Inicjacja replikacji
Inicjacja, czyli poczatek replikacji zachodzi w scisle okreslonych miejscach na nici DNA. Miejsca te nazywaja sie "origin" (w skrocie ori). Zawieraja one specyficzne sekwencje, sluzace im do:
wiazania bialek inicjatorowych,
rozdzielenia nici i rozpoczecia procesu replikacji,
przylacznia bialek wspomagajacych proces replikacji.
Miejsce inicjacji jest bardzo wazne, poniewaz tylko tu moze odbywac sie kontrola repikacji. Raz rozpoczety proces musi przebiegac az do zakonczenia syntezy calego replikonu. U bakterii replikon obejmuje caly genofor, znaczy to, ze pojedyncze miejsce inicjacji kontroluje replikacje calego genomu. Organizmy eukariotyczne natomiast, maja wiele replikonow w kazdym chromosomie. Dzieki tej roznicy szybkosc replikacji genomu eukariota wielokrotnie przewyzsza szybkosc replikacji genomu prokariota.
Rozdzielajace sie w miejscu syntezy lancuchy matrycowego DNA tworza tzw. "widelki replikacyjne". O rozdzieleniu heliksu DNA decyduja bialka enzymatyczne zwane helikazami. Wykorzystuja one energie hydrolizy ATP do zmiany ksztaltu swojej czasteczki (podobnie jak bialka miesniowe), co umozliwia im wykonanie pracy mechanicznej. Helikazy przesuwaja sie wzdluz dwuniciowego DNA, rozdzielajac nici i poszerzajac widelki replikacyjne.
Najwazniejszymi enzymami odpowiedzialnymi za replikacje DNA sa polimerazy DNA. Nie maja one jednak zdolnosci do samodzielnego rozpoczecia syntezy lancuchow DNA, moga jedynie je wydluzac. Z tego powodu synteza DNA zaczyna sie od wbudowywania starterowych odcinkow RNA, ktore zakonczone sa wolna grupa -OH, na koncu 3'. Za wbudowywanie tych odcinkow odpowiedzialne sa wyspecjalizowane enzymu zwane primazami.
Zatem kolejne etapy inicjacji replikacji to:
przylaczenie sie helikaz do odpowiednich sekwencji inicjatorowych,
rozplatanie podojnego heliksu i powstanie widelek replikacyjnych,
synteza starterowych odcinkow RNA przez primazy,
Elongacja replikacji
Porces elongacji, podobnie jak proces inicjacji, wymaga udzialu wielu bialek enzymatycznych. Oprocz polimeraz DNA, glownych enzymow replikacji, potrzebnych jest wiele enzymow odpowiedzialnych za katalizowanie reakcji analogicznych do przeprowadzanych podczas inicjacji replikacji (rozplatywanie i stabilizacja nici, wbudowywanie starterow). Wszystkie te bialka tworza kompleks zawany replisomem.
Polimerazy syntetyzujace potomne nici DNA nie tylko nie sa zdolne do rozpoczecia replikacji (patrz inicjacja replikacji), lecz rowniez przylaczanie przez nie nukleotydow moze sie odbywac wylacznie do grup -OH (konca 3') starterow RNA. Zatem replikacja DNA przebiega tylko w jednym kierunku - od 5' do 3' konca. Odwrotna orientacja nici w obrebie podwojnego heliksu pozwala na ciagla synteze tylko jednej nici (tzw. nici wiodacej). Druga natomiast musi byc w postaci krotkich fragmentow , dolaczonych do odcinkow starterowych (jest to tzw. nic opozniona). Fragmenty te nazwano, na czesc odkrywcy, fragmentami Okazaki.
Wytworzenie wiazania estrowego miedzy reszta fosforanowa a deoksyryboza, katalizowane przez polimerazy, wymaga dostarczenia energii. Jak w wiekszosci syntez komorkowych, tak i tu energia pochodzi z wysokoenergetycznych wiazan miedzy resztami kwasu fosforowego. Czasteczka DNA jest zbudowana z monofosfonukleotydow. Natomiast substratami do synezy nowej nici w procesie replikacji sa trifosfonukleotydy (ATP, CTP, GTP, TTP), wiec dolaczenie jednego nukleotydu wiaze sie z rozerwaniem dwoch wiazan wysokoenergetycznych.
W fazie elongacji procesu replikacji bierze udzial kilka polimeraz, roznizcych sie funkcjonalnie:
polimeraza I - jej rola jest usuwanie odcinkow starterowych z fragmentow Okazaki oraz wycinanie uszkodzonych odcinkow DNA w procesie naprawy,
polimeraza II - niestety funkcja metaboliczna tego enzymu nie jest dokladnie poznana, wiadomo natomiast, ze wykazuje aktywnosc egzonukleolityczna,
polimeraza III - jest wlasciwa replikaza DNA, jej glowna funkcja jest wstawianie nowych nukleotydow na koncu 3' nowopowstajacej nici DNA.
Funkcje polimeraz omowiono na podstawie organizmow prokariotycznych, lecz ze wzgledu na podobienstwo tych funkcji wzgledem eukariontow nie zachodzi potrzeba oddzielnego ich omowienia. Na uwage zasluguje jednak fakt, ze organizmy eukariotyczne maja dodatkowa polimeraze, odpowiedzialna za replikacje DNA jadrowego.
Kolejnymi, nie wspomnianymi dotad, enzymami koniecznymi do przeprowadzenia procesu replikacji przez komorke sa ligazy. Ich zadaniem jest laczenie fragmentow Okazaki (juz po wycieciu starterow przez polimeraze) w jedna dluga nic. Ligazy bakteryjne wymagaja NAD jako koenzymu i zrodla energii, natomiast ligazy eukariotyczne wykorzystuja do tego celu ATP.
Podsumowujac - na proces elongacji skladaja sie:
synteza fragmentow Okazaki, z wykorzystaniem odcinkow starterowych,
naprawa ewentualnych bledow, powstalych podczas trwania procesu,
wyciecie fragmentow RNA, sluzacych za startery,
laczenie (ligacja) odcinkow Okazaki w jedna dluga nic.
Terminacja replikacji
Terminacja jest koncowym etapem replikacji, w ktorym dochodzi do polaczenia DNA w kompletne chromosomy i rozdzielenia ich pomiedzy komorki potomne. Mechanizmy terminacji u prokaroiota i eukariota znacznie roznia sie sie od siebie.
U organizmow prokariotycznych, gdzie na kolistym genoforze znajduje sie tylko jeden replikon, za koncowy etap replikacji odpowiedaja 4 sekwencje nukleotydowe , wiazace sie z bialkiem terminacyjnym. Bialko to bedac inhibitorem replikacji, hamuje caly proces.
U eukariontow sytuacja przedstawia sie inaczej. Wystepowanie kilku repikonow w replikujacym sie chromosomie powoduje, ze do zakonczenia replikacji wystarczy fizyczne zetkniecie sie dwoch podazajacych ku sobie w przeciwnych kierunkach widelek replikacyjnych. Nie potrzeba tu specjalnych sekwencji terminalnych.
Odmiennie przedstawia sie sytuacja z zakonczeniem syntezy chromosomow. W przeciwienstwie do kolistych genoforow bakteryjnych, chromosomy eukariotyczne zbudowane sa z liniowych czasteczek DNA. Gdyby replikacja u organizmow eukariotycznych konczyla sie analogicznie do prokariota to ostatni kilkunukleotydowy fragment pozostawalby niedoreplikowany. Na koncu kazdego chromosomu istnieja jednak charakterystyczne sekwencje, ktore pozwalaja na utrzymanie niezmiennej dlugosci genomow. Sekwencje te zwane sa telomerami. Telomery odpowiadaja rowniez za ochrone DNA przed laczeniem sie z innymi chromosomami.
Replikacja telomerow zachodzi w sposob odmienny od reszty chromosomu. Odpowiada za nie specjalny enzym zwany telomeraza. Jest to enzym, ktory w swoim centrum aktywnym zawiera matryce do syntezy telomerow - czasteczke RNA. Starterami w tym procesie sa koncowe sekwencje telomeru pozostalego z poprzedniego cyklu replikacyjnego.
Zatem na terminacje replikacji skladaja sie nastepujace procesy:
zakonczenie syntezy nowych nukleotydow w odpowienich miejscach,
polaczenie powstalego DNA w kompletne chromosomy,
rozdzielenie chromosomow pomiedzy komorki potomne.
I tak oto osiągnęliśmy etap pierwotnego transkryptu, który aby stać się matrycą w syntezie białka , musi ulec zasadniczym modyfikacjom. Polegają one na wycięciu intronów oraz ( co jest charakterystyczne dla większości pre-mRNA ) dodaniu na 3' końcu długiego fragmentu tzw. poli A.
Schemat obrazujący procesy zachodzące na drodze od DNA do mRNA
Poliadenylacja
Znakomita większość produktów reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA zawiera na swoim 3' końcu tzw. ogon poli A, tj. ciąg liczący od 100 do 250 połączonych ze sobą nukleotydów adeninowych. Nie znaczy to jednak, że w większości genów znajduje się obszar bogaty w pary AT. Fragment poli A nie jest efektem transkrypcji a posttranskrypcyjnej modyfikacji, w której udział bierze enzym zwany polimerazą poli A.
Polimeraza poli A dodaje na 3' końcu pierwotnego transkryptu kolejne nukleotydy adeninowe dopiero po zadziałaniu specyficznej nukleazy tj. enzymu tnącego kwas nukleinowy w obrębie jego cząsteczki. Okazuje się bowiem, że ogon poli A nie jest dołączan y do ostatniego nukleotydu wbudowanego na drodze transkrypcji, a do tego, który stał się ostatnim po rozcięciu nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA). Miejsce atakowane przez nukleazę nie jest dowolne, wyznacza je sekwencja: AAUAAA położona w różnej odległości od przeznaczonego m iejsca działania enzymu.
I tak na przykład u ssaków cięcie następuje w odległości 10 - 30 nukleotydów za sekwencją AAUAAA.
Mechanizm poliadenylacji pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA)
Istnieją geny zawierające więcej niż jeden sygnał poliadenylacji ( tj.wspomnianą sekwencję ). Oznacza to, że na ich matrycy powstanie kilka pierwotnych transkryptów różniących się długością , a co za tym idzie kilka różnych mRNA. Przykładem alterna tywnej poliadenylacji może być modyfikacja pierwotnego transkryptu szczurzego genu kodującego kalcytoninę.
Gen ten zawiera dwa miejsca poliadenylacji, z których pierwsze preferowane jest w komórkach tarczycy a drugie w mózgu.
Ogon poli A podobnie jak struktura czapeczki chroni cząsteczkę pierwotnego transkryptu przed działaniem nukleaz. Może on mieć również znaczenie w translacji, okazuje się bowiem, że transkrypt pozbawiony ogona poli A jest mniej wydajną matrycą przy sy ntezie białka.
Wycinanie intronów
Zanim powstanie ostateczny, dojrzały mRNA mogący ulec translacji, pre-mRNA musi zostać pozbawiony intronów. Proces wycinania tych niekodujących "wtrętów" zwany jest splicingiem i wykorzystuje jeden wspólny dla eliminacji wszystkich intronów aparat enzymatyczny.
Oznacza to, że introny muszą mieć jakieś wspólne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z porównywania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobieństwa:
na 5' końcu zawierają zawsze kolejno: resztę guaninową i uracylową (5'- GU)
na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona resztą adeninową (AG - 3')
wewnątrz zawierają tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy.
Sygnały splicingowe
Mechanizm splicingu
Wycinanie intronów, jak każdy proces przeprowadzany przez organizm żywy, jest skomplikowane. Wyróżnić w nim można kilka etapów:
1. Rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' końcu intronu).W wyniku tej reakcji następuje uwolnienie 5' końca fosforanowego egzonu 1.
2. Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozgałęzienia ) na 5' grupę fosforanową nukleotydu guaninowego intronu. Jak wiadomo wiązania między kolejnymi nukleotydami to wiązania fosfodiestrowe tworzone między tzw. 5' grupą fosforanową a gru pą hydroksylową ( -OH ) rybozy. Zwykle do wiązania tego angażowana jest grupa 3'-OH, niemniej jednak inne reszty hydroksylowe m.in. 2' posiadają zdolność do interakcji z resztą fosforanową. I tak nukleotyd adeninowy ( z miejsca rozgałęzienia ) mając grup ę 3'-OH wykorzystaną w "normalnym" wiązaniu fosfodiestrowym do interakcji z resztą fosforanową 5' intronu angażuje grupę 2'-OH. Tworzy się tu wiązanie 2'-5' fosfodiestrowe.
3. Atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu 1 na 5' grupę fosforanową egzonu 2 z uwolnieniem intronu mającego postać lassa.
Mechanizm splicingu pre-mRNA (kolejność powstawania wiązań)
Spliceosom
Opisane powyżej reakcje nie zachodzą samoistnie. Są one katalizowane przez kompleks przyłączających się kolejno cząstek tworzących spliceosom. W skład aparatu splicingowego wchodzi pięć rodzajów snRNP ( snRNA + białka ): U1, U2, U4, U5 i U6, z który ch każdy pełni odrębną, istotną funkcję:
U1- łączy się z miejscem splicingowym 5'i 3' na zasadzie komplementarności, zawiera on bowiem w swej rybonukleinowej komponencie sekwencję komplementarną do styków egzon-intron;
U2- wiąże miejsce rozgałęzienia;
U6- katalizuje splicing, występuje w kompleksie z U4 i U5.
Sposób działania spliceosomu
Produktem splicingu jest dojrzały mRNA niosący same istotne informacje dotyczące budowy białka ( poza fragmentami skrajnymi, których głównym zadaniem jest stabilizacja transkryptu ). Okazuje się jednak, że na matrycy jednego genu może powstać kil ka różnych mRNA, co poza alternatywną poliadenylacją powodowane jest tzw. alternatywnym splicingiem. Polega on na łączeniu ze sobą różnych egzonów tzn. niekoniecznie wszystkich występujących w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA).
Fig.III.2.7. Alternatywny splicing na przykładzie (-tropomiozyny szczura
5'NT i 3'NT - obszary nie ulegające translacji
Nie wiadomo jeszcze dokładnie, dlaczego w różnych tkankach wybierane są odmienne wzory łączenia egzonów. Być może maszyneria obsługująca proces wycinania intronów nie jest identyczna we wszystkich rodzajach komórek tzn. występują pewne subtelne, ale znaczące różnice między spliceosomami poszczególnych tkanek. Możliwe jest także, że podstawowy aparat splicingowy jest uniwersalny, a różne tkanki zawierają dla siebie charakterystyczne czynniki ( białkowe lub RN-owe ) łączące się z pre-mRNA, czego konse kwencją może być ułatwienie bądź utrudnienie działania spliceosomów w różnych miejscach w obrębie pierwotnego transkryptu.