Charakterystyka Staphylococcus i Streptococcus (nazwy rodzajowe).
Morfologia i identyfikacja Staphylococcus i Streptococcus.
Chorobotwórczość.
Czynniki odpowiedzialne za chorobotwórczość.
Podział paciorkowców na grupy serologiczne według Lancefield.
Gronkowce:
Ich komórki tworzą grona, dobrze rosną na zwykłych podłożach w warunkach tlenowych i beztlenowych. N podłożach stałych tworzą kolonie o wielkości 1-3 mm, gładkie, nieprzezroczyste, o równym brzegu i masłowej konsystencji. Na podłożach płynnych tworzą zmętnienie, osad na dnie który po wstrząśnięciu rozwija się w charakterystyczny sznureczek, rosną w temperaturze 5-45 o C, nawet w obecności 10% NaCl.
Dzielimy je na :
Koagulazo dodatnie (chorobotwórcze)
Staphylococuus aureus ssp. aureus
S.aureus ssp. anaerobius
S.intermedius
S.hyicus ssp. hyicus
S.schleiferi ssp. coagulans
Koagulazo ujemne (CNS)
oporne na nowobiocynę :
Grupa S.saprophyticus
Grupa S.sciuri
wrażliwe na nowobiocynę:
Grupa S.epidermidis
Nie każdy S.aureus wytwarza koagulazę.
Choroby gronkowcowe:
- zakażenia miejscowe- ropnie, zakażenia skóry, mieszków włosowych, ropnie, czyraki, liszajec, zakażenie ran chirurgicznych,
- zakażenia głębokie- ogólne- zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenia szpiku, kości, nerek, wątroby, mózgu, ropnie narządów, zapalenia wsierdzia, szpitalne zapalenia płuc, bakteriemia,
- choroby wywołane przez toksyny wytwarzane przez gronkowce:
SSSS- gronkowcowy syndrom oparzonej skóry (ang. Staphylococcal scalded skin syndrome)
- zatrucia wywołane enterotoksynami,
- TSS- zespół szoku toksycznego,
Zakażenie:
Adhezja (skóra, błony śluzowe- miejsce inicjacji zakażenia), adhezyjny białkowe wiążą się specyficznie na zasadzie klucza i zamka z białkami organizmu człowieka (np. z lamininą, fibronektyną, kolagen),
Wniknięcie / rozprzestrzenianie się drobnoustrojów i ich toksyn w organizmie.
Enzym / toksyna |
Właściwości |
Podłoże z krwią baranią - hemolizyny hemoliza α- częściowa- zazielenione podłoże β- całkowita - przejaśnienie podłoża γ- brak hemolizy |
rozpuszczają krwinki czerwone |
leukocydyna |
niszczy makrofagi, oraz zasadochłonne i obojętnochłonne leukocyty |
Enzymy nukleaza (DNaza) |
rozkłada kwasy nukleinowe |
lipaza |
hydrolizują lipidy |
proteazy |
degraduja białka |
stafylokinaza- fibrynolizyna |
rozpuszcza skrzepy- ułatwia rozprzestrzenianie się drobnoustrojów w tkankach |
hialuronidaza |
hydrolizuje kwas hialuronowy (substancja międzykomórkowa)- rozprzestrzenienie się patogenów i ich toksyn |
otoczka |
maskuje komórki gronkowców przed np. fagocytami (unikniecie fagocytozy) |
białko A |
główny składnik struktur komórkowych, specyficznie wiąże się z IgG, zapobiega fagocytozie |
koagulaza- wolna, występująca na zewnątrz |
chroni przed fagocytami |
koagulaza- związana, występująca wewnątrz, CF- clumping factor |
chroni przed fagocytami |
eksfoliatyna- toksyna |
wywołuje SSSS- gronkowcowy syndrom oparzonej skóry (ang. Staphylococcal scalded skin syndrome)
|
enterotoksyny (18 serotypów gronkowcowych) |
wywołują zatrucia pokarmowe, powoduje ona śmierć wyłącznie osobników chorych, bardzo młodych, lub bardzo starych |
TSS-1- toksyna zespołu wstrząsu toksycznego (ang. toxic shock syndrome toxin) |
TSS- zespół wstrząsu toksycznego |
MRSA (to metycylinooporne Staphylococcus aureus) Methycilin resistant Staphylococcus aureus
MSSA (to wrażliwe na metycylinę Staphylococcus aureus) Methicilin sensitive Staphylococcus aureus)
Wankomycyna to jedyny antybiotyk na który są jeszcze wrażliwe omawiane drobnoustroje.
Różnicowanie gronkowców:
Posiew na podłoże z krwią i na Chapmana (sprawdzamy typ hemolizy, oraz rozkład mannitolu- Staphylococcus epidermidis nie rozkłada mannitolu, a S.aureus tak.
Robimy preparat, barwiony metoda grama (gronkowce są gram +).
Gronkowce są katalazo +, gram +, koagulaza wolna i związana +.
Streptococcus:
Są to drobnoustroje katalazo ujemne, wymagające do wzrostu podłoży wzbogaconych krwią.
Powodują one choroby takie jak:
trywialne- powodują powstawanie płytki nazębnej;
ciężkie- wstrząs toksyczny, gorączka reumatyczna, kłębuszkowe zapalenie nerek, zakażenia.
Paciorkowce powodują hemolizę :
α- częściową- zazielenione podłoże
β- całkowitą - przejaśnienie podłoża
γ- brak hemolizy
Podział paciorkowców według Lancefield:
Podział ten opiera się na różnorodności węglowodanów występujących w ścianie komórkowej paciorkowców. Podziału tego dokonano na grupy od A-R. Grupy A-D oraz grupa Streptococcus pneumoniae są to drobnoustroje bardzo chorobotwórcze.
grupa A- Streptococcus pyogenes- paciorkowiec ropotwórczy. Jest to mikroflora gardła, skóry. Powoduje zakażenia ropne, anginę, posocznice, płonicę- szkarlatynę.
Grupa B- Streptococcus agalactiae- paciorkowiec bezmleczności. Jest to mikroflora gardła, pochwy. Powoduje posocznice połogowe, ropnie, zakażenia u noworodków, zapalenia wsierdzia, u zwierząt mastitis.
Grupa C- Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus dysgalactiae. Jest to mikroflora skóry, gardła, pochwy. Drobnoustroje te wywołują zakażenia ran, zapalenia wsierdzia, zapalenia tkanki łącznej, posocznice połogowe.
Grupa D- paciorkowce kałowe- Enterococcus faecalis, Enterococcus bovis, Enterococcus faecium, Enterococcus equinus. Jest to mikroflora komensalna przewodu pokarmowego. Wywołują one zakażenia ran, zapalenia otrzewnej, zakażenia układu moczowego.
Grupa Streptococcus pneumoniae (nie są typowane się na podstawie węglowodanów ze ściany komórkowej) Jest to flora fizjologiczna gardła, jamy ustnej. Powoduje zapalenia płuc, ucha środkowego, zapalenia zatok oraz oskrzeli.
Diagnostyka, chorobotwórczość. Systematyka i charakterystyka ziarniaków.
Ziarenkowce g+ Staphylococcus, Streptococcus i inne
Przedstawione tu rodzaje należą do odrębnych grup, różniących się zawartością guaniny i cytozyny w DNA nukleoidu. Rodzaje zaklasyfikowane do działu Firmicutes to bakterie o małej zawartości G + C, a Actinobacteria - o dużej. Są one fenotypowo podobne, a w obrębie działów filogenetycznie blisko spokrewnione. Wspólną cechą opisanych tu bakterii jest kulisty lub owalny kształt komórek ułożenie układów popodziałowych (par, tetrad, pakietów lub łańcuszków). Są to, zdecydowanej większości gatunków, bakterie względnie beztlenowe, tylko rodzaj coccus to bakterie bezwzględnie tlenowe.
Ziarenkowce te są komensalami wchodzącymi w skład naturalnej mikroflory-człowieka i zwierząt, bytującymi na skórze, błonach śluzowych górnych oddechowych i przewodu pokarmowego. Część z nich to jednocześnie bezwzględne patogeny człowieka i zwierząt, a pozostałe mogą być warunkowo chorobotwórcze.
Na podstawie zdolności wytwarzania katalazy opisane tutaj ziarenkowce można podzielić na katalazododatnie - rodzaje Staphyloccus, Micrococcus i Stomatococcus oraz katalazoujemne - rodzaje Streptococcus i Enterococcus.
ZIARNIAKI GRAM-DODATNIE
Ziarniaki Gram-dodatnie, wyłączając pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae, są najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń u ludzi, z różną lokalizacją, i najczęściej też są izolowane z próbek materiałów od chorych. Bakterie te uczestniczą w pierwotnych zakażeniach u zdrowych ludzi, a także w zakażeniach nabywanych w szpitalach. Bakterie te różnią się zasadniczo budową komórki od bakterii Gram-ujemnych. Znajomość tych różnic jest pomocna przy wyborze chemioterapeutyku do terapii zakażeń. Bakterie Gram-dodatnie są zazwyczaj bardziej oporne na wzrost temperatury i lityczne działanie różnych związków chemicznych niż bakterie Gram-ujemne. Ziarniaki Gram-dodatnie występują powszechnie w środowisku naturalnym, wśród zwierząt i u człowieka; kolonizują skórę, błony śluzowe człowieka i zwierząt. Występują powszechnie w glebie, wodzie, mleku, na podłogach, ścianach itp. Zakażenia u ludzi najczęściej są wywołane przez bezpośredni kontakt z chorymi, przez penetrację przez skórę lub błony śluzowe, przez zanieczyszczony sprzęt, wodę itd. Mogą to być zakażenia pokarmowe lub endogenne.
Większość ziarniaków Gram-dodatnich jest sklasyfikowana w grupie 12 wg systematyki Bergeya. Ta grupa zawiera dla większości klasyfikację tylko do poziomu rodzaju, a niektóre tylko do poziomu rodziny, np. Micrococcaceae. Do rodziny Micrococcaceae należą 4 rodzaje, takie jak: Micrococcus, Stomatococcus, Planococcus i Staphylococcus. Ziarniaki z rodziny Deinococcaceae nie są spotykane u ludzi. Wśród dużej listy rodzajów ziarniaków Gram-dodatnich można wyróżnić następujące grupy, ze względu na zapotrzebowanie na tlen i mechanizm metabolizmu glukozy:
— tlenowe: Micrococcus, Planococcus, Deinococcus
— względnie beztlenowe: Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Gemella
— beztlenowe: Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus, Sarcina Ziarniaki Gram-dodatnie są również zróżnicowaną grupą pod względem wymagań odżywczych. Gronkowce (Staphylococcus) rosną na zwykłych podłożach, a do ich selektywnego wzrostu wykorzystywane jest podłoże Chapmana, natomiast paciorkowce (Streptococcus) najczęściej izolowane są na podłożach wzbogaconych krwią; nie dotyczy to paciorkowców kałowych (np. S.faecalis i S.faecium).
Niektóre gatunki gronkowców lub paciorkowców znane są dobrze ze swojej chorobotwórczości dla ludzi, większość z nich jednak kwalifikowana była dotąd do grupy bakterii niechorobotwórczych czy wręcz saprofitycznych. Przykład taki mogą stanowić liczne gatunki z rodzaju Staphylococcus, a wśród nich S. saprophyticus, którego nazwa gatunkowa wskazywała historycznie, że nie są chorobotwórcze. Aktualnie gatunek ten wg niektórych ośrodków jest drugim pod względem częstości czynnikiem wywołującym zakażenia układu moczowego u kobiet i mężczyzn. To samo dotyczy udziału tych bakterii w zakażeniach z inną lokalizacją, łącznie z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych i/lub posocznicą doprowadzającą nawet do zejścia śmiertelnego. Na znaczenie niektórych ziarniaków Gram-dodatnich zwrócono uwagę w wykazie czynników etiologicznych uczestniczących w zakażeniach z różną lokalizacją oraz wcześniej przy omawianiu niektórych markerów zjadliwości bakterii. Bakterie te mają również szczególne znaczenie w zakażeniach szpitalnych.
Gronkowce koagulazo ujemne i koagulazo dodatnie. Identyfikacja gronkowców chorobotwórczych (rodzaje hemolizy, szczepy mannitolo dodatnie i ujemne).
Rodzaj Staphylococcus
Gronkowce zawdzięczają swoją nazwę skojarzeniu wyglądu układów ich komórek w preparatach mikroskopowych z wyglądem kiści winogron.
Przeważająca liczba gatunków gronkowców jest ściśle związana z człowiekiem jako prawidłowa flora bakteryjna, głównie skóry i przedsionka nosa. Są też przyczyną rozmaitych infekcji.
klasyfikacja i znaczenie kliniczne
Ciągle używany jest, zakorzeniony w pracowniach diagnostycznych, podział gronkowców na koagulazododatnie (gatunek: Staphylococcus aureus subsp. aureus) i koagulazoujemne (CNS - ang. coagulase negative staphylococci; gatunki: S. epidermidis, S. saprophyticus subsp. saprophyticus i inne). Wynika on z zaobserwowanej przed wielu laty zdolności wykrzepiania przez S. aureus osocza (próba na koagulazę) i braku tej cechy u pozostałych, znanych wtedy gatunków. Należy jednak zaznaczyć, że obecnie wiemy, iż aktywność koagulazy wykazują także inne gatunki gronkowców, np. izolowane od zwierząt S. hyicus czy S. intermedius. Jednocześnie, wśród szczepów klinicznych uznawanego za koagulazododatni gatunku S. aureus opisano ostatnio takie, które nie wykazywały tej cechy. Podział gronkowców na koagulazododatnie i koagulazoujemne należy zatem uznać, w świetle obecnej wiedzy, za mało precyzyjny.
Bardzo już obecnie liczne i niełatwe do identyfikacji gatunki gronkowców dla ułatwienia diagnostyki łączy się w inne grupy. Jednym z tak powstających podziałów jest podział oparty na ich różnej wrażliwości na nowobiocynę. Inny podział wyróżnia wśród tych gronkowców grupy gatunków o zbliżonej chorobotwórczości, roli fizjologicznej i cechach metabolicznych. Nazwy tych grup pochodzą od nazwy typowego w ich obrębie gatunku i nie są pisane kursywą.
Rodzaj Staphylococcus obejmuje grupę kilkudziesięciu gatunków, z których prawie połowa związana jest z człowiekiem. Część gatunków dotychczas izolowana była tylko od zwierząt i dla nich może być chorobotwórcza (np. koagulazododatni S. hyicus - izolowany od świń). Niektóre gatunki związane są głównie lub jedynie ze środowiskiem nieożywionym, jak izolowany z wędlin S. carnosus czy spotykany w produktach mlecznych S. caseolyticus.
Gronkowce kolonizują skórę każdego człowieka stanowiąc naturalną, fizjologiczną florę bakteryjną. Te same gatunki w zmienionych warunkach mogą wywoływać infekcje. Wiele gatunków wykazuje wyraźne preferencje dla określonych przestrzeni w obrębie ciała. Najliczniej i najpowszechniej spotykany jest gatunek S. epidermidis. Wyizolować go można ze skóry wszystkich okolic ciała i błon śluzowych - przede wszystkim nosogardzieli.
S. aureus kolonizuje szczególnie często przedsionek nosa. Można go znaleźć u 20-40% osób, a wśród personelu szpitalnego nawet i 90%. Jego obecność, choć jest pozbawiona doraźnych skutków, trudno jednak uznać za zjawisko normalne wobec wyposażenia tego gatunku w liczne czynniki chorobotwórczości. Ten rodzaj kolonizacji określamy jako nosicielstwo.
Mniejsze populacje S. hominis i S. haemolyticus najczęściej bytują w miejscach z licznymi gruczołami potowymi, S. capitis spotykany jest na skórze głowy, a S. auricularis w zewnętrznym przewodzie słuchowym. S. saccharolyticus izolowany bywa przede wszystkim ze skóry twarzy, szczególnie czoła, preferuje on głębsze odcinki kanalików gruczołów skóry. Jest to wśród gronkowców gatunek beztlenowy, jedyny, obok izolowanego od zwierząt podgatunku S. aureus subsp. anaerobius.
Gronkowce od wielu lat pozostają na czele listy drobnoustrojów powodujących zakażenia szpitalne. Wynika to przede wszystkim z ich szerokiego rozprzestrzenienia i powszechnej kolonizacji skóry i śluzówek człowieka oraz łatwego nabywania przez nie genów oporności na wiele antybiotyków. W konsekwencji łatwo dochodzi do selekcji szczepów opornych w szpitalu. Szczególne niebezpieczeństwo stanowią tu szczepy tzw. gronkowców metycylinoopornych (oksacylinoopornych) występujące zarówno wśród gatunków koagulazododatnich (MRSA - ang. methicillin resistant S. aureus), jak i koagulazoujemnych (MRCNS). Szczepy takie wykazują oporność nie tylko na antybiotyki (β-laktamowe, ale często także na większość stosowanych w lecznictwie antybiotyków innych grup.
Gronkowce najczęściej wywołujące schorzenia, szczególnie zaś gronkowce złociste, są czynnikami etiologicznymi bardzo szerokiego zakresu zakażeń i mogą być izolowane prawie z każdego rodzaju materiału klinicznego.
Infekcje gronkowcowe klasyfikowane jako inwazyjne mogą mieć zdecydowanie ciężki przebieg, gdy dotyczą osób o zaburzonej funkcji układu odpornościowego. Za ich rozwój odpowiedzialne są liczne, zlokalizowane na powierzchni lub wydzielane do środowiska czynniki chorobotwórczości tych bakterii. Pozwalają one na kolonizację, mnożenie i rozprzestrzenianie bakterii oraz działają hamująco na mechanizmy pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej (inwazyny). Choroby gronkowcowe mogą też wynikać z działania toksyn białkowych wydzielanych zewnątrzkomórkowo.
S. aureus (gronkowiec złocisty) może być przyczyną miejscowych infekcji dotyczących praktycznie wszystkich tkanek i narządów oraz zakażeń uogólnionych, często zagrażających życiu. Do najczęściej spotykanych, zarówno w szpitalu, jak i poza nim, oportunistycznych infekcji wywoływanych przez gronkowce złociste należą ropne stany zapalne skóry i tkanek miękkich: czyraki, jęczmienie, liszajec, ropnie, ropowice oraz zapalenie szpiku kostnego, septyczne zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia i zapalenie płuc.
Chorobotwórczość S. aureus zależy od bardzo dużej liczby czynników. Za zakażenia inwazyjne odpowiedzialne są adhezyny i inwazyny, a wśród nich receptory wiążące glikoproteiny macierzy (ECM - ang. extracellular matrix) komórek organizmu. Ważniejsze z nich to receptor dla fibronektyny, receptor fibrynogenu osocza
- czynnik skupiania komórek (CF - ang. clumping factor) czy białko A mające zdolność wiązania immunoglobulin poprzez fragment Fc, a tym samym zapobiegające opsonizacji ich komórek. Niszczenie tkanek wzmagają liczne enzymy (stafylokinaza, hialuronidaza i wiele innych), a także działające wielokierunkowo hemolizyny α, β, γ, δ, oraz leukocydyna.
Gronkowce złociste mogą wytwarzać specyficzne toksyny immunomodulujące, nazywane też toksynami pirogennymi (gorączkotwórcze). Są to superantygeny działające pobudzająco i mitogennie (indukuje mitozę, w szczególności w układzie odpornościowym) w stosunku do limfocytów T. Ich aktywność prowadzi do znacznej nadprodukcji cytokin, a w konsekwencji do zapaści naczyniowej i wstrząsu. Szczepy je wytwarzające są przyczyną - czynnikiem etiologicznym następujących schorzeń o typowym tylko dla nich przebiegu.
• Gronkowcowe zatrucie pokarmowe z gwałtownymi wymiotami i biegunką ustępującą po kilku godzinach.
Jest to szybko objawiający się skutek spożycia pokarmu, w którym mnożące się S. aureus wytworzyły ciepłostałą enterotoksynę. Gronkowce produkują kilka serologicznie różnych odmian tej toksyny.
• Zespół wstrząsu toksycznego (TSS - ang. toxic shock syndrome) spowodowany przez szczepy S. aureus.
Za wiele ciężkich objawów tego schorzenia (biegunka, wymioty, zapaść naczyniowa, czasem prowadząca do niewydolności narządów i śmierci) odpowiedzialna jest wydzielana przez te bakterie toksyna zespołu wstrząsu toksycznego (TSST - ang. toxic shock syndrome toxin). Najczęściej opisywane przypadki występowały u kobiet używających podczas miesiączki tamponów, co stwarzało dogodne mikroaerofilowe środowisko, w którym toksyna, u szczepów zawierających kodujący ją gen, mogła ulec ekspresji.
• Zespół skóry oparzonej noworodków (SSS - ang. scalded skin syndrome) (łac. dermatitis exfoliativa neonatorum Ritter) i występujące u starszych dzieci, a wynikające z działania tej samej toksyny, ciężkie zmiany martwicze (TEN - ang. toxic epidermal necrolysis).
Jest to efekt działania kolejnej toksyny immunomodulującej wytwarzanej przez S. aureus - toksyny epidermolitycznej (eksfoliatyny). Toksyna ta powoduje powstawanie rozległych pęcherzy, złuszczanie naskórka i odsłanianie skóry właściwej na dużych przestrzeniach (zespół Rittera) lub powstawanie mniej rozległych zmian: liszajca pęcherzowego lub wysypki rumieniowej (płonicy gronkowcowej).
S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy) jest obecnie notowany jako najczęstsza przyczyna - czynnik etiologiczny szpitalnych posocznic. Drobnoustrój ten powoduje infekcje przede wszystkim u pacjentów z obniżonym poziomem odporności: wcześniaków, osób poddanych chemioterapii w leczeniu nowotworów, biorców przeszczepów - szczególnie szpiku kostnego. Jest on przyczyną bakteriemii, a często i posocznic u pacjentów poddanych długotrwałemu dożylnemu cewnikowaniu (wenflony, dojścia centralne) lub tych, u których zastosowano różnego rodzaju wszczepy (endoprotezy). S. epidermidis może także powodować zapalenia wsierdzia, często jako infekcje pooperacyjne. Swoją szczególną chorobotwórczość gatunek ten zawdzięcza dużym zdolnościom adhezyjnym zależnym od wytwarzania zewnątrzkomórkowego śluzu (ESS - ang. extracellular slime substance) i receptorów dla wielu białek ECM pozwalających na tworzenie na powierzchniach tkanek i wszczepów biofilmu. Tego rodzaju zakażenia mogą być także wywoływane przez podobnie wyposażone szczepy innych gatunków gronkowców koagulazoujemnych. Niektóre z nich wydzielają cytolizyny przyczyniające się do rozprzestrzeniania zakażenia oraz inne czynniki chorobotwórczości.
S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) jest gatunkiem notowanym klinicznie jedynie jako przyczyna zakażeń dróg moczowych. U młodych kobiet jest to drugi po Escherichia coli czynnik etiologiczny tej choroby. Infekcja wymaga wcześniejszej kolonizacji tymi bakteriami, S. saprophyticus bowiem nie występuje powszechnie wśród rezydentów skóry. Kolonizacji sprzyjają warunki beztlenowe, dlatego źródłem wstępującego zakażenia dróg moczowych może być przewód pokarmowy - po zjedzeniu skażonej żywności lub pochwa - po przeniesieniu bakterii drogą płciową bądź na pływalniach. Warunki beztlenowe wzmagają wytwarzanie przez S. saprophyticus hemaglutyniny - adhezyny odpowiedzialnej za ich chorobotwórczość.
Czynniki sprzyjające kolonizacji i rozwojowi infekcji znaleziono u różnych gatunków gronkowców. Większość z tych czynników chorobotwórczości jednak po raz pierwszy była zbadana i opisana u S. aureus. Szczepy gronkowców złocistych wyposażone są też zwykle w największą ich liczbę. Większość tych czynników jest spotykana u wielu gatunków, ale są też takie, które są charakterystyczne tylko dla niektórych z nich. Toksyny immunomodulujące wśród gatunków izolowanych od ludzi znaleziono tylko u S. aureus. Jednak u szczepów S. hyicus izolowanych od świń znaleziono toksyny o działaniu zbliżonym do enterotoksyny i do eksfoliatyny gronkowców złocistych.
MORFOLOGIA, WYMAGANIA WZROSTOWE, IZOLACJA
Komórki gronkowców są gramdodatnie, w starych hodowlach barwią się jednak nieregularnie. Ziarenkowce te osiągają rozmiary na ogół nie przekraczające l μm i są nieruchliwe. Charakterystyczny układ gron obserwowany jest w preparatach wykonywanych z hodowli na pożywkach stałych, spotykane są także mniejsze układy złożone z 2-4 komórek, a czasem - z hodowli płynnych - krótkie łańcuszki.
Gronkowce są w większości względnymi beztlenowcami, wyrastają więc zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, jednak natlenianie podłoża (np. przez wstrząsanie) na ogół wzmaga wzrost.
Wiele gatunków gronkowców potrzebuje do wzrostu określonych aminokwasów i witamin, ale wymagania te zaspokajają nawet proste podłoża bakteriologiczne: woda peptonowa czy zwykłe podłoże agarowe. Wzrost tych bakterii jest jednak bardziej obfity na podłożach bogatszych, np. podłożu TSA (Triptic Soy Agar) lub TSA z krwią. Gładkie, okrągłe, lekko wypukłe kolonie tworzą się po 24 godzinach hodowli w temperaturze 30-35°C. Ocena morfologii kolonii po 5 dniach hodowli na agarze P (Aneks 1-40) może mieć duże znaczenie diagnostyczne. Zabarwienie kolonii (białe do pomarańczowego) ujawnia się po ekspozycji na światło i hodowli w temperaturze pokojowej.
Na agarze z krwią wokół kolonii szczepów niektórych gatunków (S. aureus, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. cohnii) pojawia się różnej wielkości strefa hemolizy typu β, zwykle lepiej widoczna po 48 godzinach lub po hodowli w atmosferze CO2 (Aneks P-3).
Na podłożu płynnym gronkowce zazwyczaj tworzą męt, czasem z kłaczkowatym osadem. Izolację gronkowcow z materiałów klinicznych o bogatej florze towarzyszącej, ze środowiska czy z żywności, ułatwiają wybiórcze podłoża, takie jak podłoże Chapmana, podłoże z mannitolem i NaCl czy podłoże Baird-Parkera (Aneks 1-10, 1-37, 1-3) wykorzystujące ich dużą oporność na stres osmotyczny. Gronkowce są halotolerantami.
identyfikacja gatunków gronkowcowych
Różnicowanie w obrębie rodzaju opiera się na określeniu cech biologicznych i biochemicznych. Gronkowce złociste identyfikuje się najczęściej przez wykazanie: zdolności wytwarzania koagulazy (Aneks P-54), obecności czynnika ich skupiania w osoczu (CF - ang. dumping factor), hemolizy typu β oraz, wynikającego z fermentacji tego substratu, beztlenowego rozkładu mannitolu. Trudności diagnostyczne mogą sprawiać, rzadko wprawdzie spotykane, koagulazoujemne szczepy S. aureus lub różnicowanie S. aureus z także wytwarzającymi CF S. schleiferi lub CF-dodatnimi szczepami S. lugdunensis. Powszechnie używane są komercyjne szybkie testy wykorzystujące obecność na powierzchni komórek S. aureus receptora wiążącego fibrynogen (czynnik CF) oraz białka A wiążącego immunoglobulinę poprzez fragment Fc (Aneks P-48). Identyfikacja pozostałych gatunków gronkowców wymaga oceny znacznie większej liczby cech metabolicznych, poczynając od określenia wrażliwości na nowobiocynę (Aneks P-42), poprzez badanie dodatkowo: rozkładu ksylozy (cukier drzewny, węglowodan, monosacharyd, składnik hemiceluloz), sacharozy, maltozy, fruktozy, laktozy, mannozy, trehalozy (oligosacharyd z dwoma cząsteczkami glukozy) , redukcji azotanów, aktywności enzymów: fosfatazy, ureazy, ciepłostabilnej DNazy i wielu testów krążkowych (np. wrażliwość na polimyksynę B, bacytracynę czy lizostafinę - Aneks P-48, P-38, P-40). Zwykle wykonuje się tę identyfikację używając odpowiednio zestawionych wielu prób biochemicznych w szeroko dostępnych handlowo testach diagnostycznych (Aneks P-68). Różnicowanie gronkowców koagulazoujemnych jest trudne, szczególnie dla gatunków S. hominis, S. haemolyticus i S. warneri. Identyfikacja gatunków najczęściej wywołujących schorzenia, powinna być możliwa a blisko 90% szczepów. W niektórych przypadkach pomocna może być także próba wrażliwości na polimyksynę B, na którą większość wymienionych tu gatunków jest wrażliwa, a S. aureus i wiele szczepów S. epidermidis (ale nie wszystkie) wykazują oporność.
Molekularne metody identyfikacji gronkowców są wykorzystywane nie tyle do rutynowej diagnostyki, ile do ich typowania dla celów epidemiologicznych. Szczególnie przydatne są metody genetyczne oparte na rybotypowaniu i sondy genetyczne do oznaczania produktów PCR. Te ostatnie używane są do wykrywania szczepów wieloopornych (metycylinoopornych).
Rodzaj Staphylococcus
Do tego rodzaju, zgodnie z taksonomią Bergeya (1986) zostało sklasyfikowanych aż 19 gatunków, gdy wcześniej znane były tylko trzy z nich, tj. S. aureus, S. epidermidis i S. saprophyticus.
Poszczególne gatunki rodzaju Staphylococcus mogą być podzielone na dwie podstawowe grupy, tj. gronkowce koagulazo-dodatnie: S. aureus i S. intermedius (jak dotąd chorobotwórcze tylko dla zwierząt, rzadko spotykane u ludzi) i niektóre szczepy S. hyicus oraz gronkowce koagulazo-ujemne (CNS = coagulase — negative staphylococci): S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. simulans, S. haemolyticus, S. warneri, S. xylosus, S. capitis, S. cohnii, S. sciuri, S. gallinarum, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. caprae, S. caseoldyticus i S. carnosus.
Ostatnio (1989) rodzaj Staphylococcus został uzupełniony o sześć nowych gatunków: Staphylococcus lugdunensis, S. schleiferi, S. lentus, S. arlettae, S. eąuorum i S. kloosi. Kilkanaście dalszych gatunków jest przedmiotem badań.
Staphylococcus aureus
Spośród znanych gatunków rodzaju Staphylococcus, gatunek S. aureus jest najbardziej chorobotwórczy; może być odpowiedzialny za zakażenia w każdym miejscu. Gronkowcowe zakażenia można podzielić na:
— choroby skórne: ropnie, czyraki pojedyncze i mnogie, trądzik, zastrzał, zakażone rany, inne,
— choroby układu oddechowego: zapalenie gardła i/lub migdałków, zatok obocznych nosa, ucha środkowego, oskrzeli, opłucnej, płuc (płatowe i odoskrzelowe),
— choroby układu moczowego: odmiedniczkowe zapalenie nerek, zapalenie cewki moczowej i/lub pęcherza,
— choroby przewodu pokarmowego: zatrucia pokarmowe, odzwierzęce zatrucia pokarmowe, zapalenie jelit (rzekomobłoniaste, martwicze, inne),
— posocznice i ropowice,
— zapalenia ropne stawów,
— zapalenie sutków,
— zapalenie szpiku i kości (osteomyelitis),
— zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych,
— zespól oparzonej skóry (SSS = scalded skin syndrome),
— zespół wstrząsu toksycznego (TSS = toxic shock syndrome).
Szczepy tego gatunku mogą być przyczyną powikłań wirusowych zakażeń (często grypy) oraz zakażeń szpitalnych u pacjentów z obniżoną odpornością. Bakteriemie występują w skojarzeniu z zakażeniami zlokalizowanymi we wsierdziu (endocarditis), w płucach (ropień) lub w szpiku. W wyniku bakteriemii może występować jako wtórne zakażenie w odległych miejscach (skóra, tkanka podskórna, nerki lub mózg).
Zespół wstrząsu toksycznego: TSS (zespół wstrząsu toksycznego) został opisany po raz pierwszy w 1978 roku, jako choroba zakaźna, wywoływana przez różne szczepy S. aureus produkujące toksyny, która występowała u kobiet w okresie menstruacji. U mężczyzn zespół ten występował w 5% przypadków. Związany jest głównie z używaniem tamponów absorpcyjnych, które powodują namnożenie się dużej liczby bakterii w pochwie. Klinicznie objawia się jako: gorączka, obniżenie ciśnienia, ortostatyczny zawrót głowy, erytrodermia złuszczająca, wymioty, biegunka, ból głowy, kaszel, zapalenie spojówek. Choroba w około 8% przypadków kończy się zejściem śmiertelnym. W końcowym okresie rozwoju choroby może występować niewydolność nerkowa, wątrobowa i/lub sercowa.
Badania nad szczepami S. aureus, odpowiedzialnymi za zespół wstrząsu toksycznego, doprowadziły do wykrycia dwóch toksyn, które początkowo oznaczono jako enterotoksyna F i egzotoksyna typu C. Szczegółowe badania struktury białek wykazały identyczność tych dwóch toksyn. Aktualnie toksyna jest oznaczona jako TSS l (TSST-1). Może wywoływać gorączkę u zwierząt doświadczalnych i powodować letalny wstrząs endotoksyczny. Toksyna jest produkowana przez szczepy biorące udział w różnych typach zakażeń. Wykazano, że gronkowce koagulazo-ujemne mogą również produkować tę toksynę i wywoływać klasyczny zespół TSS.
Pozakomórkowe toksyny i czynniki zjadliwości S. aureus. Szczepy tego gatunku charakteryzowane są jako zjadliwe (wirulentne) na podstawie zdolności do wytwarzania: koagulaz, nukleaz (DNaza), α-, β-, i y-hemolizyn, hialuronidaz, lipaz, leukocydyny, fibrynolizyny, eksfoliatyny i enterotoksyn. Hemolizyna a jest odpowiedzialna za strefę hemolizy wokół kolonii S. aureus, wzrastających na podłożu agarowym z krwią baranią. Koagulaza może chronić komórki bakteryjne przed fagocytozą przez opłaszczanie neutrofilów fibryną. Białko A, składnik ściany komórkowej, jest zdolne do wiązania regionu Fc cząsteczki immunoglobuliny i może interferować w opsonizacji i fagocytozie. Hialuronidazy są enzymami, które hydrolizują międzykomórkowy cement tkanek, jaki stanowi kwas hialuronowy; bakterie mogą się rozprzestrzeniać w głąb organizmu. Eksfoliatyna również ma taką właściwość, lecz jej działanie jest ograniczone do warstwy ziarnistej skóry, powoduje powstawanie pęcherzy, złuszczanie się naskórka. Leukocydyny są egzotoksynami, które mają bezpośrednie działanie toksyczne na neutroflle, ziarninowanie lizosomalne komórek i śmierć komórek. Szczepy S. aureus izolowane z czyraków, pojedynczych lub mnogich, zazwyczaj produkują lipazy, zdolne do hydrolizowania lipidów w skórze, co ułatwia ich rozprzestrzenianie.
Enterotoksyny gronkowcowe stanowią grupę ciepłostabilnych białek z pojedynczymi wiązaniami o masie cząsteczkowej od 28000 do 35000 daltonów, które dzielą się na 7 typów: A, B, C l, C2, D, E i F. Typy A i B enterotoksyn są najczęściej odpowiedzialne za zatrucia pokarmowe u ludzi, charakteryzujące się klinicznie nudnościami, wymiotami, biegunką i czasami zapaścią naczyniową; objawy te występują w ciągu 2—6 h po spożyciu zanieczyszczonego pokarmu (sałatki jarzynowe, jajka, kurczaki, lody, ciastka tortowe itp.).
Stafilokinaza (fibrynolizyna)- toksyna, niekiedy nie jest zaliczana do grupy toksyn czy enzymów toksycznych, gdyż nie wykazuje żadnej bezpośredniej aktywności enzymatycznej; powoduje przekształcenie plazminogenu do plazminy. Jest tylko pośrednio odpowiedzialna za fibrynolityczną aktywność S. aureus,
Koagulaza — ścina osocze krwi ludzkiej i króliczej w obecności aktywatora koagulazy. Działa na aktywator i przekształca go w związek podobny do trombiny. Związek ten z kolei działa na fibrynogen i przemienia go w fibrynę.
„clumping factor" — czynnik CF (znany jako „koagulaza związana"); ścina fibrynogen bez udziału aktywatora koagulazy. Uczestniczy w osłonie gronkowców przed leukocytami i przeciwbakteryjnymi czynnikami zawartymi w surowicy. Test CF w wersji szkiełkowej (surowica królicza + zawiesina badanego szczepu, kłaczki — 30 s) ma zastosowanie w rutynowej diagnostyce. Szczepy S. aureus wytwarzają enzym endonukleazę, która jest stabilna przez 15 min podczas gotowania; test na DNazę jest stosowany rutynowo.
Do czynników zjadliwości u szczepów z gatunku S. aureus należą ponadto: glikokaliks polisacharydowy, białko wiążące fibronektynę, białko wiążące kolagen i białko wiążące fibrynogen. W dochodzeniach epidemiologicznych dodatkowo przeprowadzane są typowania bakteriofagowe przy użyciu zestawu standardowego fagów swoistych oraz w niektórych ośrodkach — także typowanie serologiczne. W budowie antygenowej wyróżnia się antygeny grupowe — wspólne dla rodzaju — i antygeny swoiste gatunkowo, na podstawie których gatunek S. aureus podzielono na 18 typów serologicznych.
Pozakomórkowe toksyny i czynniki zjadliwości gronkowców koagulazo-ujemnych. Różnicowanie gronkowców na szczepy zjadliwe i niezjadliwe, tj. stanowiące normalną florę komensalną, uwzględnia podobne cechy jak przy badaniu zjadliwości S. aureus (p. wyżej). Wśród szczepów CNS wykazano dotąd obecność powierzchniowych determinant zjadliwości, takich jak: glikokalyks (przyleganie do tworzyw sztucznych), białko wiążące fibronektynę oraz białko wiążące kolagen. Do lat sześćdziesiątych nie były znane szczepy gronkowców, które były koagulazo-ujemne, mannitolo-dodatnie i jednocześnie DNa-zo-dodatnie; opisano takie szczepy jako czynniki etiologiczne w endocarditis. Sytuacja ta uległa zmianie na przestrzeni lat; od chorych izolowane są liczne szczepy CNS zdolne do produkcji α-hemolizyny, DNazy i stafilokinazy. Szczepy CNS, izolowane z przypadków endocarditis, posocznicy, zmian skórnych lub z zakażeń dróg moczowych mogą produkować następujące toksyny: α i y-hemolizyny, DNazę, żelatynazę, lipazy (esterazy, fosfatazy), czynnik egg yolk (lecytynaza), czynnik oksydazy bursztynianowej. Biotypy l, 2, 3 i 4 wg Baird-Parkera wykazują zróżnicowanie w częstości i toksynogenności wśród szczepów izolowanych z różnych źródeł. Biotyp l należy do najczęstszych i 50% szczepów tego biotypu produkuje DNazę, różne proteazy, ureazę i lizozym; około 65% tych szczepów hydrolizuje różne syntetyczne lipidy (składniki Tweenu), ale tylko 24% wytwarza jakąś hemolizynę. Wśród innych biotypów takich jak: 3 i 4 rzadko wykazywane są enzymy i hemolizyny. Szczepy z gatunku S. aureus, pochodzące od ludzi, produkują głównie hemolizyny typu α i β, gdy szczepy zwierzęce — głównie hemolizynę β. Szczepy CNS mogą produkować, podobnie jak S. aureus, hemolizyny α i β, ale również wykazano obecność innej hemolizyny, nieznanej dotąd u S. aureus. Delta-hemolizyna podobna do występującej u S. aureus jest dominująca wśród szczepów z gatunku S. epidermidis i S. haemolyticus. Szczepy CNS wykazują również efekty cytopatogenne podobne do toksynogennych szczepów C. diphtheriae. Szczepy z gatunku S, simulans mogą wykazywać słabą aktywność hemolityczną, wytwarzanie lipazy i DNazy. Aktywność hemolityczną wykazano również wśród szczepów z gatunku S. warneri, S. cohnii i S. hominis. Nie wykazano jej wśród szczepów z gatunków S. capitis, S. sciuri, S. saprophyticus i S. xylosus. U szczepów S. haemolyticus wykazano ponadto dwie izotoksyny, które nie mają pokrewieństwa do α-, β- lub y-hemolizyn.
Te wstępne charakterystyki uzyskane dotąd dla szczepów CNS próbują wyjaśnić patomechanizm zakażeń u ludzi tymi bakteriami oraz ich znaczenie kliniczne; w wielu wypadkach będą pomocne w rozstrzygnięciu, czy stanowią zanieczyszczenie materiału klinicznego, czy też są rzeczywistymi patogenami. Jak dotąd wiadomo, że szczepy z gatunku S. haemolyticus i S. epidermidis są powszechnie izolowane z przypadków zakażeń z różną lokalizacją w tkankach, gdy S. saprophyticus wykazuje tropizm tkankowy do układu moczowego u ludzi.
Szczepy z gatunków S. capitis, S. xylosus i S. sciuri izolowane są rzadko. W niektórych ośrodkach za zakażenia poważne często odpowiedzialne są takie gatunki, jak: S. hominis i S. warneri. Gronkowce koagulazo-ujemne (CNS) nie mogą być pomijane w diagnostyce zakażeń bakteryjnych zarówno przez lekarzy, jak i przez mikrobiologów.
Diagnostyka: gronkowce należą do bakterii sprawiających najmniej trudności w hodowli i dalszej identyfikacji w rutynowym laboratorium. Podłoże wybiórcze, zestawy gotowe do identyfikacji, są dostępne powszechnie. Hodowla prowadzona w temperaturze 37°C przez 18—24 h pozwala na uzyskanie optymalnego wzrostu większości gatunków tego rodzaju.
Różnicowanie gronkowców z innymi ziarenkowcami
W praktyce najczęściej spotykamy się z koniecznością różnicowania gronkowców z innymi ziarenkowcami gramdodatnimi izolowanymi z tych samych materiałów klinicznych, przede wszystkim mikrokokami (Micrococcus) i paciorkowcami (Strep-tococcus). Od tych pierwszych różni je wrażliwość na furazolidon (Aneks P-37), na który mikrokoki są oporne (dorastają do krążka), oraz fermentacyjny metabolizm glukozy, którą te spośród mikrokoków, które są zdolne do jej rozkładu - utleniają. Różnicowanie gatunków nie rozkładających glukozy z gronkowcami można dodatkowo oprzeć na zdolności wytwarzania oksydazy i wyrastaniu na podłożach z nieorganicznym źródłem azotu, co wśród gronkowców związanych z człowiekiem jest cechą niespotykaną. Gronkowce od paciorkowców wyraźnie odróżnia dodatnia próba na katalazę oraz mniejsze od większości gatunków rodzaju Streptococcus wymagania pokarmowe.
Rodzaj Micrococcus
Mikrokoki nie są filogenetycznie spokrewnione z rodzajami opisanymi w tym rozdziale, mimo że przez wiele lat tak właśnie uważano.
W rodzaju Micrococcus opisano dziewięć gatunków, z których osiem może kolonizować skórę człowieka. Typowym przedstawicielem jest Micrococcus lutem.
Bakterie te uważane są za niechorobotwórcze, ale opisano przypadki ich izolacji z zakażeń oportunistycznych. Izoluje się je z produktów spożywczych i z powietrza. Można je często spotkać, jako zanieczyszczenie, w materiałach klinicznych.
Ziarenkowce z rodzaju Micrococcus są podobne morfologicznie, ale większe od gronkowców i osiągają średnicę komórek przekraczającą 2 μm. W odróżnieniu od gronkowców są tlenowcami; zawartą w pożywce glukozę utleniają, choć zdolność rozkładu tego substratu mają tylko niektóre gatunki tego rodzaju. M. luteus, na przykład, jej nie ma. Mikrokoki tak jak gronkowce wytwarzają katalazę. Mają także niewielkie wymagania odżywcze i też są halotolerantami (np. rosną w obecności 5% NaCl). Są jednak oporne na furazolidon (Aneks P-37). Ich kolonie dość łatwo można odróżnić od gronkowców, są nieprzejrzyste i wyraźnie zabarwione w odcieniach od cytrynowożółtego do czerwonego.
Rodzaj Stomatococcus
Jedynym opisanym gatunkiem tego rodzaju był dotychczas Stomatococcus mucilaginosus, ale w rezultacie badań taksonomicznych w najnowszych kluczach identyfikacyjnych drobnoustrój ten został przeszeregowany do rodzaju Rothia jako Rothia mucillaginosa. Nie wskazano żadnych innych gatunków rodzaju Stomatococcus i być może zostanie on (choć dotychczas nie został) wyeliminowany z klasyfikacji.
Rothia mucillaginosa jest komensalem bytującym w jamie ustnej i w górnych częściach układu oddechowego. Często spotyka się go w wymazach krtaniowych. Wymaga różnicowania z innymi podobnymi, bytującymi tam ziarenkowcami i dlatego opisano go w tym miejscu. Może brać udział w procesie infekcyjnym.
Komórki tych bakterii są podobne do gronkowców, ale układają się raczej w pary lub tetrady. Tworzą warstwę śluzową często otaczającą kilka komórek. Są względnymi beztlenowcami, wykazują słabą aktywność katalazy. Do wzrostu potrzebują podłoży wzbogaconych (np. agaru z krwią); tworzą wypukłe, zwarte kolonie. Ich cechą charakterystyczną jest to, że można je niezwykle łatwo zdjąć w całości z powierzchni podłoża. Ziarenkowce te, w odróżnieniu od Staphylococcus i Micrococcus, nie tolerują zwiększonego ciśnienia osmotycznego w pożywkach.
Różnicowanie Streptococcus pyogenes i Enterococcus faecalis na podstawie wzrostu na podłożach : mleko z 0,1 % błękitem metylenowym, bulion z 6,5 % NaCl, bulion o pH 9,6, podłoże z krwią i 40 % żółcią oraz na podstawie rodzaju hemolizy i wrażliwości na bacytracynę.
Rodzaj Streptococcus
Ziarenkowce tego rodzaju nazywane są paciorkowcami ze względu na charakterystyczny układ komórek, które dzieląc się w jednej płaszczyźnie czasami nie rozłączają się całkowicie i tworzą długie łańcuszki jak paciorki.
Paciorkowce nie wytwarzają katalazy i cecha ta różni je od katalazododatnich gronkowców. Podobnie jak gronkowce charakteryzują się metabolizmem fermentacyjnym z kwasem mlekowym jako głównym metabolitem.
klasyfikacja i znaczenie kliniczne
Rodzaj Streptococcus obejmuje kilkadziesiąt gatunków. W patologii człowieka istotną rolę odgrywa kilkanaście z nich. Badania filogenetyczne oparte na analizie rRNA pozwoliły na wyróżnienie grup gatunków bardzo blisko spokrewnionych. W stosunku do poprzednich podziałów nowy schemat zawiera pewne zmiany. Wprawdzie już dawniej tak nazywane paciorkowce ropotwórcze okazały się blisko spokrewnione i tworzą nadal wspólną grupę, ale nie ma wśród nich zaliczanego do niej wcześniej pneumokoka S. pneumoniae. Z kolei, dawniej wyodrębniane jako jedna grupa paciorkowce jamy ustnej tworzą kilka odrębnych genetycznie grup: S. mitis, S. mutans, S. salivarius i S. milleri. Pneumokok okazał się genetycznie spokrewniony z paciorkowcami grupy S. mitis.
Inny, niezwykle ułatwiający identyfikację, podział paciorkowców na grupy serologiczne opiera się na budowie antygenowej składników ich ściany komórkowej: wielocukru swoistego C (grupy A, B, C, F, G) lub kwasu lipotejchojowego (grupa D). System podziału opierający się na różnicach w tej budowie stworzyła Lancefield w celu identyfikacji tzw. paciorkowców p-hemolizujących - grupy gatunków, których i szczepy mogą wywoływać na agarze z krwią hemolizę typu β. Szczepy takie znajdują i się w obrębie wielu gatunków w różnych grupach tych ziarenkowców. Z czasem i poszerzano liczbę grup serologicznych, ale u niektórych gatunków nie rozpoznano antygenów, a u innych okazało się, że dają one reakcje krzyżowe lub że w obrębie jednego gatunku spotykane są szczepy zawierające różne antygeny grupowe. Podział serologiczny zachował swą przydatność diagnostyczną, obejmuje ponad 20 grup, ale w praktyce wykorzystywany jest tylko do ograniczonej liczby gatunków.
System ten jest szeroko stosowany, gdyż pozwala na szybką identyfikację gatunków najważniejszych w patologii człowieka. Opiera się na nim wiele rodzajów szybkich testów identyfikacyjnych: próby lateksowe czy immunoenzymatyczne, na przykład paskowe, pozwalające na wykrycie infekcji spowodowanej przez S. pyogenes w ciągu kilku minut od pobrania wymazu z gardła.
W pierwotnym schemacie Lancefield w grupie D umieszczone są także gatunki paciorkowców obecnie wyodrębnionych jako osobny rodzaj Enterococcus. Ziarenkowce te mają bowiem w swojej ścianie antygeny (kwasy lipotejchojowe) charakterystyczne dla tej grupy, przez co ich diagnostyka łączy się z diagnostyką rodzaju Streptococcus.
Relacje taksonomiczne paciorkowców są coraz lepiej poznawane, głównie dzięki badaniom genetycznym. Jednak nadal jeszcze opisane gatunki okazują się bardzo zróżnicowane wewnętrznie, co sugeruje przyszłe zmiany w taksonomii. Zmiany te obserwuje się także w ocenie ich chorobotwórczości. Gatunki dotychczas opisywane jako typowo zwierzęce były już izolowane od człowieka. Podobnie jak w przypadku innych bakterii zwiększa się grupa gatunków wywołujących różnego rodzaju zakażenia oportunistyczne.
Z materiałów klinicznych od ludzi najczęściej izolowane są S. pyogenes, S. agalactiae, S. dysgalactiae subsp. eąuisimilis i S. pneumoniae.
S. pyogenes (paciorkowce ropotwórcze) są spośród paciorkowców najczęstszym i najważniejszym czynnikiem etiologicznym infekcji. Mogą jednak stanowić część flory bakteryjnej nie powodując objawów chorobowych, bytując na błonach śluzowych górnych dróg oddechowych u nosicieli. Zakażenie następuje drogą kropelkową, przez kontakt lub zakażone przedmioty. Schorzenie może się również rozwinąć w wyniku aktywacji szczepu endogennego u nosiciela.
Paciorkowce te mogą być przyczyną infekcji miejscowych, dotyczących przede wszystkim gardła i skóry, oraz zagrażających życiu zakażeń uogólnionych. Za ich chorobotwórczość odpowiedzialnych jest wiele czynników. Do najważniejszych należy silnie immunogenne, umiejscowione na powierzchni komórek, a także w fimbriach białko M. Białko to wiąże fibrynogen z surowicy ułatwiając adhezję i blokuje wiązanie dopełniacza do peptydoglikanu hamując fagocytozę. Wiąże się z nim nadzieje przy opracowywaniu szczepionki zapobiegającej zakażeniom S. pyogenes. Wykrywanie odmian serologicznych białka M może służyć typowaniem epidemiologicznym. Działanie wielu innych składników powierzchni komórek S. pyogenes, a także uwalnianych przez nie substancji zewnątrzkomórkowych (np. enzymów i toksyn cytolitycznych), w tym toksyny immunomodulującej (toksyny erytrogennej), składa się na złożoną i różnorodną chorobotwórczość tych bakterii. Wytwarzana przez paciorkowce tego gatunku tleno wrażliwa hemolizyna - streptolizyna O jest silnie immunogenna, a powstające u chorego w przebiegu zakażenia przeciwciała (antystreptolizyny) są istotnym markerem diagnostycznym. Wysokie, narastające miano tych przeciwciał wykazane w dwukrotnym badaniu serologicznym (miano antystreptolizyn O - ASO) wskazuje na istniejące zakażenie tymi paciorkowcami.
S. pyogenes wywołuje stany zapalne i ropne gardła oraz migdałków podniebiennych, czasem powikłane ropniem około migdałkowym lub pozagardłowym, ropnym zapaleniem węzłów chłonnych i ucha środkowego. Zakażenia dolnych dróg oddechowych są rzadkie. Ropne infekcje skóry, których czynnikiem etiologicznym jest S. pyogenes, to przede wszystkim liszajec, niesztowica- owrzodzenia np. warg i nóg u kóz i owiec; i róża (łac. erysipelas) oraz ropne zapalenia tkanki łącznej podskórnej (łac. cellulitis). Szczepy wytwarzające toksynę erytrogenną B (SPE B) są odpowiedzialne za dramatyczny przebieg martwiczego zapalenia powięzi. Nie ropnym zapaleniem skóry i tkanki podskórnej związanym z toczącą się lub przebytą infekcją paciorkowcową jest rumień guzowaty. Uogólnione zakażenia paciorkowcowe to zakażenie połogowe i posocznica, której może towarzyszyć ostre zapalenie wsierdzia.
Szczepy wytwarzające toksynę erytrogenną (przede wszystkim toksynę SPE A) być przyczyną ciężkich chorób: płonicy (łac. scarlatina) - zakaźnej, wysypkowej choroby wieku dziecięcego lub zespołu wstrząsu toksycznego STSS (ang. streptococcal toxic shock syndrome), podobnego do tego, jaki wywołuje gronkowcowa toksyna TSST-1. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie toksyny erytrogennej są przenoszone przez bakteriofagi.
Odległymi w czasie następstwami przebytych zakażeń paciorkowcem ropotwórczymi, chorobami o podłożu immunologicznym, są gorączka reumatyczna i ostre kłębuszkowe zapalenie nerek. Mechanizm chronicznego schorzenia, jakim jest gorączka reumatyczną, nie jest dobrze poznany. Wiadomo, że białko M reaguje krzyżowo z miozyną mięśnia sercowego, prowadząc do choroby z autoagresji. Wyjątkowo oporna na degradację w organizmie ściana komórkowa S. pyogenes wywołuje zapalenie mięśnia sercowego i reumatyczne zapalenie stawów. Tego ostatniego schorzenia nie należy mylić z najczęściej występującą chorobą reumatyczną - reumatoidalnym zapaleniem stawów (reumatyzm, gościec stawowy). Ostre kłębkowe zapalenie nerek jest chorobą, w której przebiegu dochodzi do tworzenia i odkładania w nerkach kompleksów immunologicznych, co prowadzi zazwyczaj do nieodwracalnego uszkodzenia tego narządu.
Nazwa drobnoustroju S. agalactiae (paciorkowiec bezmleczności) wynika z jego pierwotnie wykrytej chorobotwórczości dla zwierząt hodowlanych. U człowieka S. agalactiae jest składnikiem fizjologicznej flory bakteryjnej jamy ustnej, nosogardzieli, przewodu pokarmowego i pochwy. Paciorkowiec ten może jednak wywoływać niebezpieczne zakażenia noworodków i dlatego powinien być eliminowany u ciężarnych jeszcze przed porodem. Do infekcji dochodzi bowiem podczas przechodzenia dziecka przez kanał rodny. We wczesnym okresie (w czasie pierwszego tygodnia życia) pojawia się bakteriemia i zapalenie płuc, później (u niemowląt) najczęściej opisywane jest zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych lub posocznica.
U dorosłych, u których szczególną predyspozycję stanowią cukrzyca i alkoholizm, S. agalactiae może wywołać zapalenie pęcherza moczowego i odmiedniczkowe zapalenie nerek, rzadziej inne infekcje.
S. dysgalactiae subsp. eąuisimilis (S. eąuisimilis) początkowo uważany za drobnoustrój zwierzęcy, często jest izolowany także od ludzi. Może stanowić składnik flory gardła osób zdrowych. Jest jednak także chorobotwórczy - izolowany z różnych ropnych zakażeń: zapalenia gardła, migdałków podniebiennych i zapalenia płuc, a także ropnych stanów zapalnych skóry i tkanki podskórnej. Może wywoływać martwicze zapalenie powięzi (błona, leżąca na powierzchni mięśnia), a także być czynnikiem etiologicznym zakażeń uogólnionych: posocznicy z ostrym zapaleniem wsierdzia, zakażenia połogowego, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych oraz zapalenia kości i szpiku kostnego. S. dysgalactiae subsp. equisimilis jest jeszcze stosunkowo słabo poznany, ale wykryto u niego czynniki chorobotwórczości podobne do tych, jakie występują u S. pyogenes, np: powierzchniowe białko podobne do białka M i toksynę powodującą niespecyficzną aktywację układu immunologicznego.
S. pneumoniae (pneumokok; dwoinka zapalenia płuc) jest czynnikiem etiologicznym płatowego zapalenia płuc i najczęstszą przyczyną bakteryjnego zapalenia płuc u człowieka. Może wywoływać także zapalenie oskrzeli, zatok i ucha środkowego oraz wiele innych ropnych zakażeń. Jest on, obok Neisseria meningitidis i Haemophilus influenzae, jednym z trzech najważniejszych drobnoustrojów wywołujących bakteryjne (ropne) zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Szczególne niebezpieczeństwo stanowią pojawiające się coraz częściej wielooporne, w tym oporne na penicylinę, szczepy pneumokoków.
Pneumokok może być wyizolowany z gardła zdrowych osób, zarówno dorosłych, jak i dzieci.
S. pneumoniae jest wyposażony w czynniki warunkujące jego zjadliwość, z których najważniejsza jest gruba polisacharydowa otoczka wykazująca silne działanie antyfagocytarne. O jej znaczeniu świadczy to, że szczepy jej pozbawione, nie są chorobotwórcze. W rozprzestrzenianiu się zakażenia mają znaczenie wytwarzane przez te bakterie agresyny i inwazyny: cytolizyny - m.in. pneumolizyna i leukocydyna; enzymy - fibrynolizyna, hialuronidaza i inne. Wytwarzana przez pneumokoki autolizyna przypuszczalnie ułatwia rozprzestrzenianie się szkodliwych białek w organizmie. Autolizyna ta jest też odpowiedzialna za rozpad komórek w materiałach klinicznych i w późnych fazach hodowli, co może utrudniać diagnostykę.
Większość gatunków paciorkowców jamy ustnej (grupy: S. mitis, S. mutans, S. salivarius i S. milleri) stanowi naturalną, fizjologiczną florę jamy ustnej i gardła. Zasiedlają też niejałowe fragmenty układów moczowego i płciowego. Jednak, jeśli przedostaną się do krwi (np. po ekstrakcji zęba), mogą być przyczyną ciężkich zakażeń: posocznicy, powolnego zapalenia wsierdzia, zapalenia kości i szpiku kostnego, zapalenia płuc i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Paciorkowce jamy ustnej, najczęściej wywołujące schorzenia u ludzi, to gatunki należące do grupy S. milleri (najczęściej S. anginosus). Z kolei paciorkowce z grupy S. mutans odpowiedzialne są w dużej mierze za tworzenie płytki nazębnej i inicjowanie próchnicy zębów. Charakterystyczną cechą bakterii tej grupy jest szczególnie obfite wytwarzanie wielocukrów śluzu zewnątrzkomórkowego (lewanu, dekstranu). Śluz ten odpowiedzialny jest za ich silne właściwości adhezyjne.
Liczba gatunków paciorkowców, które mogą być przyczyną zakażeń u ludzi, zwiększa się. Gatunki dotychczas opisywane jako typowo zwierzęce, były już izolowane od człowieka, np. S. canis z zakażonych ran. Gatunki S. eąui subsp. eąui i S. eąui subsp. zooepidemicus są niezwykle istotne w weterynarii, ale opisywano także zakażenia u ludzi np. po wypiciu zakażonego mleka. S. eąuinus jest chorobotwórczy dla koni i znalezienie go w materiałach klinicznych pochodzących od ludzi jest mało prawdopodobne, jednak niewykluczone.
S. bovis jest czynnikiem etiologicznym zapalenia wsierdzia (cienka błona surowicza- składająca się z komórek wytwarzających/wydzielających płyn surowiczy, wyściełająca jamę serca); rzadziej wywołuje zakażenia dróg moczowych, zapalenie opon mózgowych czy posocznice u noworodków.
Jedyny beztlenowy gatunek paciorkowców S. pleomorphus (grupa VII) dotychczas W izolowany głównie od ptactwa domowego, ale pojawiają się dane dokumentujące jego przejściowe bytowanie na błonach śluzowych człowieka (gardło, przewód pokarmowy) i możliwość wywoływania infekcji oportunistycznych.
MORFOLOGIA, CECHY HODOWLANE l RÓŻNICOWANIE
Paciorkowce są małymi (0,5-1 μm) ziarniakami barwiącymi się gramdodatnio. W starszych hodowlach komórki mogą ulegać odbarwieniu. Na płynnych podłożach tworzą łańcuszki komórek lub dwoinek (pneumokoki), nieraz znacznej długości. W materiale klinicznym widoczne są zwykle dwoinki lub bardzo krótkie łańcuszki. Wiele gatunków tworzy otoczki, jednak w preparatach z hodowli nie są one widoczne. W preparatach z materiału klinicznego (plwocina, ropa, bioptaty) dobrze widoczne są otoczki pneumokoków, otaczające dwoinki o wydłużonym, lancetowatym kształcie.
Paciorkowce mają duże wymagania wzrostowe. Są względnymi beztlenowcami. Widoczny wzrost pojawia się po 24 godzinach hodowli w 37°C. Na pożywkach płynnych, np. na bulionie Todda-Hewitta (Aneks 1-33), mogą rosnąć w postaci ziarnistego osadu na dnie lub, rzadziej, zmętnienia z małym osadem (S. pneumoniae). Izoluje się je i hoduje na wzbogaconych złożonych podłożach zawierających np. wyciąg ser-cowo-mózgowy, a dodatkowo krew lub surowicę. Pożywki wybiórcze pozwalające na izolowanie paciorkowców z materiału klinicznego zawierają 0,02% azydku sodowego, który hamuje wzrost gramujemnej flory towarzyszącej (Aneks 1-36). Na pożywkach stałych z krwią tworzą otoczone strefą hemolizy kolonie: bardzo drobne (S. pyogenes, niektóre paciorkowce jamy ustnej) lub większe (l mm) z dużą strefą hemolizy (S. eąuisimilis), czy też płaskie (2 mm) z bardzo małym rąbkiem hemolizy (S. agalactiae) albo szare, czasem z pępkowatym wgłębieniem na środku (S. pneumoniae). O dalszym postępowaniu identyfikacyjnym decyduje jednak rodzaj hemolizy.
W jednym z pierwszych schematów porządkujących paciorkowce do celów diagnostycznych podzielono je ze względu na rodzaj hemolizy, jaki wywołują na pożywkach z krwią baranią (Aneks P-3). Podział wyróżnił paciorkowce β-hemolizujące, których hemolizyny powodują rozpuszczenie krwinek - wokół kolonii powstaje wtedy całkowite przejaśnienie, i α-hemolizujące, pod których wpływem krwinki nie ulegają pełnemu rozpadowi, co sprawia, że strefa przejaśnienia jest nieprzejrzysta i wyraźnie zazieleniona. Część z tych ostatnich, paciorkowce bytujące w gardle i jamie ustnej, zyskało z tego powodu zwyczajową nazwę „paciorkowce zieleniące”. Podział ze względu na rodzaj hemolizy jest użyteczny do dziś i znacznie usprawnia diagnostykę, którą, po ocenie typu hemolizy, prowadzi się już dla mniejszej liczby gatunków. Pewnym utrudnieniem może być to, że w obrębie niektórych gatunków poszczególne szczepy mogą się różnić typem hemolizy.
Izolacja z materiału klinicznego katalazoujemnych ziarenkowców, których kolonie są otoczone strefą hemolizy β, sugeruje podjęcie próby określenia ich przynależności do grupy serologicznej według schematu Lancefield (Aneks P-9). Kolejne etapy to badanie wrażliwości na bacytracynę i kotrimoksazol (Aneks P-38, P-39). W przypadku podejrzenia o przynależność do gatunku S. agalactiae można wykonać tylko test synergistycznej hemolizy CAMP oraz próbę na rozkład hipuranu (Aneks P-31, P-l). Obok S. pyogenes dodatni test PYR (Aneks P-35), wynikający z wytwarzania enzymu pirolidonyloaryloamidazy, mają także enterokoki i to w ich identyfikacji ma on istotne znaczenie.
Wśród paciorkowców α-hemolizujących zwykle poszukuje się pneumokoków. Wykazanie wrażliwości na optochinę i rozpuszczalności w żółci (Aneks P-43, P-28). S. pneumoniae różni się wynikami tych prób od wszystkich pozostałych paciorkowców α-hemolizujących najczęściej izolowanych od człowieka. Wiąże się to z aktywacją przez żółć i optochinę autolizyn tych paciorkowców. S. pneumoniae identyfikuje się także metodami serologicznymi poszukując antygenów wielocukrów otoczkowych. Najczęściej wykonuje się odczyny lateksowe (Aneks P-13). Antygenów otoczkowych pneumokoków można poszukiwać także w moczu osób chorych. Duża różnorodność (90 typów) antygenów otoczek pozwala także na dochodzenia epidemiologiczne.
S. bovis można zidentyfikować na podstawie obecności antygenu D lokującego go wśród gatunków dobrze typujących się według schematu Lancefield. Od typujących się także w grupie D enterokoków odróżnia je wrażliwość na kotrimoksazol i ujemny test PYR. Identyfikację paciorkowców najczęściej opiera się na testach immunologicznych i handlowych gotowych zestawach prób wykrywających ich cechy metaboliczne i pozwalających na numeryczny odczyt (Aneks P-68). Dla tej grupy drobnoustrojów istnieje bardzo duża oferta pozwalająca także na używanie systemów zautomatyzowanych.
Rodzaj Streptococcus
Paciorkowce, Gram-dodatnie ziarniaki, sklasyfikowane do wspólnego rodzaju Streptococcus charakteryzują się odmiennymi właściwościami hodowlanymi oraz różną chorobotwórczością. Wśród tego rodzaju wyróżnia się gatunki, które są określane jako paciorkowce ropotwórcze, z których Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae i S. agalactiae są chorobotwórcze dla ludzi. Inna grupa — paciorkowce jamy ustnej — uczestniczą w zakażeniach oportunistycznych (korzystnych, wygodnych) u ludzi i głównie izolowane są z krwi z przypadków bakteriemii, posocznic lub zapalenia wsierdzia (przede wszystkim S. salivarius i S. sanguis). W 1989 roku opisano nowy gatunek, S. gordonii, który jest podobny do S. sanguis. Paciorkowce z gatunków S. lactis i S. raffinolactis sporadycznie wykazywane są ostatnio również w próbkach materiałów od chorych.
Chorobotwórcze dla człowieka, jako bakterie oportunistyczne, są paciorkowce beztlenowe: S. morbillorum, S. pleomorphus, S. parvulus i S. hansenii, z których S. morbillorum został ostatnio reklasyfikowany do innego rodzaju ziarniaków — Gemella, pod nazwą G. morbillorum.
Pozostałe, licznie występujące gatunki w rodzaju Streptococcus, nie są spotykane u ludzi, większość z nich, jak dotąd, wykazuje chorobotwórczość dla różnych zwierząt.
Klasyczny podział paciorkowców na grupy serologiczne wg Lancefield (1933), uwzględniający różnice węglowodanów (wielocukier C) wchodzących w skład ściany komórkowej paciorkowców, jest akceptowany dotąd jako prosty sposób różnicowania tych bakterii. Spełnia on również wymogi taksonomiczne. Do pierwotnie zróżnicowanych antygenowe 5 grup, oznaczonych A, B, C, D i E, do chwili obecnej zaliczono ponad 20 dalszych. W większości laboratoriów klinicznych tylko grupy A, B, C, D i G, a ostatnio również F, H i K, są identyfikowane rutynowo; oznacza to, że grupy te uczestniczą najczęściej w różnych zakażeniach u ludzi.
Ostatnio, na podstawie badań hybrydyzacji DNA-rRNA, wykazano, że paciorkowce kałowe grupy D serologicznej różnią się od innych niekałowych paciorkowców tej grupy. Utworzono nowy rodzaj Enterococcus, do którego zaliczono 12 następujących gatunków: E.faecalis, E.faecium, E. durans, E. avium, E. casseliflavus, E. gallinarum, E. malodoratus, E. mundtii, E. hirae, E. solitarius, E. raffinosus i E. pseudoavium.
Kliniczne znaczenie mają następujące paciorkowce, uszeregowane wg grup serologicznych Lancefield:
Grupa A
Streptococcus pyogenes: wywołują hemolizę typu β na podłożu z krwią baranią, która jest spowodowana przez hemolizynę nazywaną streptolizyna S; substancja ta nie ma właściwości antygenowych. Paciorkowce tej grupy wytwarzają drugą hemolizynę, która jest określana jako streptolizyna 0. Streptolizyna O jest białkiem (m.cz. 60000) wykazującym aktywność w stanie zredukowanym (obecność grup sulfohydrylowych). Jest inaktywowana przez tlen. Powoduje hemolizę krwi na podłożu agarowym. Wiąże się z cholesterolem błony erytrocytów, powodując ich liżę. Uszkadza również leukocyty, powoduje powstanie swoistych przeciwciał (antystreptolizyny), które ją unieczynniają. Streptolizyna O w szybkim czasie łączy się z antystreptolizyną, a tym samym zahamowaniu ulega proces hemolizy. Reakcja ta jest podstawą ilościowego odczynu oznaczania przeciwciał w surowicy osób po zakażeniu paciorkowcami należącymi do grupy A; odczyn ten nosi nazwę ASO lub ASLO (oznaczanie stężenia antystreptolizyny 0). Wartości mian przekraczające wartość 200 jednostek uważane są za znamienne dla przebytego zakażenia.
Szczepy z gatunku S. pyogenes oprócz wymienionych hemolizyn wytwarzać mogą wiele innych toksyn i enzymów. Do najważniejszych z nich należą:
1. Toksyna erytrogenna: wykazuje właściwości antygenowe, które powodują powstawanie swoistych przeciwciał neutralizujących. Osoby mające te przeciwciała są odporne na powstawanie wysypki płoniczej, lecz są wrażliwe na rozwój zakażenia paciorkowcowego. Wrażliwość na toksynę erytrogenna może być wykazana w teście skórnym Schultza-Charltona lub na podstawie odczynu Dicka. Toksyna erytrogenna odpowiedzialna jest za objawy chorobowe w płonicy (szkarlatynie), powoduje charakterystyczną wysypkę płoniczą. Wyróżnia się 3 odmiany antygenowe toksyny erytrogennej: A, B, C; najczęściej występują szczepy produkujące toksynę A. Toksyna ta jest wytwarzana w organizmie i w podłożach sztucznych. Produkowana jest tylko przez szczepy paciorkowców lizogennych.
2. Streptodornaza (deoksyrybonukleaza): wykazuje właściwości antygenowe, wykorzystana jest w chirurgii do rozpuszczania ropy, wydzielin śluzowych i martwiczych tkanek.
3. Hialuronidaza: czynnik rozprzestrzeniania, ma właściwości antygenowe.
4. Streptokinaza (fibrynolizyna): powoduje zmianę plazminogenu w surowicy ludzkiej w plazminę, aktywny enzym proteolityczny, który rozkłada fibrynę i inne białka.
W komórkach S. pyogenes obecne są następujące antygeny: wielocukier C — grupowo swoisty, który wchodzi w skład ściany komórkowej, hapten, którego swoistość związana jest z występowaniem N-acetyloglukozaminy i ramnozy; antygeny białkowe — M, T, R, z których M należy do wyznaczników chorobotwórczości. Przeciwciała anty-M mają działanie ochronne. Nukleoproteinowy antygen P — nieswoisty, wykazuje pokrewieństwo z antygenami paciorkowców zieleniących, pneumokoków i gronkowców. Znajduje się w cytoplazmie komórki. Niektóre szczepy mają otoczki. Mogą wiązać się z fibronektyną.
Gatunek S. pyogenes występuje u ludzi zdrowych w składzie mikroflory gardła oraz skóry. U ludzi odpowiedzialny jest za pierwotne zakażenia, takie jak: ostre zapalenie gardła, róża (erysipelas) — choroba skóry i tkanki podskórnej, czyraki, zakażenia ran, posocznice oraz płonicę — wysypkową chorobę zakaźną i zaraźliwą wieku dziecięcego. Następstwem przebytego zakażenia paciorkowcowego mogą być: gorączka reumatyczna, reumatyczne zapalenie wsierdzia i kłębuszkowe zapalenie nerek.
Bakterie te wymagają do swego wzrostu pożywek wzbogaconych krwią. Są wrażliwe na bacytracynę. Identyfikacja grupowego antygenu A możliwa jest w testach immunofluorescencji i aglutynacji lateksowej (gotowe zestawy handlowe, np. STREPTEX). Szczepy tego gatunku są zazwyczaj wrażliwe na penicylinę, w większości zaś oporne na tetracykliny i aminoglikozydy. Oporność na penicylinę (rzadko w Europie) nie wiąże się z produkcją β-laktamazy (mutacja, zmiany w PBP).
Grupa B
Streptococcus agalactiae: wywołują hemolizę typu β, mogą też być szczepy o typie α- i γ-hemolizy (brak). Występują w składzie mikroflory człowieka w gardle, pochwie, kale, a u noworodków w różnych miejscach. Powodują hydrolizę hipuranu, wytwarzają reakcję CAMP (lub test), charakterystyczny trójkąt strefy hemolizy na podłożu z krwią baranią lub bydlęcą, gdy posiany jest S. agalactiae i prostopadle do niego S. aureus wytwarzający β-hemolizynę. Czynnik CAMP został zaliczony do toksyny; nazwano ją Co-cytolizyna B. Szczepy tego gatunku mogą wytwarzać również cytolizyny podobne do streptolizyny S u S. pyogenes, a także deoksyrybonukleazę, hialuronidazę i neuraminidazę. W składzie budowy antygenowej komórek uwzględnia się grupowo swoisty wielocukier C oraz antygeny białkowe c (Tbc), R i X. Antygeny R i X są podobne do białka M u S. pyogenes. Specyficzne typowo antygeny wielocukrowe występujące w otoczce dzielą szczepy na serotypy: la, Ib, (Ib/c), Ic (la/c), II, III, IV i V. W skład otoczki wchodzi kwas sialowy, galaktoza, glukoza i glukozamina. Na powierzchni komórek u niektórych szczepów może występować czynnik zlepiania (dumping factor), który powoduje parakoagulację fibrynogenu; jest on białkiem. Wykazano też obecność receptorów dla fibrynogenu. Szczepy te mogą uczestniczyć w wywoływaniu zespołu wewnątrznaczyniowego wykrzepiania u zwierząt.
Paciorkowce grupy B, określane często jako GBS (group B streptococci), znane są ze swej chorobotwórczości dla zwierząt, powodują zapalenia wymion u krów; mogą też być chorobotwórcze dla psów, kóz, świń i ryb. U ludzi wywołują: posocznice połogowe, endocarditis, pneumonitis, zakażenia miejscowe ropne, zakażenia noworodkowe, takie jak: zapalenie płuc, posocznica i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Podstawowe znaczenie mają w zakażeniach okołoporodowych (śmiertelność i umieralność noworodków i niemowląt). Zakażenia noworodków klasyfikowane są jako wczesne, jeśli objawiają się do 5 dnia po urodzeniu w postaci posocznicy z wysoką śmiertelnością; jako zakażenia późne określa się te, które występują po l tygodniu życia jako zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Zakażenia te następują najczęściej w końcowym okresie ciąży lub w trakcie porodu: u matki w pochwie i u noworodka stwierdza się te same serotypy. Ponad 50% noworodków ulega kolonizacji GBS z dróg rodnych matki drogą aspiracji, rzadsze są wewnątrzmaciczne zakażenia płodu drogą wstępującą.
Ponad 95% szczepów GBS jest opornych na bacytracynę, co ma znaczenie przy ich identyfikacji (S. pyogenes, Grupa A — wrażliwe).
Diagnostyka: hodowla i identyfikacja — podobnie jak przy innych paciorkowcach.
Grupa C
S. equi — hemoliza beta: S. eąuisimilis — hemoliza beta: S. dysgalactiae — a-hemoliza. Paciorkowce są w składzie flory gardła, pochwy, skóry. Mogą wywoływać zakażenia ran. zapalenie tkanki łącznej, zapalenie wsierdzia i posocznice połogowe. Nie rosną w temperaturze 10 i 45°C, hydrolizują hipuran (znacznik), fermentują glicerol, trehalozę(disacharyd, dwie cząstki glukozy), sorbitol (bezbarwna krystaliczna substancja, cukrol, dobrze rozpuszczalna w wodzie, otrzymana po redukcji glukozy).
Sacharyd - cukier
Grupa D
Enterococcus — y-hemoliza: paciorkowce kałowe: E. faecalis (α), E. faecium (β), E. durans oraz niekałowe: S. bovis (α, y) i S. eąuinus (α). Występują w jelicie grubym. Mogą u ludzi wywoływać: zakażenia układu moczowego, ropnie w miednicy mniejszej, zapalenia otrzewnej, zakażenia ran, endocarditis, rzadziej inne. Tolerują 6,5% NaCl, hydrolizują żółć — eskulinę. Do posiewów mogą być stosowane selektywne podłoża z azydkiem sodu. Test PYR jest stosowany do różnicowania niektórych paciorkowców:
PYR (L-pirrolidonyl-β-naftylamid) jest substratem do wykazania peptydazy pirrolidonylowej. W następstwie hydrolizy substratu przez peptydazę powstaje naftylamid czerwonego koloru po dodaniu 0,01 % odczynnika cinnamaldehydu. Grupa A i D paciorkowców wg Lancefield ma zdolność do hydrolizy tego substratu, który jest specyficzny tylko dla tych dwóch grup.
Grupa F
S. anginosus—hemoliza beta: są w składzie mikroflory jamy ustnej, zębów, gardła. Mogą wywoływać: zapalenie zatok, próchnicę zębów, zapalenie płuc, ropnie mózgu, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych.
Tworzą kwas z glukozy, maltozy, salicyny, sacharozy, ale nie z inuliny, ksylozy, arabinozy i mannitolu.
Grupa G
S. canis — hemoliza beta: występują w gardle, w pochwie, na skórze. Mogą wywoływać posocznice połogowe, zakażenie ran i endocarditis. Fermentują inulinę.
Grupa H
S. sanguis — hemoliza α: są w składzie flory jamy ustnej, zębów, gardła. Wywołują próchnicę zębów, endocarditis, ropnie mózgu i posocznice. Fermentują inulinę i produkują lepki polisacharyd w bulionie z 5% sacharoza.
Grupa K
S. salivarius — hemoliza α: występują w jamie ustnej i w gardle. Mogą wywoływać: posocznice, zapalenie wsierdzia, zapalenie zatok, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Tworzą kwas z glukozy, sacharozy, maltozy, ale nie z glicerolu, mannitolu i sorbitolu.
Do identyfikacji paciorkowców mogą być wykorzystywane gotowe handlowe zestawy oraz sonda genetyczna.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae — hemoliza α: występują w gardle, w jamie ustnej i tchawicy. Nie mają antygenu grupowego — wielocukru C. Posiadają otoczki polisacharydowe: na podstawie różnic w ich składzie szczepy tego gatunku podzielono na 84 serotypy. W niektórych ośrodkach do najczęściej występujących w zakażeniach u ludzi należą głównie serotypy 4, l, 14 i 3; wywołują około 50% zakażeń. Dodatkowych 6 serotypów (12, 6, 18, 9,19, 23) odpowiada za dalsze 25% zakażeń. U dzieci zakażenia najczęściej wywoływane są przez serotypy 19, 23, 14, 3, 6, 1. Śmiertelność z powodu posocznicy lub zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych jest wysoka (~ 20%).
Bakterie te, często nazywane pneumokokami, u ludzi wywołują głównie: płatowe zapalenie płuc, posocznice, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie ucha środkowego, zatok, rzadziej miejscowe zmiany skórne. Wraz z pałeczkami z gatunku H. influenzae stanowią główne czynniki etiologiczne w zakażeniach górnych i dolnych dróg oddechowych (m. in. zapalenia oskrzeli). Pneumokokowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych dominuje w najmłodszej grupie wiekowej O—6 lat i jest na 2 lub 3 miejscu wszystkich bakteryjnych czynników z tą lokalizacją. W przeciwieństwie do meningokokowego, często obserwuje się nawroty meningitis u pacjentów z przewlekłym zapaleniem kości oraz złamaniami w kościach twarzowych; dotyczy to małych dzieci oraz ludzi starych. Bakterie te są wrażliwe na optochinę (ważne przy identyfikacji), rozpuszczalne w żółci. Do typowania serologicznego mogą być stosowane testy DIF, aglutynacja szkiełkowa, CIĘ, EIA, ELISA, LA oraz inne. W płynie mózgowo-rdzeniowym, we krwi i moczu mogą być wykrywane rozpuszczalne antygeny polisacharydów otoczkowych; dostępne są w handlu gotowe zestawy (Wellcogen, Streptex, inne). Jakkolwiek zgodność wyników wykrywania antygenów z metodą hodowlaną wynosi ponad 90%, nie zwalnia to od pełnego badania bakteriologicznego. Mogą być krzyżowe reakcje serologiczne.
Szczepy S. pneumoniae są jak dotąd w krajach Europy Pomocnej wrażliwe na penicylinę. Większość szczepów jest opornych na tetracyklinę, o czym lekarz powinien pamiętać wybierając do leczenia zakażenia układu oddechowego np. doksycyklinę. Niektóre kraje notują występowanie szczepów opornych na penicylinę (m.in. do 40% w Hiszpanii i około 1% w Wielkiej Brytanii). Oporność wiąże się z utratą powinowactwa (wiązania) do penicyliny przez PBP (głównie PBP 2b), a nie z produkcją β-laktamazy. U szczepów mutantów są zmiany we wzorze PBP i w strukturze mureiny (szczepy wrażliwe 5 białek PBP).
Rodzaj Enterococcus (paciorkowce kątowe; enterokoki)
klasyfikacja i chorobotwórczość
Enterokoki dawniej klasyfikowane jako paciorkowce (Streptococcus) grupy D w wyniku badań filogenetycznych uzyskały status oddzielnego rodzaju. Nie wszystkie wyodrębnione gatunki mają w ścianie komórkowej antygen D.
Enterokoki bytują w przewodzie pokarmowym i stanowią składnik flory jelitowej ludzi zdrowych, a czasem są spotykane w jamie ustnej. Są to patogeny oportunistyczne, które mogą powodować infekcje poza swoim fizjologicznym miejscem bytowania, szczególnie u osób z niepełnosprawnym układem odpornościowym. Mogą być przyczyną zakażeń dróg moczowych, bakteriemii, zapalenia wsierdzia.
Wyodrębniono kilkanaście gatunków rodzaju Enterococcus. W materiałach klinicznych pochodzących od ludzi dominują E. faecalis (80-90%) i E. faecium (10-15%), a spośród pozostałych gatunków sporadycznie spotykane są: E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum i E. raffinosus.
Enterokoki nie dysponują licznymi czynnikami chorobotwórczości. Opisano wytwarzaną przez niektóre szczepy adhezynę (substancja agregująca), a także sprzyjające rozprzestrzenianiu się enzymy (hialuronidaza). Wykryta niedawno cytolizyna E. faecalis wykazuje aktywność bakteriocyny, a jednocześnie działanie letalne w modelach zwierzęcych - stanowią ją dwa peptydy modyfikowane potranslacyjnie. Niebezpieczeństwo związane z wywołanymi przez enterokoki infekcjami wynika w największej mierze z ich szerokiej naturalnej, a często także nabytej wielooporności antybiotykowej.
morfologia, cechy hodowlane
Enterokoki to gramdodatnie, nieco owalne, duże (do 2,5 μm) ziarenkowce. W preparatach tworzą pary, krótkie łańcuszki lub nieregularne skupiska.
Są względnie beztlenowe, wyrastają na pożywkach prostych w temperaturze od 10°C do 45°C (temperatura optymalna 35°C) w ciągu 18-24 godzin. Na pożywkach płynnych tworzą zmętnienie, na stałych budują najczęściej duże (2 mm) szarawoprzejrzyste kolonie. Na agarze z krwią, niektóre rzadko spotykane szczepy, mogą powodować hemolizę α lub β, zwykle jednak nie hemolizują krwinek.
identyfikacja i różnicowanie
Zdolność do wzrostu na zwykłych pożywkach, a także na bulionie z dodatkiem 6.5% NaCl wyraźnie odróżnia rodzaj Enterococcus od paciorkowców. Paciorkowce kałowe mają zdolność wyrastania na podłożu BE - z żółcią i eskuliną, zabarwiając na czarno pożywkę już w 1-4 godziny po posiewie. Jedyne paciorkowce również rosnące na tej pożywce : Streptococcus bovis zaczerniają pożywkę dopiero
po kilkunastu godzinach (Aneks 1-38). Na podstawie cech wymienionych w tabeli 2.9 podobieństwo do β-hemolizujących szczepów E. faecalis może wykazywać S. pyogenes, który daje także dodatni wynik testu PYR (Aneks P-35). Jednak wyniki pozostałych prób wymienionych w tabeli, ocena wzrostu na podłożach i wykonanie prób charakterystycznych dla paciorkowca ropotwórczego powinny rozstrzygnąć wszystkie wątpliwości. Zdecydowaną większość infekcji u ludzi wywołują dwa gatunki enterokoków: E. faecalis i E. faecium. Podstawową cechą różnicującą je jest zdolność rozkładu arabinozy, ale także, jeśli szczep jest hemolizujący, rodzaj hemolizy na agarze z krwią. Pomocna jest także próba na redukcję chlorku tetrazoliowego TTC (Aneks P-58).
Poszukiwanie do celów epidemiologicznych wieloopornych szczepów enterokoków w kale zagrożonych pacjentów może być wykonywane przez posiew np. na podłoże agarowe z arabinozą z dodatkiem cefaleksyny i aztreonamu (Aneks 1-16). Opracowywanych jest wiele genetycznych i molekularnych metod identyfikacji enterokoków, szczególnie szczepów opornych na wankomycynę (VRE - ang. vanco-mycin resistant enterococci). Nosicielstwo tych ostatnich, badane szeroko w USA, dotyczy aż kilku procent osób hospitalizowanych.
Paciorkowce zależne pokarmowe NVS
(ang. nutritionally variant streptococci)
Wśród paciorkowców izolowanych z gardła i z dróg moczowych opisano grupę gatunków, które wykazują szczególne cechy. Wyrastają one satelitarnie wokół kolonii innych bakterii, co - jak się okazało - wynika z ich szczególnych potrzeb pokarmowych. Do wzrostu wymagają bowiem bogatej, złożonej pożywki wzbogaconej dodatkowo L-cysteiną lub chlorowodorkiem pirydoksalu. Drobniutkie kolonie są widoczne dopiero po 48 godzinach hodowli na tych pożywkach.
Pozycja taksonomiczna tych bakterii przez wiele lat była niejasna, klasyfikowano je wśród paciorkowców zieleniących. Obecnie w wyniku badań filogenetycznych zaliczono je do dwóch rodzajów: Abiotropha i Granulicatella. Paciorkowce te odgrywają istotną rolę w patologii człowieka, stanowiąc czynnik etiologiczny około 6% infekcyjnych zapaleń wsierdzia. Izolowano je także w przypadkach innych zakażeń. Szczególnie ważne są gatunki Abiotropha defectiva i Granulicatella adiacens. Ich różnicowanie z paciorkowcami zieleniącymi opiera się na wielu właściwościach, które najlepiej określić wykorzystując handlowe zestawy biochemiczne dla tej grupy bakterii.
Ziarenkowce paciorkowcopodobne
W materiałach klinicznych pochodzących od ludzi można czasem spotkać drobno ustroje podobne do paciorkowców, stanowiące florę towarzyszącą lub przypadkowe zanieczyszczenie. Są to zazwyczaj także katalazoujemne ziarenkowce z rodzajów Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc i Pediococcus. Bakterie tych rodzajów wyjątkowo mogą wywoływać infekcje oportunistyczne, a ich obecność w materiałach klinicznych jest zwykle przypadkowa. Istnieje niekiedy konieczność odróżnienia ich od rodzajów i gatunków uznanych za chorobotwórcze.
17
17