepożądaną transfekcją genów apoptycznych ). Powinny zacząć działać białka naprawy DNA- jest to niepożądane gdyż opóźniałoby apoptozę. Dlatego kaspazy niszczą białka naprawy DNA (DNA-PK, PARP, p53). Kaspaza 3 wywołuje zmiany w połozeniu fosfatydyloseryny w błonie komórkowej. Następuje prezentacja fosfatydyloseryny na zewnątrz komórki, co jest rozpoznawane przez układ odpornościowy. Równocześnie zachodzi przebudowa cytoszkieletu ( efekt aktywacji kaspazy3) - błona komórkowa fałduje się, komórka zmniejsza swoją objętość, zaczynają się tworzyć ciałka apoptyczne. Zmianom ulega także jądro komórkowe, które na skutek braku lamin aktyn ( cyto i karioszkieletu) rozpada się. Kaspaza 8 aktywuje kaspaze 7 , co uwalnia transglutaminazę tkankową pofragmentowane DNA. Ciałka prezentują fosfatydyloseryn, która jest rozpoznawana przez białka PSR na komórkach żernych. Komórki żerne rozpoznają ciałka apoptyczne i je fagocytują.

Limfocyty mogą zmuszać podejrzane komórki do apoptozy przez wydzielanie perforyny i granzyny. Perforyna tworzy w błonie komórkowi przeznaczonej do apoptzy pory którymi do wnętrza wnika granzyna, a ta atakuje szlak kaspaz.

Apoptoza a nowotwory

Komórki nowotworowe omijają parę zabezpieczeń, aby nie ulec apoptozie. Uciekają przed atakiem limfocytów które mogłyby pobudzić apoptozę poprzez:

• brak białek powierzchniowych Fas, lub blokują FasL na limfocytach i nie dochodzi do rozpoznania

• wytwarzanie białek bcl-2 zamykających mitochondria

• niszczą białko p53, które po wykryciu mutacji powinno uruchomić apoptoze

• brak fosforylacji białka Rb

• nie pokazują fragmentów białek wewnątrzkomórkowych i stają się niewidoczne dla cytotoksycznych limfocytów T

• mają uszkodzone geny kodujące kaspazy, co zmniejsza wrażliwość na apoptozę

• posiadają telomerazę, która odbudowuje telomery na końcahc chromosomów. W normalnych komórkach po skróceniu się telomerów na maxa powinna zajść apoptoza, ale komórka nowotworowa pokonała tę barierę właśnie dzięki telomerazie

APOPTOZA A WIRUSY

Infekcje wirusowe powodują wyłączenie apoptozy na podobnej zasadzie co w komórkach nowotworowych: brak białek p53, nie pokazywanie antygenów w MHC, nie ma fosforylacji białka Rb. Wirus HIV ma opracowana inną taktykę na unikanie apopotzy komórek w których się namnaża. Wirus produkuje białko GP120, które łączy się z cząsteczką CD4+ na zainfekowanym limfocycie T komórka zaczyna prezentować Fas, na którym jest ligand dla FasL komórki nie narażonej. Związanie się obu receptorów powoduje, że komórka nie zarażona ulega apoptozie.

Nagroda Nobla

Tegoroczna nagroda Nobla (2002) w dziedzinie fizjologii i medycyny przyznano trzem uczonym - Sydneyowi Brennerowi, Johnowi E. Sulstonowi H. Robertowi Horvitzowi za odkrycia związane z genetyczną regulacją rozwoju narządów i śmierci programowanej komórki. Ich dokonania mają wielkie znaczenie dla medycyny i pozwalają na wyjaśnienie przyczyn i przebiegu wielu chorób, takich jak rak, udar mózgu, reumatoidalne zapalenie stawów czy AIDS.

WYKŁAD 6

Sygnalizacja miedzykomórkowa

Skuteczna komunikacja miedzy pojedynczymi komórkami jest warunkiem prawidłowego funkcjonowania organizmu jako całości. Zdolność do reagowania komórek na sygnały z otaczającego środowiska jest niezbędna dla ich prawidłowego funkcjonowania i warunkuje ich przeżycie. W organizmie wielokomórkowym komórki dzięki wymianie informacji mogą koordynować swe działanie reagując różnie w zależności od stale zmieniającej się sytuacji. Docierająca do komórki informacja jest najczęściej „zakodowana” i występuje pod postacią związku chemicznego ( aminokwasy, substancje metaboliczne, białka, hormony, kwasy tłuszczowe, peptydy, witaminy ) lub bodźca fizycznego (światło). Związki chemiczne będące nośnikami informacji określane są mianem substancji sygnałowych.

Mnogość substancji w otoczeniu komórki ( „chaos informacyjny”):

• dana komórka w zależności od spełnianej funkcji musi posiadać sposób na selektywny odbiór jedynie pewnych sygnałów, przy zupełnym pominięciu innych

• komórka zareaguje na daną substancje jeśli posiada dla danej substancji receptor

RECEPTORY KOMÓRKOWE - wyspecjalizowane struktury białkowe zdolne do odbioru, przekształcenia i przekazania do różnych elementów efektorowych komórki informacji ze środowiska zewnętrznego. Związki łączące się z receptorami to ligandy.

Połączenie się liganda z receptorem:

1. Agoniści - czyli ligandy, które po połączeniu się z receptorem wywoła zmianę jego konformacji, a w konsekwencji tego uruchomienie pewnej kaskady zdarzeń wewnątrz komórki. Zdolność agonisty do pobudzania receptora nazywamy jego aktywnością wewnętrzną

2. Antagonista - czyli ligand, który ma wprawdzie zdolność do łączenia się z receptorem, ale nie jest w stanie spowodować zmiany jego konformacji, Antagonista nie posiada więc aktywności wewnętrznej

Nadmierne bądź niedostateczne oddziaływania ligandów na receptory - receptory mogą ulegać zmianom adaptacyjnym tzn. dochodzi do odpowiedniego nasilenia lub osłabienia odpowiedzi fizjologicznej przebiegającej przy udziale receptorów. Rozpatrując reakcje ligandów z ich receptorem stwierdzamy, że :

1. pomimo ograniczonej liczby rodzajów receptorów na poszczególnych komórkach mogą one reagować na pobudzenie w bardzo złożony różnorodny sposób ( różne efekty wywołane przez substancje sygnałowe działające na komórkę jednocześnie, w różnych kombinacjach)

2. jedna cząsteczka sygnałowa wiążąc się z jednym receptorem może wywołać w danej komórce wiele równoczesnych efektów (np. wpływać na ekspresje genów zmieniając jej metabolizm i kształt , pobudzać ją do ruchu itp.)

3. ta sama cząsteczka sygnałowa może wywołać różne efekty w różnych komórkach ( łączenie się z różnymi typami receptorów lub z odmiennymi wewnątrzkomórkowymi systemami przekazywania informacji i odmiennymi wewnątrzkomórkowymi obiektami docelowymi np. acetylocholina powoduje skurcz mięśni gładkich oskrzeli, wzrost sekrecji w komórkach gruczołu ślinowego i inne.

Sposoby kontaktowania się między sobą komórek

1. sygnalizacja endokrynowa - sposobem komunikowania się komórek jest wydzielanie substancji sygnałowej do krwioobiegu. Sygnał po pewnym czasie dociera praktycznie do wszystkich komórek organizmu i pobudza te z nich które posiadają odpowiednie receptory ( tzw. sygnalizacja hormonalna)

2. sygnalizacja parakrynowa - ( różnica ) wydzielana substancja sygnałowa jest mediatorem lokalnym i działa wyłącznie na komórki znajdujące się w najbliższym otoczeniu

3. sygnalizacja neuronalna - ( nerwowa) bardzo szybka, wybiórcza forma sygnalizacji międzykomórkowej, mogąca działać na duże odległości

4. sygnalizacja bezpośrednia - komórki znajdujące się blisko siebie są we wzajemnym ze sobą kontakcie przez cząsteczki sygnałowe zawarte w ich błonach komórkowych

Stosunkowo nieduża liczba sygnałów działających na różne receptory w różnych kombinacjach, zapewnić może kompleksową i subtelną kontrolę nad zachowaniem się komórki

Receptor przeprowadza tylko początkowy etap przenoszenia sygnału ( wstępne przekształcenie receptora ) :

• odbiera on sygnał zewnątrzkomórkowy i wytwarza kolejny sygnał wewnątrzkomórkowy ( pierwszy z etapów przenoszenia sygnału )

• w zależności od typów uaktywnionych szlaków zjawiska te prowadzą ostatecznie do odpowiedzi efektorowej komórki.

Ostateczna odpowiedź komórki jest wypadkową kolejnego, często wieloetapowego przekazywania informacji z jednego zestawu cząsteczek sygnalizacyjnych do drugiego, następnie do trzeciego, itp. - tworzą się tzw. kaskady sygnalizacyjne, prowadzące ostatecznie do bardzo różnorodnej odpowiedzi efektorowej, jak np. do aktywacji enzymów, wpływu na ekspresje genów, odpowiedzi ruchowej komórki przez oddziaływanie na jej cytoszkielet ( chemokiny ), itp.

Rola kaskad sygnalizacyjnych :

1. przenoszą sygnał od miejsca odbioru, do elementów efektorowych komórki, często znacznie oddalonych od receptora;

2. dokonują przekształcenia sygnału w taką jego formę, która wywołuje powstanie ostatecznej odpowiedzi

3. często powodują wzmocnienie sygnału, w stopniu umożliwiającym silna odpowiedź, przy niewielkiej stymulacji pierwotnej;

4. rozprowadzają sygnał do różnych regionów komórki i umożliwiają jego zróżnicowany, równoczesny wpływ na różnorodne procesy, co staje się podstawą do kompleksowej odpowiedzi komórki

5. poprzez wzajemny wpływ na siebie różnych kaskad dochodzi do modulowania sygnału w różny sposób

Kaskady sygnalizacyjne funkcjonują jak seria przełączników molekularnych, których działanie polega na aktywacji lub dezaktywacji różnych substancji

Wyróżnić możemy jedynie dwa mechanizmy działania białek będących przełącznikami molekularnymi:

1. grupę pierwszą stanowią białka wiążące GTP. To czy są one aktywne czy nie aktywne zależy od tego czy w danej chwili związane są z GTP, czy też z GDP

2. druga grupa to białka aktywowane przez fosforylacje ( kinazy białkowe i fosfatazy białkowe ). Ponieważ same kinazy białkowe są również z reguły aktywowane przez fosforylacje, a następnie mogą fosforylować, czyli uaktywniać kolejne kinazy, często używa się określenia kaskady fosforylacyjne

KLASYFIKACJA RECEPTORÓW

Cząsteczki sygnalizacyjne można podzielić na dwie zasadnicze grupy:

1. najliczniejsza grupa cząsteczek o stosunkowo dużych wymiarach i małej lipofilności, które nie są w stanie przeniknąć swobodnie przez błonę komórkową - dlatego białka będące receptorami dla tych cząsteczek muszą być wbudowane w błonę komórkową komórki docelowej

2. grupę cząsteczek dostatecznie małych i hydrofobowych, by móc swobodnie dyfundować przez błony komórkowe - receptory dla tych substancji zlokalizowane być mogą we wnętrzu komórki

W zależności od wspomnianej lokalizacji receptora, jego budowy, szybkości przepływu informacji oraz ze względu na charakter sygnału wewnątrzkomórkowego, jaki wytwarza receptor po związaniu zewnątrzkomórkowej substancji sygnalizacyjnej, dokonać można dalszych podziałów cząstek receptorowych

Receptory komórkowe dzieli się w następujący sposób:

1. receptory zewnątrzkomórkowe : jonotropowe ( receptory związane z kanałami jonowymi ); metabotropowe ( receptory związane z białkami G ); katalityczne ( receptory związane z enzymami ).

2. Receptory wewnątrzkomórkowe : cytoplazmatyczne i jądrowe

Klasyfikacja receptorów

Receptory bezpośrednio związane z kanałem jonowym

Receptory sprzężone z białkiem G

Receptory związane z kinazą trypzynową lub kinazą serynowo -treoinową

Receptory wewnątrzkomórkowe

WYSTĘPOWANIE W KOMÓRCE

Błona komórkowa

Błona komórkowa

Błona komórkowa

Cytoplazma i jądro komórkowe

SYSTEM EFEKTOROWY

Kanał jonowy

Kanał jonowy lub enzym

Kinaza tyrozynowa, kinaza seryno- treponinowa

Transkrypcja genów

POŁĄCZENIE Z UKŁADEM EFEKTOROWYM

bezpośrednie

Poprzez białko G

najczęściej bezpośrednie

Poprzez DNA

CZAS UZYSKANIA ODPOWIEDZI PO POBUDZENIU RECEPTORA

milisekundy

sekundy

minuty

Godziny

PRZYKŁADY RECEPTORÓW

Cholinergiczny - nikotynowy, GABA, NMDA

Adrenergiczny, dopaminowy, aerotoninowy, histaminowy

Insuliny, cytokiny, IgE

Hormonów steroidowych, tyroksyny, RZR alfa, RZR beta

RECETORY JONOTROPOWE - receptory dla szybkich neuroprzekaźników

Receptory te zwane są również receptorami związanymi z kanałami jonowymi bramkowanymi przekaźnikami nerwowymi. Właściwości odróżniające ten typ receptorów od zwykłych porów transbłonowych to:

• przede wszystkim wykazują one selektywność jonową, czyli przepuszczalność tylko dla pewnych ściśle określonych jonów.

• W przeciwieństwie do porów kanały jonowe nie są cały czas otwarte. Ma to kluczowe znaczenie, gdyż umożliwia zachowanie odrębności wnętrza komórki od środowiska zewnętrznego

• Mają miejsce wiązania ligandu do aktywacji- inaktywacji kanału

W skład receptora jonotropowego wchodzi najczęściej kilka podjednostek i centralny kanał jonowy. Każda z podjednostek ma specyficzną budowę: składa się mianowicie z kilku odcinków transbłonowych, z których co najmniej jeden może otwierać lub zamykać kanał jonowy.

Sposób działania receptorów jonotropowych ( najprostszy ze wszystkich wymienionych grup receptorów ):

Związanie cząsteczki sygnałowej, najczęściej przekaźnika nerwowego, receptor zmienia swoją konformacje w taki sposób, że prowadzi do otwarcia lub zamknięcia kanału jonowego

Otwarcie kanału jonowego prowadzi do bardzo szybkiego wpływania jonów, co w następstwie prowadzi do zmiany potencjału transbłonowego

......

Przykłady białek G, ich efektorów i przykładowe stymulatory

typ	efektor	Stymulator receptora
Gs	Cyklaza adenylanowa (+), kanał wapniowy, kanał potasowy, Ca2+, Mg2+, ATPaza	Adrenalina, glukagon, ACTH, noradrenalina, parathormon, kalcytonina
Go	Fosfolipaza C(-), kanały wapniowe( typu N i L ) kanały potasowe	Adenozyna, dopamina, enkefaliny, somatostatyna, acetylocholina, peptyd Y, APT
Gt	Fosfodiesteraza cGMP	Światło
Gi	Cyklaza adenylanowa (-), fosfolipaza A2, kanały wapniowe, kanały potasowe, sodowe i chlorkowe	Adrenalina, jony Ca2+, angiotensyna II, adenozyna, bradykinina
G?	Fosfolipaza C fosfatydylo - inzytologlikanów	Insulina
Gz	Fosfolipaza C (+) , kanały potasowe	Substancja P
G?	Fosfolipaza A2	Noradrenalina
Gq	Fosfolipaza C ( typ beta ) (+) kinaza MAP	Giotensyna, somatostatyna, mitogeny

Białkami docelowymi dla aktywnych składowych białek G mogą być :

1. kanały jonowe - po związaniu z fragmentami białka G dochodzi do otwarcia lub zamknięcia kanału jonowego np. mechanizm regulacji częstości akcji serca przez układ przywspółczulny uwolniona - acetylocholina wiąże się z receptorem M, aktywacji i rozpadowi ulega białko G, podjednostka alfa wiąże GTP, uwolniony na tej drodze kompleks podjednostki B gamma łączy się z cytoplazmatycznym fragmentem kanału potasowego komórki mięśnia sercowego, powodując jego otwarcie

2. enzymy błonowe - najczęstszymi enzymami docelowymi dla białka g są cyklaza adenylowa i fosfolipaza C ( odpowiedz znacznie wolniejsza i bardziej złożona, gdyż stanowi najczęściej dopiero początek całej często złożonej kaskady sygnalizacyjnej)

II a - szlak cyklazy adenylowej

Receptor na powierzchni wiąże ligand, aktywuje się białko G, które uruchamia cyklaze adenylanowa. Oddziaływanie receptora matebotropowego na cyklaze adenylową po ich związaniu, prowadzi do gwałtownego wzrostu w komórce stężenia cyklicznego AMP ( cAMP ) cAMP jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, może z miejsca powstania z łatwością dyfundować do różnych rejonów komórki. cAMP powodować może cały szereg efektów biologicznych , takich jak rozpad glikogeny, rozpad trójgliceroli, przyspieszenie akcji serca, wzrost wydzielania kortyzolu i inne. Spowodowane jest to oddziaływaniem cAMP na dalsze składowe kaskady sygnalizacyjnej. Aktywacja kinazy białkowej A przez cAMP ( kinaza białkowa zależna od cyklicznego AMP) prowadzić może do fosforylacji reszt treoniny i seryny w innych białkach enzymatycznych ( zmiana aktywności białek ) lub powodować fosforylacje regulatorowych białek genów ( wpływać na transkrypcje )

II b - szlak fisfolipazy C

Aktywne białko G uruchamia fosfolipazę C, która powoduje rozpad obecnego w wewnętrznej warstwie błony komórkowej fosfolipidu - fosfatydyloinozytolu na trójfosforan inozytolu (IP3) i dwuacyloglicerol ( DAG)

DAG jest cząsteczka lipofilną i jest związany z błoną komórkową - aktywuje przy współudziale jonów wapnia specyficzną dla siebie kinazę białkowa C, która fosforyluje szereg białek wewnątrzkomórkowych. IP3 jako cząsteczka hydrofilna dyfunduje do cytozolu i w obrębie retikulum endoplazmatycznego wiąże się z kanałami wapniowymi otwierając je. Stężenia wapnia ( w formie Ca2+ ) znacznie wzrasta - kalmodulina przyłączając jony wapnia zmienia swą konformacje, co umożliwia jej wiązanie się i oddziaływanie na funkcje innych licznych białek enzymatycznych np. kinazy CaM, wpływając na liczne procesy komórkowe przez fosforylowanie wybranych białek. W tej grupie także znajdują się receptory bardzo szybkie, jak np. fosforeceptory rodopsynowe w oku

RECEPTORY O AKTYWNOŚĆI ENZYMATYCZNEJ ( receptory katalityczne )

Receptory związane z kinazą tyrozynowa ( fosforylacja bocznych łańcuchów tyrozyny w białkach komórkowych ) lub kinaza serynowo-treoninową. Są to receptory różnorodnych cytokin, immunoglobulin, limfocytów T, oraz niektórych hormonów np. insuliny.

Budowa receptorów katalitycznych: dwa duże łańcuchy polipeptydowe - zewnątrzkomórkowy ( domena wiążąca receptor ) i wewnątrzkomórkowy ( domena katalityczna receptora ) oba łańcuchy połączone są krótkimi łańcuchami transbłonowymi o strukturze alfa - helisy

Przykład działania receptorów katalitycznych - nieaktywna receptorowa kinaza tyrozynowa wiąże swoimi domenami cząsteczkę sygnałową w formie dimeru. Kinazy ulegają aktywacji, co objawia się ufosforylowaniem ich reszt tyrozynowych z którymi mogą się wiązać wewnątrzkomórkowe białka sygnalizacyjne. Jednym z nich może być białko adoptorowe wiążące białko aktywujące Ras. Nieaktywne białko Ras znajduję się na wewnetrznej powierzchni błony komórkowej i jest związane z GDP. Białko aktywujące Ras podstawia w miejsce GDP GTP, co aktywuje białko Ras i następuje dalsze przekazywanie sygnału.

RECEPTORY WEWNĄTRZKOMÓRKOWE

31

---