Sprawozdanie z ćwiczeń 6 - 7

Enzymy bakteryjne o znaczeniu przemysłowym.

Ćwiczenie 6:	Izolacja szczepów Bacillus z gleby.
Ćwiczenie 7:	Sprawdzenie cech użytkowych wyizolowanych szczepów z rodzaju Bacillus.

Przygotowali:

Agata Chodak

Justyna Cyba

Aleksandra Dawczyńska

Robert Gajowski

Grupa: chemia 1

1.Wstęp teoretyczny:

Zdolność do tworzenia endospor jest, poza nielicznymi wyjątkami, cechą występującą jedynie w grupie gramdodatnich laseczek. Tlenowe i względnie tlenowe formy należą do rodzaju Bacillus, Sporolactobacillus i Sporosacina, a beztlenowe do rodzajów Clostridium i Desulfotomaculum.
Bakterie te są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie: w glebie i wodzie, na częściach roślin, w psującej się żywności, treści żołądkowej zwierząt przeżuwających, w mule, osadach wód powierzchniowych, gorących źródłach. Poza tworzeniem przetrwalników ich wspólną cechą jest dodatnie wybarwianie się metodą Grama. Większość gatunków ma komórki ruchliwe dzięki obecności rzęsek. Zachodzące podczas rozwoju wegetatywnego zmiany środowiska, wyczerpanie łatwo przyswajalnego źródła węgla i energii, związków azotowych lub fosforanu, są sygnałem do zainicjowania procesu różnicowania komórkowego, prowadzącego do wytworzenia przetrwalników.

Skrobia jest głównym materiałem zapasowym roślin. Zwykle występuje w postaci kulistych, soczewkowatych lub jajowatych granul o wyraźnie warstwowej budowie. Skrobia roślinna składa się z glukanów: amylozy oraz amylopektyny. Amyloza jest rozpuszczalna bez pęcznienia w gorącej wodzie i jest odpowiedzialna za typowe niebieskie zabarwienie w reakcji z jodyną. Zbudowana jest z helikalnie ułożonych nierozgałęzionych łańcuchów reszt D-glukozy połączonych1,4-α-glikozydowo. Amylopektyna pęcznieje w wodzie, a przy podgrzewaniu tworzy klej skrobiowy. W reakcji z jodyną daje zabarwienie od purpurowego do brązowego. Podobnie, jak amyloza składa się z reszt α-D-glukozy, ale tworzy rozgałęzione formy poprzez wiązania α-1,6-glikozydowe. Oprócz tego zawiera reszty fosforanowe, jak również jony wapnia i magnezu.

Skrobię można przeprowadzić do glukozy na drodze kwaśnej hydrolizy lub enzymatycznie.

Bakterie z rodzaju Bacillus są zdolne do produkcji enzymów odpowiedzialnych za rozkład wielu substancji organicznych. Do tych enzymów zaliczamy: proteazy (rozkład białek), amylazy (rozkład wielocukrów) i lipazy (rozkład tłuszczy). Enzymy te wykorzystywane są w przemyśle głównie spożywczym, ale również w innych gałęziach przemysłu, tj. garbarstwo, lakiernictwo.

2.Materiały i metody:

W warunkach sterylnych 10 ml gleby dodano do kolby zawierającej 90 ml soli fizjologicznej. Próbkę przez czas 10 minut intensywnie wytrząsano, w celu otrzymania roztworu o rozcieńczeniu 10^-1. Następnie próbkę pozostawiono na 10 minut w celu sedymentacji cząsteczek glebowych, po czym wykonano kolejne rozcieńczenia (10^-2 ÷ 10^-4). Dalej przygotowane rozcieńczenia umieszczono w gorącej łaźni wodnej (temp. ok. 80°C) na 10 minut. Po tym czasie w próbce powinny pozostać jedynie formy przetrwane bakterii.

Po ostygnięciu próbek wykonano posiew metodą płytek mazanych na szalki Petriego z zestalonym bulionem agarowym. Płytki inkubowano przez okres 5 dni.

Niestety nie stwierdzono żadnych kolonii, więc przesiewy redukcyjne wykonano z kolonii znajdujących się na płytkach innych sekcji. W tym celu materiał przeniesiono ezą na płytki zawierające podłoża: żelatynowe, tłuszczowe oraz do 1% wody peptonowej.

Po kolejnych 4 dniach inkubacji przystąpiono do określania zdolności wytwarzania enzymów przez szczepy bakterii z rodzaju Bacillus.

W celu określenia zdolności do produkcji enzymów amylolitycznych wykonano następujący test: na 3 szkiełkach podstawowych wykonano niżej opisane próby i do każdej z nich dodano po kropli płynu Lugola. Po 30 minutach określono kolor, jaki przybrały poszczególne próbki.

Lp.	Skład próbki:	Barwa
1.	Roztwór skrobi + zawiesina bakteryjna + płyn Lugola	Niebieska
2.	Woda destylowana + zawiesina bakteryjna + płyn Lugola	Żółta
3.	Roztwór skrobi + woda destylowana + płyn Lugola	Niebieska

Aby zbadać, czy wyizolowane szczepy posiadają zdolność produkcji enzymów lipolitycznych pojedyncze kolonie wyrosłe na podłożu tłuszczowym zalano 20% roztworem siarczanu miedzi(II). Nie zaobserwowano zmiany barwy na zieloną.

Powierzchnię płytki z podłożem żelatynowym zalano odczynnikiem Fraziera, zamknięto ją i odczekano następnie 5 minut. Po tym czasie delikatnie odpipetowano roztwór, po czym stwierdzono przejaśnienia wokół kolonii bakteryjnych, co świadczy o właściwościach proteolitycznych szczepu.

W probówce zawierającej 1% wodę peptonową zaobserwowano zmętnienie podłoża, spowodowanym przez wzrost bakterii, co świadczy o produkcji enzymów proteolitycznych przez wyizolowany szczep. Po dodaniu do probówki kilku kropel odczynnika Nesslera zaobserwowano zmianę zabarwienia roztworu na kolor żółty. Było to spowodowane obecnością jonów amonowych, co wskazuje na aktywność amonifikacyjną bakterii.

3.Wyniki:

Bakterie z rodzaju Bacillus stworzyły na agarze kolonie podobne do kolonii grzyba.

Na podstawie obserwacji mikroskopowych wyizolowany szczep został zaklasyfikowany do grupy Bacillus sp.

Bakterie wybarwione metodą grama zakwalifikowaliśmy do Gram(+).

4. Wnioski:

Brak wyrosłych bakterii z rodzaju Bacillus na podłożu bulion-agar mógł być spowodowany użyciem do tego celu starej, mocno przesuszonej ziemi. Ponadto wpływ na to mogła mieć również wadliwa łaźnia wodna (uszkodzony termostat), w której woda mogła mieć o wiele wyższą temperaturę niż oczekiwano.

Niebieska barwa 1. próbki (roztwór skrobi + zawiesina bakteryjna + płyn Lugola) jest  spowodowana dalszą obecnością skrobi w roztworze. Świadczy to o tym, że badane bakterie nie posiadają zdolności do produkcji enzymów amylolitycznych. Może to być spowodowane zbyt długim czasem inkubacji próbki.

Po dodaniu do kolonii bakteryjnych wyrosłych na podłożu tłuszczowym roztworu siarczanu miedzi(II)  nie nastąpiła zmiana jego barwy. Jest to wynikiem nierozłożenia tłuszczów zawartych w podłożu, a w konsekwencji brakiem możliwości reakcji jonów miedzi Cu²⁺ z glicerolem. Brak rozkładu tłuszczy może być spowodowany brakiem zdolności bakterii do syntezy enzymów lipolitycznych. Drugą bardziej prawdopodobną możliwością jest korzystanie przez bakterie z agaru odżywczego, który również znajdował się w podłożu. W obecności łatwiej dostępnego źródła węgla, bakterie nie musiały hydrolizować tłuszczy.

Żelatyna poprzez żelatynazę jest rozkładana do peptydów. W celu sprawdzenia czy wyizolowane przez nas bakterie posiadają zdolność produkcji żelatynazy posłużono się hodowlą bakterii na płytce agarowej z dodatkiem żelatyny. Po inkubacji płytke zalano odczynnikiem Fraziera. Przejaśnienia powstałe na płytkach z podłożem żelatynowym świadczą o zdolności bakterii do rozkładu białek gdyż upłynnione białko nie uległo wytrąceniu pod wpływem odczynnika.

Zmętnienie podłoża w probówce zawierającej 1% wodę peptonową o wzroście mikroorganizmów. Wzrost bakterii jest dowodem zdolności mikroorganizmów do produkcji enzymów proteolitycznych, ponieważ jedynym źródłem węgla i energii w podłożu były białka.

Zmiana barwy na kolor żółty po dodaniu odczynnika Nesslera jest wynikiem obecności jonów amonowych powstałych w wyniku amonifikacji białek zawartych w podłożu, co również świadczy o zdolności bakterii do syntezy enzymów proteolitycznych.

5. Literatura:

• Chmiel „Biotechnologia”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998

• Różalski „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej”, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź 2003

• Schlegel G.H.: „Mikrobiologia ogólna”, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

• Źródła internetowe

---