MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA W OCHRONIE ŚRODOWISKA
Ćwiczenie 3
Temat:
Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych - kolorymetryczne oznaczanie stężenia katecholu oraz fenolu w założonych hodowlach (cz. 3).
Zagadnienia teoretyczne:
materiał obowiązujący na ćwiczeniu numer 2,
komórka prokariotyczna i jej elementy składowe,
rodzaje adaptacji mikroorganizmów (genetyczna, socjologiczna, fizjologiczna),
definicja biodegradacji i bioaugmentacji,
Część praktyczna:
Materiały:
probówki
pipety 100µl, 200 μl, 500 μl, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml
spektrofotometr
para-nitroanilina
2% roztwór NaNO2
10% Na2CO3
10% NaOH
woda destylowana
10% molibdenian sodu
0,5 M HCl
Procedura:
Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fenolu i katecholu:
do probówek odmierzyć odpowiednie objętości poszczególnych roztworów, zgodnie z tabelkami zamieszczonymi na kartach pomiarowych,
zmierzyć ekstynkcję przy odpowiedniej długości fali ( dla fenolu λ = 550 nm, dla katecholu
λ = 480 nm),
zrobić wykres krzywej kalibracyjnej. Stężenie fenolu oraz katecholu obliczać z otrzymanego równania krzywej.
A. Oznaczanie stężenia fenolu w założonych hodowlach:
do oznaczanie stężenia fenolu wykorzystano metodę polegającą na barwnej reakcji jednowodorotlenowych fenoli z dwuazowaną para-nitroaniliną w środowisku alkalicznym.
do probówki pobrać 1 ml supernatantu i dodać 4 ml wody destylowanej (możliwe, że będzie wymagane przygotowanie rozcieńczenia 0,1 ml supernatantu i 4,9 ml wody destylowanej).
do tak przygotowanej próbki dodać 1 ml zdwuazowanej para-nitroaniliny. Dwuazowanie polega na wprowadzeniu do odpowiedniej objętości para-nitroaniliny kroplami 2% NaNO2 aż do odbarwienia roztworu.
kolejno dodać 0,5 ml 10% Na2CO3 i 1 ml 10% NaOH.
tak przygotowaną mieszaninę uzupełnić do 10 ml wodą destylowaną.
w spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej, w której supernatant zastąpić wodą destylowaną.
stężenie fenolu odczytać na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.
B. Oznaczenie stężenia katecholu w założonych hodowlach:
do probówki pobrać 1 ml supernatantu (możliwe, że będzie wymagane przygotowanie rozcieńczenia 0,1 ml supernatantu i 0,9 ml wody destylowanej).
dodać kolejno 1 ml 10% Na2MoO4 · 2H2O, 0,5 ml 0,5 M HCl, 0,5 ml NaNO2 oraz 1 ml 10% NaOH.
w spektrofotometrze zmierzyć absorbancję przy długości fali 480 nm wobec próby ślepej, w której supernatant zastąpić wodą destylowaną. Stężenie katecholu odczytać na podstawie przygotowanej krzywej wzorcowej.
LITERATURA ŹRÓDŁOWA:
KUNICKI-GOLDFINGER W.: „Życie bakterii” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005
CHMIEL A.: „Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1998
RÓŻALSKI A.: „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej” - Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996
SCHLEGEL G. H.: „Mikrobiologia ogólna” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003
Źródła internetowe
MIKSCH K.: „Laboratorium podstaw biochemii technicznej” - Dział Wydaw. Politechniki Śląskiej, Gliwice 1978