1. Metody klonowania do wektorów plazmidowych

Klonowanie może być:

- kierunkowe,

- niekierunkowe

kierunek wklonowania insertu zależy od użytych do klonowania lepkich lub tępych końców

kierunkowe - przez uzycie koncow lepkich, ale 2 roznych

niekierunkowe - przez uzycie koncow tepych lub tych samych lepkich

Końce fragmentów obcego DNA	Wymagania w klonowaniu	Uwagi :
Tępe	duże stężenie DNA i ligazy	Tło klonów nierekombinantowych może być wysokie Miejsca restrykcyjne przy połączeniach plazmidu i obcego DNA mogą być eliminowane Plazmidy rekombinantów mogą zawierać tandemowe kopie obcego DNA Niska wydajność Gen może się wklonować w dwóch orientacjach Może dojść do odwrotnego wklonowania insertu Może dojść do sytuacji gdzie połączą się ze sobą plazmidy jak i inserty
Lepkie ( kohezyjne ) różne, uzyskiwane przy pomocy różnych enzymów restrykcyjnych	Otrzymywanie maksymalnej wydajności ligacji wymaga oczyszczenia wektora plazmidowego po cieciu dwoma enzymami restrykcyjnymi	Miejsca restrykcyjne przy połączeniach między plazmidem a obcym DNA są zwykle zachowane Tło klonów nierekombinantowych jest niskie Obce DNA jest klonowane tylko w jednej orientacji w plazmidzie rekombinanta
Lepkie ( kohezyjne ) identyczne, uzyskiwane przy pomocy tych samych enzymów restrykcyjnych	Liniowe DNA plazmidu wektora należy traktować fosfatazą	Miejsca restrykcyjne przy połączeniach miedzy plazmidem a obcym DNA są zwykle zachowane Obcy DNA może być wklonowany w każdej orientacji Plazmidy rekombinantów mogą zawierać tandemowe kopie obcego DNA

W technice rekombinowania i klonowania DNA stosuje się ligazę uzyskiwaną z komórek E.coli zakażonych fagiem T4. ligaza faga T4 różni się od ligazy komórkowej E.coli wymaganiami w stosunku do kofaktorów, pierwsza z nich jest zależna od ATP, a druga od NAD. Ligaza E.coli, w przeciwieństwie do ligazy faga T4, nie jest w stanie połączyć fragmentów DNA nie mających wolnych, jednoniciowch zakończeń, tzw. „lepkich końców” ligaza DNA z faga T4. jest w stanie wydajnie łączyć tępe końce , nawet w normalnych warunkach reakcji. Wadą jest jej mniejsza specyficzność rozpoznawania struktury końców , co daje większe tło w doświadczeniach spowodowane nieprawidłowymi ligacjami.

• Ze względu na wydajność reakcji ligacji korzystnym jest, by łączone fragmenty DNA były wyposażone w lepkie końce.

• Jak wiadomo fragmenty takie uzyskuje się w przypadku trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi, takimi jak np. EcoRI lub HindIII.

• Najpowszechniej stosowana technika łączenia obcego DNA z DNA wektora polega na przecięciu wektora tym samym enzymem restrykcyjnym, jaki był użyty do pofragmentowania obcego DNA, a następnie potraktowaniu ligazą mieszaniny fragmentów DNA i liniowych cząsteczek wektora.

3. Modyfikacja i restrykcja

System restrykcji-modyfikacji u E. coli

Cele:

- ochrona przed degradacją przez restryktazy DNA gospodarza,

- niszczenie obcego DNA (np. DNA bakteriofaga)

Mechanizm:

W komórce istnieją dwa enzymy rozpoznające sekwencję palindromiczną DNA:

a) restryktaza (np. EcoRI),

b) metylaza EcoRI,

oba enzymy rozpoznają tę samą sekwencję: restryktazą tnie DNA w jej obrębie (tworzą się lepkie końce); metylaza natomiast etyluje adeninę występującą w tej sekwencji. Jeśli sekwencje zawiera zmetylowaną adeninę (A^Me), miejsce to nie jest już podatne na działanie rstryktazy.

No i rysunek to obrazujący (Kur ma ludzi od wszystkiego, nawet talentem do rysowania obdarzonych. Oby takich więcej było, daj nam Panie!):

4. Polimzerazy DNA

Polimeraza DNA - enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA. Synteza ta polega na polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych między nimi. Substratami do tej reakcji są nukleotydy trójfosforanowe, a jej produktem ubocznym jest pirofosforan, złożony z dwóch reszt fosforanowych. Dlatego składnikami DNA są nukleotydy jednofosforanowe (monofosforanowe). Większość polimeraz DNA wymaga matrycy, w formie jednoniciowego DNA lub RNA, z krótkim obszarem dwuniciowym. Odcinek dwuniciowy powstaje przez przyłączenie się do jednoniciowej matrycy krótkiego komplementarnego do matrycy odcinka DNA lub RNA, zwanego primerem (prajmerem) lub starterem (zwykle ma długość od kilku do ok. 20 nukleotydów).

BAKTERYJNE POLIMERAZY

DNA polimeraza I (polimeraza Kornberga)

Enzym monomeryczny (zbudowany z pojedynczego łańcucha polipeptydowego), masa ok. 109 kDa, odkryty przez Artura Kornberga, czasami więc nazywany enzymem Kornberga. Posiada trzy aktywności enzymatyczne:

• Polimerazy DNA

• Egzonukleazy 3' 5' weryfikuje poprawność wbudowanych nukleotydów i jeśli trzeba wycina je

• Egzonukleazy 5'3' jak rybonukleaza wycina fragmenty starterowe RNA i syntetyzuje w to miejsce DNA. Wycina także dimery pirydynowe.

Właściwości:

5'3' DNA zależna polimeraza DNA wymagająca do swojej aktywności matrycy jednoniciowego DNA(ssDNA) i primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.

5'3' egzonukleaza degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybryd DNA-RNA od końca 5'-P

3'5' egzonukleaza degradująca dwunicowy DNA (ds.DNA) Lu jednoniciowy DNA (ssDNA) od końca 3'OH

Zastosowanie:

znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć

synteza nici cDNA w połączeniu z RNazą H

Warunki reakcji polimeryzacji:

• pH=7,4

• jony MG2+

• reakcja prowadzona w temperaturze pokojowej lub 25 w buforze 10 x stężonym (500m Tris-HCl)

DNA polimeraza I (fragment Klenowa)

Źródłem tego enzymu jest produkt proteolizy polimerazy Kornberga subtylizyną. Enzym ten jest także otrzymywany z rekombinanta E.coli syntezujące białko z zmienionego genu polA. Ma masę cząsteczkową 75kD i brak mu aktywności 5' 3' egzonukleaz.

Właściwości:

5'3' DNA-zależna polimeraza wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'OH

35; egzonukleaza degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA) od końca 3'OH

Zastosowanie:

• Wypełnianie i nakowanie dwuniciowego DNA z 5' jednoniciowym lepkim końcem

• Znakowanie ssDNA metodą wydłużania startera

• Synteza drugiej nici cDNA

• Synteza komplementarnej nici w mutagenezie miejscowo-specyficznej

• Synteza sond ssDNA

• Znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć

Polimeraza DNA II

Zbudowana jest z jednoniciowego DNA o masie 120 000Da. Występuje w liczbie ok. 40 cząsteczek na komórkę.

Zawiera jedną aktywność egzonukleolityczną 3'5'

stanowi alternatywną drogę uzupełniania luk w nici nieciągłej RNazy H wycinającej startery

bierze udział w naprawie DNA

Polimeraza DNA III

Enzym heteromultimeryczny (złożony z kilku niejednakowych łańcuchów polipeptydowych), masa ok. 900 kDa, będący głównym inicjatorem replikacji DNA. Syntetyzuje z prędkością ok. 1000 wiązań na sekundę główną masę nowopowstałej, komplementarnej do matrycowej nici DNA.

W odróżnieniu od polimerazy DNA I działa w sposób ciągły, to znaczy oddysocjowuje od matrycy dopiero po zakończeniu replikacji. Łączy się tylko z jednoniciowym DNA, do którego przyłączony jest starter, wytwarzany przez enzym prymazę, wchodzący w skład prymosomu. Przyłączając się do prymosomu polimeraza III przekształca go w replisom.

Największą podjednostkę mającą aktywność polimeryzującą DNA jest podjednostka α o masie 130 000Da. Kodowana jest przez gen polC Z komórek bakteri wraz z podjednostką α wydzielane są także podjednostki ε i θ któ®e razem stanowią jednostkę podstawową (rdzeń)

Podjednoistka ε jest egzonukleazą sprawdzającą o kierunku działania 3'5' Jest kodowana przez gen dna. Oczyszczona do homogenności jest bardzo mało aktywna ale po połączeniu z podjednostką α jej aktywność nukleolityczna wzrasta wielokrotnie. Obecność jej jest niezbędna do zachowania dokładności replikacji

Rdzeń enzymu wykazuję niską aktywność polimeryzacyjną i bardzo niską procesywność. Ta forma enzymu odłącza się od matrycy po dołączeniu jednego lub najwyżej kilku nukleotydów.

Podjednostka τ jest ATPazą zależną od jednoniciowego DNA i ma właściwości porządkowania struktury jednoniciowego DNA np. rozwijania struktury „szpilki do włosów”.

Polimeraza DNA faga T4

Źródłem tego enzymu są bakterie E.coli zakażone fagiem T4 rekombinant e.coli syntetyzujący to białko z klonowanego genu polimerazy T4. DNA polimeraza faga T4 jest pojedynczym polipeptydem o masie cząsteczkowej 114 kD i brak jej aktywności egzonukleazy 53'. Więc jest funkcjonalnie podobny do fragmentu Kleona przy czym polimeraza T4 posiada bardziej aktywną egzonukleazę 3'5'

Właściwości:

5'3' DNA-zależna polimeraza DNA wymagająca do aktywności m,ar\trycy jednoniciowego DNA i primera DNA lub RNA z końcem 3'OH

3'5' egzonukleaza degradująca od końca 3'OH dwuniciowy DNA lub jednoniciowy DNA

Aktywność 3'5' egzonukleazy polimerazy T4 umożliwia enzymowi przeprowadzić reakcje wymiany z cząsteczkami dsDNA posiadającymi tępe lub 3' wiszące końce

Zastosowanie:

• Wypełnianie i znakowanie dwuniciowego DNA z 5; końcem jednoniciowym ,lepkim końcem

• Znakowanie dsDNA przez reakcję wymiany

• Wypełnianie luk w DNA w mutagenezie miejscowo-specyficznej z krótkimi oligonukleotydami

• Wykrywanie dimerów tyminowych

DNA polimeraza faga T7

Źródłem tego enzymu są bakterie E.coli zakażone fagiem T7. DNA polimeraza faga T7 jest dimerem złożonym z produktu genu 5 faga T7 i tioredoksyny E.coli. Produkt genu 5 posiada aktywność polimerazy/egzonukleazy a białko E.coli ściśle wiąże kompleks z matrycą DNA, zapobiegając wczesnej aktywności dysocjacji podczas syntezy komplementarnej nici. Enzym jest funkcjonalnie podobny do fragmentu Kleona, lecz charakteryzuje się szybszym stopniem syntezy DNA

Właściwości: 5'3' DNA-zależna polimeraza DNA wymaga do aktywności matrycy jednoniciowego DNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH

3'5' egzonukleaza degradująca od końca 3'OH dwuniciowy DNA lub jednoniciowy DNA

Zastosowanie:

Używany alternatywnie z fragmentem Klenowa, szczególnie w tych przypadkach które wymagają dużej szybkości syntezy i dobrego wiązania z matrycą.

DNA Polimeria Tag

Źródłem tego enzymu są bakterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E.coli. Enzym ten jest funkcjonalnie podobny do DNA polimerazy I z E.coli. Cenna jego właściwością jest termostabilność w zakresie temperatur od 37-94 ºC a optimum działania to 80 ºC.

Właściwości

5'3' DNA-zalezna polimeraza wymagająca do aktywności matrycy DNA jednoniciowego oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'OH

35' egzonukleaza degradująca od końca 5'-P dwuniciowy DNA lub hybryd DNA-RNA

Zastosowanie

• Amplifikacja DNA -PCR

• W sekwencjowaniu DNA metodą Sangera

• W genomowym `footprintingu”

Odwrotna transkryptaza

Źródłem są kurczęta zainfekowane wirusem AMV lub rekombinant E.coli z wklonowanym genem AMVpol. Odwrotna transkryptaza AMV jest to białko dimeryczne złożone z podjednostek o masach cząsteczkowych 62 i 94 kD. Mała podjednostka jest proteolitycznym produktem dużej podjednostki.

Właściwości:

5'3' Dna -lub RNA zależna poimeraza DNA wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA lub jednoniciowego RNA oraz priomera DNA lub RNA z końcem 3'OH

5'3' i 3'5' aktywność egzonukleazy specyficznej dla RNA w hybrydzie DNA-RNA

Aktywność DNA endonukleaz

Zastosowanie:

• Synteza pierwszej nici DNA

• Sekwencjonowanie RNA

• Sekwencjonowanie DNA szczególnie dla regionów bogatych w G+C

• Szukanie drugorzędowych struktur RNA

• Znakowanie 3' końców fragmentów DNA

Polimerazy DNA komórek eukariotycznych

Polimeraza DNA α

Polimeraza ta nie ma aktywności egzonukleazy sprawdzającej 3'5' natomiast zawsze towarzyszą jej dwie podjednostki zawierające aktywność primazy. Podjednostka większa oprócz aktywności syntetyzującej wykazuje także aktywność egzonukleazy sprawdzającej 3'5'

Polimeraza DNA β

Enzym zajmujący się (wraz z polimerazą ε) naprawą uszkodzeń DNA. W związku z tym jej aktywność przejawia się, jeśli wystąpi konieczność naprawy uszkodzeń tj. głównie poza fazą S cyklu komórkowego kiedy to jest najaktywniejszą z polimeraz. Bywa przyrównywana per analogiam do bakteryjnej polimerazy DNA II. Enzym ten jest najmniejszą ze wszystkich polimeraz eukariotycznych o masie cząsteczkowej 40 000Da.

Polimeraza DNA ε

Enzym działający wraz z polimerazami DNA: α i δ, zajmujący się podobnie jak polimeraza DNA δ syntezą nici wiodącej. Razem z polimerazą DNA δ ma aktywność egzonukleazową, dzięki której może naprawiać błędy powstałe w trakcie replikacji. Jej aktywność zależy od obecności PCNA chociaż charakteryzuje się wysoką procesywnością także przy braku tego antygenu. W jej skład wchodzi wiele podjednostek białkowych

6. marker selekcyjny znajdujący się na wektorze gen pozwalający odróżnić bakterie

posiadające plazmid od takich, które go nie zawierają. Jako markery najczęściej

stosuje się geny oporności na antybiotyki (np. ampicylinę lub tetracyklinę). Podczas

transformacji tylko nieliczne bakterie przyjmują plazmid, ale tylko one będą w stanie

wyrosnąć na pożywce z dodatkiem antybiotyku. Oczywiście szczep użyty do

transformacji musi być wrażliwy na ten antybiotyk.

7. enzymy klasy IIs

Klasa II- ogólnie

- najważniejsze dla inżynierii genetycznej,

- posiadają wysoką specyficzność rozpoznawanej sekwencji

- dają powtarzalne produkty cięcia

- nie wymagają ATP i S-adenozylo-L-metioniny, a jedynie jonów Mg

- aktywność metylazy i endonukleazy rozdzielone są między dwa białka

- rozpoznają krótkie najczęściej palindromiczne sekwencje 4-8pz i trawią DNA w obrębie niej lub w określonej odległości.

Enzymy klasy IIS (sziftery)

- monomery w roztworze, rozpoznają asymetryczną sekwencję, ale tną w zdefiniowanej odległości od niej,

- 1-20 pz

- np. Fokl - GGATGN_9/13

8. TEMPERATURA PRZYŁĄCZANIA PRIMERÓW.

Drugim etapem reakcji PCR jest: hybrydyzacja - przyłączania ( annealingu ) primerów do miejsca komplementarnego matrycy (1-2' ; 37-72^oC).

Próbę chłodzi się do temperatury, która umożliwia przyłączenie się primera do jednoniciowego DNA, ale nie pozwala na powtórne uformowanie się helisy z nici matrycowych.

• Temperatury przyłączania starterów dobiera się eksperymentalnie - optymalne temperatury annealingu dla starterów wyznacza się wykorzystując m.in. program VNTI.

• Stosowana temperatura mieści się zwykle pomiędzy 37-72 °C i jest uzależniona od sekwencji i liczby zasad w starterze [długość i skład ( G-C - wyższa temp.)

• Czasy i temperatury w dużym stopniu zależą od wielkości produktów otrzymywanych w procesie amplifikacji oraz sekwencji i długości starterów

• Temperatura ma istotny wpływ na prawidłowe przeprowadzenie reakcji amplifikacji - gdy jest zbyt wysoka to niemożliwe jest przyłączenie sekwencji startera do fragmentu komplementarnego na genomowym DNA, a gdy jest zbyt niska - powstaje dużo niespecyficznych produktów.

Temperatura 56°C jest temperaturą wyznaczona eksperymentalnie i jest to temperatura przyłączania części komplementarnej startera, natomiast 66°C to temperatura przyłączania całego primera.

Temperatura hybrydyzacji (ang. annealing) zależy głównie od budowy primerów, tzn. im więcej jest G/C w stosunku do A/T, tym jest ona wyższa.

Inne czynniki wpływające na tę temperaturę to:

• długość startera

• skład buforu reakcyjnego

Przy długości primera 14-19 oraz 36-70 bp temperaturę tę można obliczyć zgodnie z wzorem

T_m = 81,5 + 16,6 [log₁₀(J⁺)] + 0,41 (%GC) - (600/L) - 0,63(%F)

gdzie J⁺ to stężenie jonów jednowartościowych

L to długość primera w bp

F to procentowe stężenie formamidu (przy braku formamidu ten człon równania wynosi 1).

Przy długości primera 20-35 bp wygodniej jest stosować uproszczoną formułę

T_m = [0,5 x (T_mF + T_mR)] - 7^o C,

gdzie T_mF i T_mR to temperatury podane na "metryczkach" przez wytwórcę

primerów.

Niestety, czasami może się okazać, że rzeczywista temperatura hybrydyzacji różni się od wyliczonej nawet o 12^o C. Z tego powodu w praktyce laboratoryjnej najlepiej jest ustalać temperaturę hybrydyzacji doświadczalnie, przy użyciu termocyclera z termogradientowym blokiem grzewczym.

9. PCR/RFLP

Produkt amplifikacji poddaje się analizie restrykcyjnej i w wyniku tego otrzymuje się specyficzny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Jako cel molekularny w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się fragment DNA specyficzny dla danego gatunku lub kilku gatunków spokrewnionych o podobnym znaczeniu klinicznym. Uzyskane produkty amplifikacji można następnie poddać trawieniu enzymami restrykcyjnymi. W wyniku restrykcyjnego cięcia produktów PCR otrzymuje się specyficzny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych dla danego DNA (RFLP). Połączenie obu technik (PCR i RFLP) pozwala na różnicowanie blisko spokrewnionych organizmów lub szczepów . Wybór odpowiedniej restryktazy jest podyktowany przez charakter produktu amplifikacji.

Technika ta stosowana jest do identyfikacji, badania zróżnicowania genetycznego bakterii, do tworzenia drzew filogenetycznych oraz do badań epidemiologicznych. Ponieważ odległości ewolucyjne mogą być mierzone na podstawie różnic w sekwencji nukleotydowej bądź aminokwasowej homologicznych cząsteczek. Ilość różniących się sekwencji w makrocząsteczkach z analizowanych przez nas organizmów jest proporcjonalna do stabilnych mutacji. Jednak nie każda cząsteczka, nie każdy gen jest odpowiednim obiektem do badań pokrewieństwa między organizmami. Musi ona/on spełniać następujące warunki:

• Być funkcjonalna homologicznie;

• Uniwersalna i rozpowszechniona w grupach, które są obiektem naszych badań;

• Złożona z elementów silnie zakonserwowanych, a także z elementów zmiennych;

• Umiejętnie zaszeregowana w celu identyfikacji regionu sekwencji homologicznej jak i heterologicznej.

Najczęściej stosowanymi chronomerami są:

• Cytchromy;

• Ferrodoksyna;

• Gen recA;

• Gen gyrB;

• Gen ATPazy;

• Gen NADP;

• Tzw. housekeeping genes.

10. Nukleazy, nukleinazy, potoczna nazwa enzymów należących do grupy hydrolaz, rozkładających kwasy nukleinowe. Katalizują rozkład wiązań fosfodiestrowych utworzonych pomiędzy kwasem ortofosforowym(V) a grupą hydroksylową rybozy lub dezoksyrybozy.

W zależności od miejsca działania nukleazy dzielą się na endonukleazy - hydrolizujące wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe łańcucha polinukleotydowego oraz egzonukleazy - powodujące odszczepianie końcowych nukleotydów. W zależności od rodzaju rozkładanego kwasu rozróżnia się: dezoksyrybonukleazy - działające na DNA oraz rybonukleazy - działające na RNA. Nukleazy występują w każdej komórce, a także pozakomórkowo, np. w soku trzustkowym.

W badaniach biochemicznych wykorzystuje się trawienie kwasów nukleinowych za pomocą nukleaz w celu zbadania struktury tych kwasów.

Endonukleazy specyficzne dla jednoniciowego kwasu nukleinowego, bardziej aktywne dla ssDNA niż ssRNA:

• nukleaza BaI31

• nukleaza S1

• Nukleaza P1

Rybonukleaza A - endorybonukleaza przecinająca wiązanie fosfodiestrowe 3` przy pirymidynach; nie wykazuje aktywności w stosunku do DNA. Stosowana do usuwania RNA z preparatów DNA (izolacja plazmidowego DNA) i do mapowania punktowych mutacji w DNA i RNA.

Rybonukleaza H - endorybonukleaza specyficzna wobec RNA w hybrydach DNA-RNA. Stosowana do syntezy komplementarnej nici cDNA; wykrywanie hybryd DNA-RNA; usuwanie ogonów poli(A) z mRNA; badanie starterów RNA w syntezie DNA.

Deoksyrybonukleaza I - degraduje ssDNA i dsDNA przez preferencyjne cięcie 5`pirymidyn, daje mono i oligonukleotydy o przeciętnej wielkości 4nt. Stosowana do usuwania DNA podczas pracy z RNA; lokalizacja miejsc wiązania białek z DNA; wykrywanie miejsc transkrypcyjnie aktywnych w chromatynie; usuwanie matrycy DNA po transkrypcji in vitro; tworzenia subklonów nachodzących na siebie w sekwencjonowaniu DNA.

Nukleaza T7 - aktywna w stosunku do DNA i RNA, jedno i dwuniciowego. Stosowana do trawienia chromatyny w celu przygotowania nukleosomów.

Endonukleaza T7 - specyficzna dla ssDNA.

Egzonukleaza I - 3`->5` egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla ssDNA.

Egzonukleaza III - jest nieaktywna w stosunku do ss i dsDNA z lepkimi końcami 3` wielkości 4 nt lub więcej. Właściwości: 3`->5` egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla dsDNA z końcami 3`OH; specyficzna do RNA w hybrydach RNA-DNA. Stosowana do tworzenia subklonów nachodzących na siebie w sekwencjonowaniu DNA; techiki mutagenezy.

Egzonukleaza VII - 3`->5`i 5`->3` egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla ssDNA. Stosowana do mapowania egzonów.

11. Enzymy termostabilne

Są to enzymy wyizolowane z organizmów termofilnych. Termofile to organizmy, które żyją w temperaturze 50-80^oC, tolerują nawet warunki gdzie pH jest poniżej 0,5. Zasiedlają obszary wulkaniczne, bytują w pobliżu wulkanów lądowych i podmorskich. Wszystkie enzymy, które udało się wydzielić z termofilnych bakterii są trwałe nawet w temperaturze powyżej 100°C. Interesujące wyniki przyniosło doświadczenie, w którym gen pochodzący z termofilnych bakterii Pyrococcus furiosus kodujący białko zwane ferrodoksyną, wprowadzono do "najzwyklejszej" pod względem wymagań środowiskowych mezofilnej bakterii Escherichia coli. Tak zmienione komórki E. coli wytwarzały ferrodoksynę odporną na wysoką temperaturę. Cecha termostabilności zapisana jest więc w genie, a zatem jej ujawnienie nie wymaga żadnych dodatkowych czynników ani szczególnych warunków otoczenia. Pomiędzy białkami pełniącymi te same funkcje w organizmie, ale uzyskanych z bakterii termofilnych i „normalnych” nie widać żadnych istotnych różnic, poza specjalnym zwinięciem łańcucha białka termofilów, które umożliwia maksymalne schowanie atomów we wnętrzu cząsteczki. Ogranicza to ich oddziaływanie ze środowiskiem zewnętrznym. Z badań fizycznych termoenzymów wynika, że różnica w swobodnej energii stabilizacji między nimi a enzymami "tradycyjnymi" jest niewielka, rzędu 5-15 kcal/mol, co oznacza, iż różnice chemiczne dotyczą tylko niewielkiej liczby wiązań (wodorowych, hydrofobowych, mostków solnych). Termoenzym ma w porównaniu ze zwykłym enzymem bardziej "sztywną" strukturę przestrzenną, bardziej "upakowaną" wokół hydrofobowego rdzenia (hydrofobowy - stroniący od wody, a więc kryjący się wewnątrz cząsteczki białka). Każda wolna przestrzeń wewnątrz cząsteczki białka jest u termoenzymów wypełniona hydrofobowymi resztkami aminokwasów: w zwykłych enzymach miejsca te zajmują często cząsteczki wody. Ochrona jednej grupy hydrofobowej przed oddziaływaniem z wodą zwiększa energię stabilizacji całej cząsteczki o około 1.3 kcal/mol. Sumaryczny skutek kilku podobnych zmian powoduje, że na przykład objętość wszystkich wolnych wewnętrznych przestrzeni w termoenzymie syntazie cytrynianowej odpowiada 30% takich objętości analogicznego enzymu wydzielonego z komórek świni. Istotną rolę w stabilizacji termoenzymów odgrywają także tzw. mostki solne. Ich zlikwidowanie (w wyniku pewnych zabiegów chemicznych) w termostabilnej alfa-amylazie praktycznie znosi całą jej odporność na temperaturę.

Niewielkie zmiany w składzie i kolejności pojedynczych aminokwasów mogą zmieniać naprężenia strukturalne całej cząsteczki enzymu, a także ułatwiać tworzenie się dłuższych odcinków o stabilnej strukturze przestrzennej (np. helis alfa), z jednoczesnym skracaniem odcinków nieuporządkowanych (tzw. pętli), od których rozpoczyna się destabilizacja termiczna całego enzymu. Zjawisko to można było jednoznacznie wykazać metodami inżynierii genetycznej. Wykazano, że utrata aktywności katalitycznej przez zwykłe enzymy wiąże się zazwyczaj z rozpadem wszystkich typów struktur przestrzennych danej cząsteczki białka, po czym następuje jego wytrącanie. W przypadku termoenzymów szybciej od zniszczenia struktury dochodzi do nieodwracalnych zmian w budowie chemicznej. Następuje bowiem pękanie łańcucha peptydowego, uwalnianie grup funkcyjnych itp.

Hodowla ekstremofili (termofili, barofili, psychrofili) w celu wyizolowania z nich enzymów wymaga nietypowych warunków. Nie sposób ich hodować w standardowym laboratorium, bo tam stosuje się warunki, które one odczuwają jako skrajne. Giną więc w temperaturze 37°C lub przy ciśnieniu 1 atmosfery. "Zabawa" z tymi bakteriami wymaga inwestycji w nietypowy sprzęt, a także aparaturę. Redukujące siarkę termofile wytwarzają wiele związków przyspieszających korozję i dlatego nie można ich hodować w klasycznych, metalowych fermentorach. Termoacidofile wytwarzają nierozpuszczalne tlenki metali, które szybko pokrywają szklane naczynia oraz korodują metalowe. Barofile wymagają naczyń odpornych na wysokie ciśnienia. Ponadto uzyskane ilości enzymów są niewielkie. Dlatego biologia molekularna okazała się niezawodna i do otrzymywania enzymów termostabilnych wykorzystuje system nadekspresji genów.

Zastosowanie enzymów termostabilnych:

• Amplifikacja DNA przez łańcuchową reakcją polimeryzacji

• W sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera

• W genomowym „footprintingu”

• W przemyśle papierniczym, chemicznym (środki czystości), przetwórczym (żywność)

• W wysokowydajnych systemach zużywania odpadów, oczyszczania i odsalania wód

Etapy otrzymywania:

Na takie enzymy czeka przemył papierniczy, chemiczny (środki czystości), przetwórczy (żywność). Wśród bakterii ekstremofilnych znajdą się zapewne takie, które mają enzymy zachowujące aktywność w niewodnych rozpuszczalnikach. Ekstremofile oraz ich enzymy znajdą też zastosowanie w wysoko wydajnych systemach zużywania odpadów, oczyszczania i odsalania wód.

12. wektory do tworzenia bibliotek

Charakteryzują się one:

• ogromnym potencjałem do stabilnego utrzymywania dużych fragmentów DNA (50-1000 kpz), w kolejnych pokoleniach klonu gospodarza (wysoka stabilność strukturalna i segregacyjna wektora),

• możliwością selekcji i identyfikacji rekombinantów

• względnie łatwą izolacją z organizmu gospodarza.

• Biblioteka genów w tych wektorach sporządzana jest losowo a efektywność jej tworzenia zależy od zoptymalizowania następujących procesów:

• częściowego trawienia DNA genomu enzymem restrykcyjnym,

• frakcjonowania DNA, w celu wyodrębnienia fragmentów w określonym zakresie wielkości,

• wprowadzaniu zrekombinowanych wektorów do określonych komórek gospodarza. Okazuje się, że ten ostatni etap stanowi najistotniejszy problem.

• Biblioteki fragmentów DNA genomów poszczególnych organizmów konstruowane są w oparciu o bardzo różne systemy do klonowania. Trudno jest wskazać jednoznacznie na jeden najlepszy system. Jedne z nich wykorzystywane są do wykonania wstępnej mapy fizycznej (ang. low resolution physical map) inne są konieczne do precyzyjnej analizy ułatwiając wykonanie mapy genetycznej (ang. high density physical map).

Wektory do sporządzania wstępnej May fizycznej:

• Sztuczny chromosom bakteryjny - BAC (bacterial artificial chromosome)

• Sztuczny chromosom oparty na replikonie bakteriofaga P1 - PAC (P1 derived artificial chromosome),

• Sztuczny chromosom drożdżowy - YAC (yeast artificial chromosome).

Wektory te zostały nazwane sztucznymi chromosomami z racji:

• porównywalnej z nimi liczbie kopii (1- 2) oraz

• stosunkowo dużej pojemności insercyjnej dla długich fragmentów DNA, maksymalnie 300 kpz dla BAC i PAC oraz 1400 kpz dla YAC.

• Podobnie jak w przypadku naturalnych chromosomów replikują się wiernie i są stabilnie przekazywane komórkom potomnym.

• Poszczególne rodzaje sztucznych chromosomów różnią się stopniem złożoności, co pozostaje w ścisłym związku z pochodzeniem elementów genetycznych je tworzących oraz rodzajem organizmu, w którym są utrzymywane.

• Tylko YAC może być uznany za strukturalny minichromosom. Jest liniową cząsteczką DNA, posiada autonomiczne origin replikacji, centromer i telomery.

• Podstawowymi elementami funkcjonalnymi w przypadku BAC są elementy kontroli oraz regulacji replikacji i segregacji pochodzące z episomu F E. coli.

• Dla PAC będą to ori plazmidowy i lityczny bakteriofaga P1 E. coli oraz system do pozytywnej selekcji rekombinantów.

• Niewątpliwą zaletą wektora YAC jest możliwość wprowadzania nawet bardzo długich insertów DNA (od 100 do 2000 kpz). Niestety często prowadzi to do powstawania chimer, insertów powstałych z połączenia z dwóch lub większej ilości fragmentów DNA, nie sąsiadujących ze sobą na genomie. Stwarza to poważne problemy interpretacyjne podczas analizy struktury genomu. Kolejną istotną słabością tego systemu jest trudność izolacji YAC spośród innych chromosomów drożdżowych oraz mało wydajna transformacja komórek drożdżowych zrekombinowanym wektorem.

Drugą grupę wektorów stanowią systemy klonowania heterologicznego DNA w komórkach E. coli, łączące w sobie cechy plazmidowego wektora i systemu do pakowania w główki bakteriofagów (obecność elementów cosN lub pac). Są to wektory do tworzenia map genetycznych:

• Wielkość klonowanego fragmentu DNA ograniczana jest pojemnością główki faga.

• Zrekombinowane DNA przenoszone jest do komórek metodą transdukcji, której towarzyszy recyrkularyzacja w komórce bakterii.

Do wektorów tej grupy należą:

• kosmidy, wysokokopijne plazmidy oparte na replikonie ColE1 lub pMB1, zawierające sekwencję cosN, rozpoznawaną w procesie pakowania DNA in vitro w główki bakteriofaga l;

• fosmidy, udoskonalone pochodne kosmidów, zachowujące ich cechy z wyjątkiem rodzaju replikonu, który w tym przypadku pochodzi z plazmidu F, co obniża ich liczbę kopii do 1-2,

• pacmidy, zawierające sekwencję pac, istotną podczas pakowania DNA w główki bakteriofaga P1, sekwencję loxP, istotną do po-transdukcyjnej Cre-zależnej cyrkularyzacji wektora, oraz dwa alternatywne replikony P1, plazmidowy (niskokopijny, 1-2 kopie), do stabilnego utrzymywania wektora i lityczny (wysokokopijny, 10-20 kopii), do amplifikacji wektora. System zaopatrzono ponadto w element pozytywnej kontroli rekombinantów, w postaci genu sacB. którego produkt powoduje efekt letalny bakterii rosnących na podłożu z 5% sacharozą.

Ogromną zaletą tych systemów jest bardzo wydajny sposób wprowadzania DNA do komórek bakteryjnych gospodarza, ale ich ograniczeniem jest maksymalna wielkość fragmentu DNA możliwa do upakowania w główce: 45 kpz dla faga l i 100 kpz dla P1. Z racji podwyższonej liczby kopii kosmidów, wektory te uważa się za niestabilne strukturalnie (35% rekombinacji), co zostało w dużej mierze już wyeliminowane w fosmidach.

14. Transformacja DNA

Transformacja - zjawisko i proces aktywnego pobierania DNA, zwykle plazmidowego DNA, przez organizmy jednokomórkowe, najczęściej bakterie i drożdże. Zdolność do transformacji nazywa się kompetencją. Naturalnie bakterie i drożdże mają stosunkowo niską kompetencję. W celach eksperymentalnych kompetencja może być podwyższona przez traktowanie organizmów roztworami soli.

Transformacja pełni u bakterii funkcję namiastki procesu płciowego, umożliwiając wymianę genów, często nawet między odległymi organizmami. Zjawisko transformacji ma ogromne znaczenie medyczne, gdyż geny warunkujące lekooporność są wymieniane na plazmidach, znacznie przyspieszając rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki.

Zjawisko transformacji ma rozległe zastosowanie w technikach biologii molekularnej. Jest używane do klonowania genów, powielania plazmidowego DNA, wymuszonej ekspresji obcych genów w organizmach jednokomórkowych, etc.

Zjawisko po raz pierwszy zaobserwował i opisał Fred Griffith (1928r.).

Komórki różnią się między sobą zdolnością do transformacji. Transformacja u wielu bakterii zachodzi samoistnie, co wpływa między innymi na rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki.

Istnieje kilka metod transformacji:
- wykorzystanie naturalnej kompetencji niektórych komórek bakteryjnych (np. Bacillus, Mycobacterium)
- indukcja kompetencji (zastosowanie chlorku wapnia)
- protoplastyzacja komórek
- elektroporacja
Indukcja kompetencji metodą chemiczną - bakterie traktowane są zimnym roztworem CaCl2, a następnie szybko ogrzane pobierają DNA plazmidowy z otoczenia.

• transformacji ulegają fragmenty wielkości 3x10⁵-10⁷daltona;

• wysoką aktywność transformującą wykazuje DNA natywny, dwuniciowy. Jednoniciowy lub denaturowany DNA jest mało aktywny w transformacji;

• najwyższą częstośc transformacji uzyskuje się w obrębie tego samego gatunku;

• w komórce biorcy jedna nić transformującego DNA ulega szybkiej degradacji, natomiast druga nić ulega rekombinacji przez podwójny crossing over do DNA biorcy;

W procesie transformacji można wyróżnić 4 główne etapy:
- sorpcja DNA na powierzchni komórki bakteryjnej
- transport zasorbowanej cząsteczki do wnętrza komórki
- włączenie DNA do genomu

- fenotypowe procesy zewnętrznego wyrażania nowej cechy

Transformacja bakterii: DNA wprowadza do komórki nową informację genetyczną

Wydajność procesu transformacji zależy od:
- szczepu bakterii
- fazy wzrostu komórki
- metody nadającej kompetentność bakteriom
- ilości i wielkości DNA użytego do transformacji
- czasu inkubacji DNA z komórkami kompetentnymi.

Za transformację odpowiedzialne są :

1. sygnałowe sekwencje pobierania (ang. uptake-signal sequences) na chromosomie w wielu kopiach np. u Haemophilus influenzae i Nesseria gonorrhoeae

2. obecność receptorów na powierzchni np. Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae komórki

Kompetencja jest to zdolność do wiązania i pobierania DNA

Kompetencja może być konstytutywna (np. Nesseria gonorrhoeae) lub indukowana:

• przez warunki wpływające hamująco na wzrost np. kompetencje wzmaga wysoki poziom cAMP

• warunki żywieniowe (np. Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae )

• gęstość populacji bakteryjnej tzw. Quorum sensing, czyli regulacja przez „wyczuwanie liczebności”

• u Streptococcus pneumoniae kompetencja jest także związana z procesem transbłonowego transportu wapnia

Wysoka wydajność naturalnej transformacji występuje tylko u kilku bakterii: Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Nesseria, Thermus

• Wiele prokariotów jest słabo transformowalna bądź wcale w naturalnych warunkach

• Kompetencja indukowalna laboratoryjnie

• Elektroporacja w polu elektrycznym - ok. 16kV/cm przez ułamek sekundy - transformacja E.coli przez plazmidowy DNA

15.Metylacja i przykłady

System restrykcji-modyfkacji występuje u wielu gatunków bakterii i stanowi mechanizm obronny skierowany przeciwko wprowadzeniu obcego DNA do komórki.

Składa się on z dwóch elementów: pierwszym jest endonukleaza restrykcyjna, która rozpoznaje krótką, symetryczną sekwencję DNA i „przecina” (hydrolizuje) szkielet każdej z nici DNA w specyficznym miejscu w obrębie tej sekwencji. Obcy DNA jest zatem degradowany do relatywnie krótkich fragmentów.

Drugim elementem systemu jest metylaza, która dodaj grupę metylową do zasady C lub A w obrębie tej samej sekwencji komórkowego DNA. Ta modyfikacja sprawia to, że DNA gospodarza staje się odporny na degradację przez endonukleazy.

EcoRI metylaza

Najczęściej stosowanym DNA do cięcia enzymami restrykcyjnymi jest DNA izolowane z komórek E. coli. Większość szczepów E. coli posiada dwie miejscowo specyficzne metylazy DNA. Metylaza kodowana przez gen dam (metylaza Dam) przenosi grupę metylową z S-adenozynometioniny na pozycję N⁶ reszty adeniny w sekwencji GATC.

Druga metylaza jest kodowana przez gen dcm (metylaza Dcm), która metyluje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCAGG i CCTGG. Metyzacja metylazą Dam lub Dcm powoduje hamowanie cięcia DNA przez pewne endonukleazy restrykcyjne, których sekwencja rozpoznania jest identyczna z rozpoznawaną przez metylazę Dam lub Dcm. Ponadto, cięcie DNA przez niektóre endonukleazy restrykcyjne jest hamowane, gdy ich miejsce rozpoznawania DNA pokrywa się tylko częściowo z sekwencjami rozpoznawanymi przez metylazę Dam lub Dcm.

Metylacja u Eukaryota:

U organizmów Eukariotycznych ważną role odgrywa metylacja chromatyny w rejonach aktywnych transkrypcyjnie. Jednym z czynników regulujących ekspresję genów jest metylacja ctozyny w pozycji 5`. Zachodzi ona prawie wyłącznie w sekwencjach zawierających dinukleotyd -CpG-.

Odcinki DNA, które są bardziej zmetylowane wykazują mniejszą aktywność transkrypcyjną niż rejony o mniejszym stopniu metylacji. Zmiany w stopniu wykazywanej aktywności spowodowanej metylacją wynikają z tego, że zmienia się powinowactwo DNA do czynników transkrypcyjnych, ułożenie nukleosomów w danym rejonie oraz oddziaływanie histonu H1 z DNA.

Dzięki temu, że dodanie reszty metylowej ma taki wpływ na DNA może zachodzić zjawisko nazywane "impritingiem genomowym" - do normalnego rozwoju zarodka ssaka konieczna jest obecność zarówno genomu żeńskiego jak i męskiego, które są naznaczone w charakterystyczny sposób właśnie poprzez metylację, czyli inaktywację odcinków DNA. Nie wiadomo jednak, czy metylacja stanowi pierwotną przyczynę, czy jest tylko zjawiskiem towarzyszącym imprintingowi.

Metylacja ma również duże znaczenie w żeńskich komórkach somatycznych, w których jeden z chromosomów X jest w dużo większym stopniu zmetylowany przez co staje się nieaktywny transkrypcyjnie.

Komórki somatyczne podczas podziału przekazują wzór metylacji komórkom potomnym. Ma to bardzo duże znaczenie ponieważ komórki te mają ściśle określoną funkcję a do spełniania jej wykorzystują tylko część informacji zawartej w DNA. Metylowane odcinki pozostają nieaktywne.

Metylacja u Prokaryota.

W organizmach Prokaryotycznych metylacja spełnia nieco inną funkcję niż u Eukaryota. Podczas inicjacji replikacji metylacja umożliwia odróżnienie DNA zreplikowanego od niezreplikowanego. Inicjacja jest bezpośrednio sterowana metylacją w obrębie sekwencji oriC . Metylaza Dam dołącza resztę metylową do adeniny w pozycji N-6 w sekwencji:

*

-GATC-

-CTAG-

*

W obszarze oriC jest aż 11 takich sekwencji. Przed replikacją sekwancje w obu niciach są zmetylowane. Podczas replikacji do nici potomnych włączane są niezmetylowane zasady, Powoduje to, że wszystkie zasady w jednej nici są zmetylowane a w drugiej nie. Inicjacja replikacji zostaje zahamowana do czasu wstawienia brakujących grup metylowych do DNA.

Jednocześnie możliwość rozróżnienia nici nowo zsyntetyzowanej od nici macierzystej bezpośrednio po syntezie pozwala na poreplikacyjną naprawę przez wycinanie niewłaściwie sparowanych nukleotydów. Kompleks enzymów reperacyjnych rozpoznaje nie zmetylowany jeszcze łańcuch DNA i nacina go w dwóch miejscach: z jednej strony w obrębie zmetylowanej sekwencji GATC ( lub CATG ), a z drugiej w sąsiedztwie niewłaściwie włączonej zasady. Następnie dochodzi do rozwinięcia i usunięcia odcinka DNA przez enzym helikazę II a powstała luka zostaje wypełniona zgodnie z zasadą komplementarności przez enzym polimerazę.

Metylacja odgrywa również bardzo ważną rolę w bakteriach i sinicach. Organizmy te syntetyzują restryktazy. Enzymy te należą do grupy endonukleaz. Największe znaczenie mają enzymy restrykcyjne klasy II, które rozpoznają sekwencję składającą się z 4-8 nukleotydów a następnie tną cząsteczkę DNA w obrębie tej sekwencji lub w ściśle określonej odległości od niej.

Restryktazy umożliwiają obronę przed atakiem wirusów. Jednocześnie istnieje potencjalne ryzyko niszczenia własnego DNA. Organizmy poradziły sobie z tym problemem dzięki metylacji. Dany szczep bakterii wytwarza oprócz restryktazy metylazę rozpoznającą tą samą sekwencję DNA i zmienia ją w taki sposób, aby nie była przecinana. Obcy niezmodyfikowany DNA ulega trawieniu podczas, gdy własny pozostaje niezdegradowany.

Prawie wszystkie szczepy E. coli posiadają dwa rodzaje miejscowo specyficznych DNA metylaz, które umożliwiają ochronę fragmentów rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne:

• Dam metylaza - dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC, powstającą sekwencję oznacza się jako GmATC.

• Dcm metylaza - dodaje grupę metylową do wewnętrznej cytozyny w sekwencji CC(A/T)GG, powstaje sekwencja CmC(A/T)GG.

Kilka przykładów ilustrujących rolę Dam metylazy.

• Dwa enzymy restrykcyjne MboI oraz Sau3AI są izoschizomerami rozpoznającymi i tnącymi sekwencję GATC, która jest również rozpoznawana przez Dam metylazę. Trawienie Gm ATC przez MboI jest zahamowane, jednocześnie trawienie przez Sau3AI zachodzi.

• Miejsce rozpoznawane przez ClaI - ATCGAT nie jest substratem dla Dam metylazy. Mimo to jeśli guanina (G ) poprzedza tą sekwencję lub występuje po niej powstaje miejsce rozpoznawane przez Dam metylazę i trawienie przez ClaI jest inhibowane. Są to sekwencje "random" przekazywane w wielu szczepach E.coli i powodują, że prawie połowa miejsc rozpoznawanych przez restryktazę ClaI nie jest cięta.

16. rybotypowanie

Rybotypowanie jest metodą opartą na reakcji PCR, w którym czynnikiem różnicującym mikroorganizmy są geny kodujące rybosomalny RNA (rRNA).

Rybosom prokariotyczny składa się z trzech rodzajów rRNA i 52 różnych białek rybosomalnych. Geny kodujące rRNA ułożone są w operon rybosomalny rrn i odpowiadają za syntezę 16S, 23S i 5S rRNA, a także tRNA, biorącego udział w syntezie białek:

Ze względu na funkcje jakie pełnia rybosomy, a także ich złożoność struktury, geny kodujące rRNA znajdują się we wszystkich organizmach bakteryjnych i są one wysoce zakonserwowane ewolucyjnie. Ich wysoka konserwatywność przejawia się w sekwencji nukleotydowej, a także w strukturze pierwszo i drugorzędowej powstających produktów. Geny kodujące poszczególne rodzaje rRNA rozdzielone są regionami polimorficznymi, które charakteryzują się dużym zróżnicowaniem pod względem wielkości i sekwencji. Te cechy genów rDNA czynią z nich dobry zegar molekularny do ustalania pokrewieństwa filogenetycznego, nawet odległych od siebie organizmów. Przy doborze molekularnego systemu do odtwarzania drzew filogenetycznych wybiera się geny powszechnie występujące w przyrodzie i z wysokim stopniem konserwacji w trakcie ewolucji. Geny takie najczęściej są niezbędne dla przebiegu podstawowych procesów metabolizmu komórkowego, powinny posiadać przynajmniej dwa regiony zakonserwowane, które umożliwią zaprojektowanie starterów do reakcji PCR. Użytecznym modelem klasyfikacji bakterii wewnątrz gatunku okazały się geny kodujące cząsteczki niezbędne dla metabolizmu komórkowego:

• Gen kodujący 16S rRNA

• Geny kodujące pewne białka komórkowe: recA, gyrB, rpoB, ropD.

Różnicowanie bakterii z zastosowaniem metod rybotypowania można przeprowadzić używają różnych technik:

• Hybrydyzacyjna - rrn RLFP - analiza długości fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA hybrydyzowanych z sondą molekularną komplementarną do odpowiedniego rrn locci. Sondy mogą być niesymetryczne - jednoniciowe fragmenty DNA; a także sondy molekularne tj. sklonowane geny 16S i 23S rRNA lub oligonukleotydowe sondy.

Kierując sondą DNA na rRNA można uzyskać dowolny poziom swoistości, taka swoistość może dotyczyć gatunku, rodzaju, rodziny czy królestwa.

• Metody wykorzystujące technikę PCR:

• ITS PCR - analiza produktów amplifikacji regionów zmiennych zlokalizowanych między genami rrs i rrl.

• ARDRA - analiza restrykcyjna amplifikowanego DNA rybosomalnego.

• Amplifikacja regionu zawierającego gen kodujący 16S rRNA i sekwencjonowanie otrzymanych produktów.

Różne regiony operonu rrn mogą być celem molekularnym dla reakcji PCR:

• polimorficzny region między genami rrs i rrl;

• zmienny region wewnątrz genu kodującego 16S rRNA;

• region zawierający geny rrs i rrl oraz fragment polimorficzny zawarty między nimi;

• region kodujący tRNA;

• analiza sekwencyjna genu kodującego 16S rRNA.

Zalety rybotypowania:

• rRNA jest podstawowym składnikiem rybosomów bakteryjnych i występuje w dużej liczbie kopii, co ułatwia opracowanie czułych testów detekcji;

• sekwencje nukleotydowe 16S rRNA można szybko oznaczyć bez wcześniejszego klonowania;

• sekwencja rRNA jest charakterystyczna dla prawie każdego organizmu i na tej podstawie można określić pokrewieństwo filogenetyczne i identyfikować organizmy.

17. klonowanie do pUC

Identyfikacja kolonii bakteryjnych zawierających plazmidy rekombinowane w przypadku klonowania fragmentów DNA do wektorów z serii pUC opiera się ona na porównaniu barwy otrzymanych kolonii. Kolonie rekombinowane są koloru białego. Kolonie nierekombinowane są niebieskie. Plazmidy z serii pUC posiadają N-końcową resztę genu B-galaktozydazy (LacZ). Miejsce rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych znajduje się w obrębie tego genu. Wklonowanie inseratu powoduje przerwanie ciągłości genu, przez go zawarty w podłożu substrat (X-gal) nie jest hydrolizowany - zmiana ramki odczytu. Dodatkowo plazmidy z serii pUC posiadają gen oporności na ampicylinę (amp), który jest dodatkowym markerem selekcyjnym. Wyrosną tylko te kolonie, które posiadają plazmid, ponieważ wyjściowe szczepy, przed transformacją, nie posiadały oporności na ten antybiotyk. Wyrosną tylko kolonie zawierające plazmid pUC. W przeciwieństwie do identyfikacji kolonii bakteryjnych zawierających wektory z serii pBR 322, ta identyfikacja jest jednoetapowa.

18. elementy wrazliwe na PCR

Czynniki wpływające na efektywność PCR

Wiele różnych czynników może wpływać na efektywność amplifikacji DNA metodą PCR. Oczywiste jest że w zoptymalizowanym systemie niewielka zmiana jednego lub kilku z nich (czynników) może mieć wpływ na efektywność procesu.

Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji PCR są:

• stężenie jonów Mg²⁺,

• dNTP,

• aktywność polimerazy,

• zmiana profilu temperaturowego cyklu

• zmiany temperatury dołączania primerów.

W związku z tym że jony Mg²⁺ są kofaktorami polimerazy ich stężenie w roztworze reakcyjnym powinno być odpowiednie, gdyż ich mała/duża ilości może wpływać hamująca/nadaktywująco (i otrzymamy niespecyficzne produkty) na enzym. Stężenie jonów magnezu jest uzależnione także od stężenia nukleotydów, dlatego też podwyższając stężenie dNTP należy zwiększyć ilość jonów Mg²⁺ (chelatują one dNTP i w następstwie spada aktywność polimerazy). Przy bardzo dużych stężeniach nukleotydów i jonów Mg²⁺ może dojść np. do stłoczenia składników w mieszaninie i zahamowania reakcji PCR. Jeżeli próbka DNA zawiera EDTA, zawartość jonów Mg²⁺ powinna proporcjonalnie wzrosnąć. Ciężko jednak jednoznacznie określić optymalne stężenie Mg²⁺, gdyż np. w przypadku polimerazy Taq już 10 mM MgCl₂ hamuje jej aktywność w 40-50%. Zakres stosowanych stężen Mg²⁺:1-10mM (ostatecznie w próbce).

Jeśli chodzi o stężenie nukleotydów, to ich ilość powinna być równa, bo może dojść do redukcji produktów PCR.

Polimeraza, która jest używana w reakcji powinna charakteryzować się dobrą procesywnościa, wiernością podczas syntezy nowej nici, mała ilością popełnianych błędów a jeśli już takowe są- aktywnością naprawczą , wytrzymywaniem warunków reakcji- termostabilnością, wysoką specyficznością r-cji PCR: zredukowanie do minimum tworzenie dimerów przez primery.

Temperatura przyłączenia starterów waha się w granicach 37-65^OC i zależy od długości startera. Im dłuższe startery tym większa temperatura topnienia. Wraz z obniżeniem temperatury przyłączania starterów maleje specyficzność reakcji- możliwość powstawania produktów niespecyficznych, dimeryzacja primerów itp. Dobór odpowiedniej temperatury przyłączania powinien być wyznaczony dla danej sekwencji i długości. Punktem wyjścia jest temperatura dysocjacji dupleksu: starter - matryca, oznaczona jako temperatura topnienia (Tm). Najlepsze rezultaty wykazują startery, których Tm jest równe lub wyższe niż 54^oC. Starter krótszy niż 25 nukleotydów - Tm oblicza się ze wzoru: Tm= 4(G + C) + 2( A + T)

Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCR

Nawet w przypadku zoptymalizowania parametrów reakcji PCR, wyniki mogą być niesatysfakcjonujące i wtedy należy rozważyć wpływ innych czynników mogących obniżać efektywność.

Do nich należą między innymi:

• natura natywnego materiału matrycy,

• stosowana metoda do izolacji matrycowego DNA,

• związki chemiczne użyte do izolacji DNA i w śladowych ilościach wprowadzone do próbki reakcyjnej PCR.

Efektywność reakcji zależy także od wielu innych składników. W związku z faktem wykorzystywania reakcji w diagnostyce, należy pamiętać, że badany materiał zawiera szereg komponentów (inhibitorów), które w negatywny sposób wpływają na przeprowadzenie PCR-a i można zaliczyć do nich np. heparynę, związki porfirynowe pochodzące z hemu itp.

Dodanie dodatkowych składników do mieszaniny reakcyjnej PCR może wpływać na:

• temperaturę topnienia primerów,

• termiczny profil aktywności polimerazy Taq,

• stopień denaturacji,

• ułatwienie dołączania primerów (hamowanie tworzenia struktur drugorzędo-wych primerów).

Specyficzna reakcja PCR pozostaje unikalną, dlatego działanie dodatkowych składników mieszaniny reakcyjnej PCR jest nierównocenne. Jedne ze składników wzmacniają próby reakcyjne inne wprost przeciwnie- hamują. Do wzmacniaczy zaliczamy np: DMSO, formamid, glicerol, PEG, Tween 20 itp. Składniki dodatkowe dodane racjonalnie do mieszaniny reakcyjnej mogą znacznie polepszyć efektywność, czułość i specyficzność reakcji PCR, wpływając na różne jej parametry.
19. dlaczego się oczyszcza produkt PCR?

Produkt reakcji PCR należy oczyścić, przed wykorzystaniem go na przykład jako insertu do klonowania. Dzięki temu pozbywamy się z próbki enzymu - polimerazy, a także innych pozostałości mieszaniny reakcyjnej, jak trójfosforany nukleotydów czy jony magnezu. Ponadto po oczyszczeniu produktu zawieszamy go w odpowiednim buforze jakim jest TE. Nieoczyszczone DNA mogłoby spowodować obniżenie wydajności kolejnych reakcji przeprowadzanych z udziałem produktu reakcji PCR, także obecność enzymu jakim jest polimeraza mogłaby zakłócać kolejne etapy przeprowadzanej procedury. Oczyszczania DNA dokonuje się przy pomocy gotowych zestawów laboratoryjnych specjalnie do tego celu opracowanych.

Ponadto, jeżeli produkt PCR jest rozdzielany na żelu agarozowym to należy również go oczyścić z żelu. Najczęściej dokonuje się tego przy użyciu gotowego zestawu Gel-Out.

Bakteria termostabilna

Liza komórek

PCR

Trawienie enzymami restrykcyjnymi

nymi

Ligacja

Transformacja

Liza komórek

Ogrzewanie, wirowanie

Czysty enzym

---