ĆWICZENIE II

Temat: Działanie czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje.

Do czynników fizycznych mających wpływ na drobnoustroje zaliczyć można:

• temperaturę

• ciśnienie osmotyczne i hydrostatyczne

• potencjał oksydacyjno- redukcyjny

• napięcie powierzchniowe

• pH

• promieniowanie

Natomiast do czynników chemicznych zaliczamy:

• konserwanty 

• barwniki

• środki dezynfekcyjne np. fenole, alkohole, związki chloru itp.

• antybiotyki.

Drobnoustroje wykazują stosunkowo duży zakres tolerancji na zmiany warunków środowiska które mogą powodować zahamowanie wzrostu komórek, uszkodzenia lub prowadzą do śmierci drobnoustroju (działanie bakterio - grzybostatyczne lub bakterio - grzybobójcze).

Określenie wpływu działania czynników fizycznych i chemicznych na procesy życiowe mikroorganizmów pozwala z jednej strony opracować, optymalne metody hodowli, z drugiej zaś określić przydatność różnych związków chemicznych i czynników fizycznych w procesach sterylizacji. 

1. Wpływ temperatury na rozwój bakterii (Bacillus subtilis, Escherichia coli) - założenie doświadczenia.

Obok wody i ciśnienia osmotycznego, temperatura jest jednym z podstawowych czynników środowiska wpływających na rozwój drobnoustrojów.

Mikroorganizmy mogą wykazywać aktywność życiową tylko w pewnych granicach temperatur, różnych dla poszczególnych gatunków. 

Poniżej temperatury minimalnej mikroorganizmy nie rozwijają się, lecz na ogół nie giną. Natomiast powyżej temperatury maksymalnej nie tylko ustaje ich rozwój, ale nawet niekiedy nieznaczne jej przekroczenie może spowodować śmierć mikroorganizmów. Jest to tak zwana temperatura krytyczna, po przekroczeniu której następuje cieplna denaturacja białka drobnoustrojowego. Najodpowiedniejszą dla rozwoju mikroorganizmów jest temperatura optymalna.

Na podstawie punktów kardynalnych wyróżniamy: 

• Zimnolubne - psychrofilne lub kriofilme (bakterie morskie - fotosyntetyzujące i bakterie żelazowe np. Gallionella)

- optymalna temperatura do wzrostu < 20°C

- minimalna ok. temperatury zamarzania

- maksymalna 25 - 30°C

• Mezofilne - liczne patogeny, bardzo powszechne saprofity (E. coli, Salmonella typhi, Brucella bovis, Shigella sp.).

- optymalna temperatura do wzrostu 20 - 40°C

- minim. 10 - 25°C

- maks. 40 - 45°C

• Termofile - ciepłolubne, występują w glebie, rozkładających się resztkach roślinnych, gorących źródłach (B. stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris).

- optymalna temperatura do wzrostu 45 - 60°C

- min. 25 - 45°C

- maks. 70 - 80°C

• Można wyróżnić również termofile ekstremalne  - optimum wzrostu w temperaturze ok. 65- 80 ^oC i hipertermofile rosnące między 80 - 100 ^oC (Pyrodictium occultum - ścisły beztlenowiec redukujący siarkę - może rosnąć przy temperaturze - 105 ^oC )

Temperatura może działać na drobnoustroje:

- bakteriostatycznie (hamuje rozwój komórek).

- bakteriobójczo (zabija komórki).

Część praktyczna

Należy wysiać po jednym oczku ezy zawiesiny bakterii do probówek z bulionem:

a). 2 probówki zaszczepione Escherichia coli 

b). 2 probówki zaszczepione Bacillus subtilis

Po jednej probówce z bulionem zaszczepionym E. coli i B. subtilis należy wstawić do łaźni wodnej o temp. 85^oC na 10 minut. Po tym czasie należy probówki schłodzić w strumieniu zimnej wody. Hodowle spasteryzowane i kontrolne E. coli i B. subtilis należy wstawić do cieplarki na 24 h o temp. odpowiednio: 37^oC i 28^oC. 

2. Wpływ promieniowania UV na bakterie (E. coli) - demonstracja.

Promienie ultrafioletowe mają właściwości bakteriobójcze. Siła zabójczego działania energii promienistej ultrafioletu zależy od długości fali. Najsilniej działają promienie UV o długości fali ok. 250 nanometrów. Uszkadzają one struktury nukleinowe drobnoustrojów.

Część praktyczna

O zabójczym działaniu promieni UV na bakterie można się łatwo przekonać. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy a następnie wysiano szczep E. coli. Płytkę otworzono i poddano promieniom UV, część płytki przykryto.

Należy obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli na agarze odżywczym po naświetleniu promieniami UV.

3. Wpływ ciśnienia osmotycznego (glukoza i NaCl) na drobnoustroje (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) - demonstracja.

Wprowadzenie do środowiska płynnego, w którym znajdują się drobnoustroje, odpowiednich ilości np. cukru lub soli kuchennej powoduje znaczne podniesienie ciśnienia osmotycznego.

Pomimo obecności wody, drobnoustroje nie są w stanie z niej korzystać, gdyż ciśnienie osmotyczne w komórce jest w tym przypadku niższe od ciśnienia zewnętrznego.

Wytrzymałość na ciśnienie osmotyczne poszczególnych drobnoustrojów jest różna. Są, takie które  giną nawet po nieznacznym podwyższeniu ciśnienia osmotycznego środowiska. Inne, szczególnie odporne pod tym względem, mogą rozwijać się w roztworach wodnych o bardzo dużym stężeniu soli kuchennej lub cukru. Są to tzw. osmofile. Bakterie ciśnieniolubne, które mają duże zapotrzebowanie na NaCl oraz są wytrzymałe na duże stężenia soli kuchennej, nazywa się halofilami. 

Wytrzymałość na ciśnienie osmotyczne niektórych mikroorganizmów często zależy od odczynu środowiska, w którym przebywają. Na przykład niektóre drożdże mogą rozwijać się w środowisku o pH = 2,5 w 14% stężeniach soli. Te same drożdże mogą się rozwijać dobrze w wyższych stężeniach soli kuchennej, nawet przy 20%, jeśli tylko pH środowiska wzrośnie i będzie wynosiło około 7.

4. Wpływ stężenia jonów wodorowych (pH 4, 7, 10) na drobnoustroje (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) - demonstracja.

Wpływ pH środowiska na rozwój drobnoustrojów jest bardzo duży. Do ich prawidłowego rozwoju jest potrzebny odpowiedni odczyn środowiska. Poszczególne rodzaje, a nawet gatunki i szczepy drobnoustrojów mają ściśle określoną wielkość pH, przy którym ich rozwój jest najlepszy. 

Zwykle kwaśniejsze środowisko sprzyja rozwojowi grzybów, tak jak środowisko o odczynie obojętnym lub lekko zasadowym jest bardziej odpowiednie dla rozwoju bakterii i promieniowców. Należy uwzględnić także fakt, że poszczególne drobnoustroje rozwijają się tylko w pewnych granicach wartości pH. U jednych drobnoustrojów zakresy te są bardzo wąskie, u innych szerokie, np. większość bakterii rośnie dobrze w granicach pH 4 - 9. Jednakże pewne bakterie siarkowe rozwijają się jeszcze całkiem dobrze przy bardzo niskim pH poniżej 1. 

Część praktyczna

Należy obejrzeć i opisać hodowle E. coli i Saccharomyces cerevisiae:

1. w bulionie z dodatkiem glukozy w stężeniach: 1, 10 i 50%.

2. w bulionie z dodatkiem NaCl w stężeniach: 1, 3 i 10%.

3. w bulionie o pH: 4, 7 i 10.

Proszę określić intensywność wzrostu na podstawie oceny stopnia zmętnienia hodowli w porównaniu do pożywek niezaszczepionych stosując skalę ocen:

brak wzrostu - (-)

wzrost słaby - (+)

wzrost dobry - (++)

wzrost silny - (+++)

Uzyskane wyniki należy wpisać do tabeli:

Szczep		Glukoza			NaCl			pH
				1 %	10 %	50 %	1 %	3 %	10 %	4	7	10
	Kontrola	1
		2
		3
	E. coli	1
		2
		3
	S. cerevisiae	1
		2
		3

Objaśnienie: kontrola - pożywka nie zaszczepiona

Na podstawie uzyskanych wyników należy określić optymalne warunki do rozwoju badanych szczepów oraz ocenić skuteczność działania ciśnienia osmotycznego i odczynu pożywki na wzrost.

5 a). Wpływ środków dezynfekcyjnych (sublimat) na bakterie (Escherichia coli) - demonstracja.

Działanie środków dezynfekcyjnych można sprawdzić metodą studzienkową. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy i zaszczepiono zawiesiną przygotowaną z hodowli E. coli. W podłożu z hodowlą wycięto korkoborem (zanurzony w denaturacie i opalony) studzienkę, którą napełniono 0,1% roztworem sublimatu (HgCl₂). Płytkę zamknięto i wstawiono do cieplarki gdzie inkubowano ją w temp. 28^oC przez 1 tydzień.

Część praktyczna

Należy obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli poddaną działaniu roztworu sublimatu (w stężeniu 0,1%).

5 b). Skuteczność działania środków dezynfekcyjnych (alkohol etylowy 75%) i detergentów (mydło) na drobnoustroje - nastawienie doświadczenia.

Część praktyczna

Aby zbadać skuteczność dezynfekcyjnego działania alkoholu etylowego i mydła na mikroflorę skóry i dłoni należy płytkę Petriego z agarem odżywczym podzielić na 3 części. 

W każdej z nich zrobić lekki odcisk palca:

1. brudnego

2. umytego wodą i mydłem 

3. przemytego watą zwilżoną etanolem (75%)

Założone hodowle należy umieścić w cieplarce w temperaturze 28^oC na ok. 48h.

Literatura wykorzystana przy opracowaniu ćwiczenia II:

• Duszkiewicz - Reinhard W. i inni - Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej. Wydawnictwo SGGW.

• Gołębiowska J. - Mikrobiologia rolnicza - Państwowe wydawnictwo Rolnicze i Leśne. Warszawa.

• Gostkowska K. i inni - Przewodnik do ćwiczeń z mikrobiologii dla studentów Wydziału Rolniczego. - Wydawnictwo AR w Lublinie

• Jabłoński L. - Podstawy mikrobiologii lekarskiej. - Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich.

• Nowak A. i inni - Przewodnik do ćwiczeń z mikrobiologii. - Wydawnictwo AR w Szczecinie.

• Schlegel H. G. - Mikrobiologia ogólna. Wydawnictwo Naukowe PWN.

• Szember A.- Zarys Mikrobiologii rolniczej.

• Różalski A. - Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wydawnictwo Uniw. Łódzkiego.

Copyright © 2001-2002

S. Russel, D. Jabłońska-Gorzała, G. Gorzała.

Webmaster: G. Gorzała

---