Ćwiczenie 4

Temat: Immobilizacja enzymu poprzez pułapkowanie w żelach

WYKONANIE

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie immobilizacji β-galaktozydazy (współsieciowanej z owoalbuminą) poprzez pułapkowanie w żelach: alginianowym, alginianowo-karagenianowym, poliakrylamidowym, agarozowo-guarowym, agarozowo-karagenianowym i żelatynowym oraz ocena wydajności tych technik. Następnie należy zbadać wrażliwość wyjściowego preparatu oraz enzymu pułapkowanego na działanie czynników (H₂O₂ + Cu²⁺, Ca²⁺, SDS, proteaza).

Część A

Współsieciowanie β-galaktozydazy z owoalbuminą

Odważyć 48 mg enzymu i rozpuścić w 1 ml wody destylowanej w próbówce wirówkowej. Odważyć 2 mg owoalbuminy i dodać do roztworu enzymu, wymieszać i umieścić w łaźni lodowej. Następnie mieszając bagietką dodać 2 ml schłodzonego acetonu i 132 μl 25 % aldehydu glutarowego, wymieszać bagietką. Umieścić próbówkę w łaźni wodnej o temperaturze 30^oC i wytrząsać przez 60 min. Odwirować (10 000 obr/min, 10 min.), odrzucić nadsącz a osad zawiesić w 3 ml wody destylowanej. Następnie sonifikować (homogenizator ultradźwiękowy) przez 2 min. na lodzie. Następnie powtórzyć wirowanie, osad zawiesić j. w. i powtórnie sonifikować. Ostatecznie odwirować, a preparat zawiesić w 24 ml wody i dokładnie wymieszać.

Część B

Immobilizacja β-galaktozydazy poprzez pułapkowanie w żelu

1. Pułapkowanie w żelu alginianowym

Roztwór enzymu usieciowanego	5 ml
Alginian sodu	500 mg
0,1M bufor octanowy, pH 4,5	12,5 ml

Małą zlewkę z buforem wstawić do łaźni wodnej o temp. 38^oC i, mieszając, stopniowo dodawać alginian. Po rozpuszczeniu alginianu dodać enzym, wymieszać i wkraplać małymi kroplami (strzykawka) do zlewki ze 100 ml 5% CaCl₂. Pozostawić do skrzepnięcia (30 min.). Przepłukać w buforze, a następnie zważyć granulki żelu i zanotować masę.

2. Pułapkowanie w żelu alginianowo-karagenianowym

Roztwór enzymu usieciowanego	5 ml
Alginian sodu	200 mg
Karagenian	200 mg
0,1M bufor octanowy, pH 4,5	5 ml

Alginian rozpuścić w 5 ml buforu, stopniowo dodając, w małej zlewce umieszczonej w łaźni wodnej o temp. 40^oC. Następnie dodać enzym i wymieszać.

Karagenian zawiesić w 10 ml wody destylowanej w małej zlewce. Wstawić zlewkę do wrzącej łaźni wodnej i powoli mieszać, przytrzymując szczypcami. Kiedy roztwór stanie się klarowny, mieszając wstawić do łaźni wodnej o temp. 40^oC. Po chwili stopniowo dodać roztwór alginianu i enzymu, cały czas mieszając (!). Następnie wkroplić (strzykawka) do zlewki ze 100 ml 5% CaCl₂. Pozostałość żelu w zlewce popłukać niewielką ilością 5% CaCl₂ i zlać do zlewki. Pozostawić do skrzepnięcia w temperaturze 4^oC (15 min.). Przepłukać w buforze, a następnie zważyć całość żelu i zanotować masę.

3. Pułapkowanie w żelu poliakrylamidowym

Zważyć pustą szalkę Petriego.

Roztwór enzymu usieciowanego	5 ml
Roztwór akrylamidu 10%	10 ml
(9% akrylamid, 1% N, N-metylenobisakrylamid w 0,1M buforze octanowym, pH 4,5)
Nadsiarczan amonu 10%	125 µl
Zmieszać, a następnie dodać:
TEMED	75 µl

Wylać na szalkę Petriego (Φ10 cm) i pozostawić do skrzepnięcia (10 min.). Zważyć szalkę z żelem i obliczyć masę żelu. Pociąć w bloczki 0,5 cm x 0,5 cm.

4. Pułapkowanie w żelu agarozowo-guarowym

Zważyć pustą szalkę Petriego.

Skład żelu

Roztwór enzymu usieciowanego	5 ml
Roztwór agarozy 1,5 % (sporządzić 25 ml gotować i ostudzić do temp. 35- 40^oC)	7 ml
Roztwór guaru 0,5 %	7 ml

Wykonanie

Sporządzić 25 ml roztworu agarowy (zawiesić naważkę w 25 ml wody dest. w kolbce, w celu rozpuszczenia gotować i ostudzić do temp. 35- 40^oC). Następnie 7 ml roztworu guaru zmieszać z enzymem i ogrzewać w łaźni wodnej w 38^oC. Dodać, mieszając, do 7 ml roztworu agarozy, a następnie wylać na szalkę Petriego (Φ10 cm) i pozostawić do skrzepnięcia. Zważyć szalkę z żelem i obliczyć masę żelu. Pociąć w bloczki 0,5 cm x 0,5 cm.

5. Pułapkowanie w żelu agarozowo-karagenianowym

Zważyć pustą szalkę Petriego.

Skład żelu

Roztwór enzymu usieciowanego	5 ml
Roztwór agarozy 1,5 %	7 ml
Roztwór karagenianu 1 %	7 ml

Wykonanie

Sporządzić 25 ml roztworu agarowy (zawiesić naważkę w 25 ml wody dest. w kolbce, w celu rozpuszczenia gotować i ostudzić do temp. 35- 40^oC). Sporządzić 25 ml roztworu karagenianu (naważkę zawiesić w wodzie destylowanej w małej zlewce, wstawić do wrzącej łaźni wodnej i powoli mieszać, przytrzymując szczypcami. Kiedy roztwór stanie się klarowny, wyjąć zlewkę i mieszając wstawić do łaźni wodnej o temp. 40^oC. Doprowadzić temperaturę roztworu do 40^oC). Następnie odmierzyć 5 ml roztworu enzymu, dodać 7 ml roztworu agarowy, ogrzać, dodać i 7 ml roztworu karagenianu, wymieszać, wylać na szalkę Petriego (Φ10 cm) i pozostawić do skrzepnięcia. Zważyć szalkę z żelem i obliczyć masę żelu. Pociąć w bloczki 0,5 cm x 0,5 cm.

6. Pułapkowanie w żelatynie

Zważyć pustą szalkę Petriego.

Skład żelu

Roztwór enzymu usieciowanego	5 ml
Roztwór żelatyny 12,5 % (w/v) o temp. 30- 35^oC	10 ml
Roztwór utwardzający (20% formaldehyd w/v; 50% etanol)	500 µl

Wykonanie

Żelatynę rozpuścić w gorącej wodzie i lekko ostudzić. Dodać roztwór enzymu, wymieszać, a następnie dodać roztwór utwardzający. Wymieszać i wylać na szalkę Petriego (Φ10 cm) i pozostawić do skrzepnięcia w - 20^oC na 4 godz. Zważyć szalkę z żelem i obliczyć masę żelu. Pociąć w bloczki 0,5 cm x 0,5 cm.

Część C

Oznaczanie aktywności usieciowanej β-galaktozydazy przed i po pułapkowaniu oraz wpływu immobilizacji enzymu na jego wrażliwość na zastosowane czynniki

Aktywność β-galaktozydazy oznacza się przy użyciu syntetycznego bezbarwnego substratu, o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozydu (ONPG), którego w czasie reakcji rozkładany jest do galaktozy i żółtego nitrofenolu. Przebieg reakcji można więc śledzić spektrofotometrycznie.













Wykonanie (dla każdego rodzaju żelu):

Odważyć po 250 mg żelu ze spułapkowanym enzymem EP dla każdej próby.

Przygotować roztwór enzymu usieciowanego EU z wyjściowego roztworu (według przepisu pod schematem doświadczenia - str. 4).

Do probówek opisanych zgodnie z poniższą tabelą wprowadzić odpowiednią ilość buforu, a następnie dodać usieciowany enzym EU [rozcieńczony z roztwory wyjściowego] (probówka nr 1, 3, 5, 7, 9) lub żel z enzymem EP (probówka nr 2, 4, 6, 8, 10). Ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 30^oC (około 5 min.).

Włączyć stoper i dodawać w 30 sekundowych odstępach odpowiednie czynniki do probówek 1-4. Gdy upłynie 10 minut od pierwszego dodania, wpipetować w odstępach 30 sekundowych substrat do wszystkich probówek tj. 1-7 (zamieszać po dodaniu!). Każdą probówkę inkubować następnie dokładnie 20 min. w łaźni wodnej w temperaturze 30^oC.

Po tym czasie (początek: 30 minuta na stoperze) pobierać w odstępach 30 sekundowych po 0,25 ml mieszaniny do próbówek zawierających 0,25 ml 10 % Na₂CO₃ i szybko wymieszać.

Do wszystkich tych probówek dodać 5 ml wody, wymieszać i zmierzyć absorbancję przy długości fali 420 nm.

Schemat doświadczenia (dla każdego rodzaju żelu):

	próbki	bufor	żel	enzym	czynnik	substrat ONPG^**	objętość końcowa
1	EU + H2O2 (30%) + Cu^2+ (1%)	765 μl	-	250 μl	78 μl H2O2 32 μl Cu^2+	250 μl	1,375 cm^3
2	EP + H2O2 + Cu^2+	765 μl	250mg	-	78 μl H2O2 32 μl Cu^2+	250 μl	1,375 cm^3
3	EU + Ca^2+ (2,5%)	765 μl	-	250 μl	125 μl	250 μl	1,375 cm^3
4	EP + Ca^2+ (2,5%)	765 μl	250mg	-	125 μl	250 μl	1,375 cm^3
5	EU + SDS	765 μl	-	250 μl	125 μl	250 μl	1,375 cm^3
6	EP + SDS	765 μl	250mg	-	125 μl	250 μl	1,375 cm^3
7	EU + proteaza (100 mg%)	750 μl	-	250 μl	125 μl	250 μl	1,375 cm^3
8	EP + proteaza (100 mg%)	750 μl	250mg	-	125 μl	250 μl	1,375 cm^3
9	EU (usieciowany)*	875 μl	-	250 μl	-	250 μl	1,375 cm^3
10	EP (pułapkowany)	875 μl	250mg	-	-	250 μl	1,375 cm^3
11	ślepa	1125μl	-	-		250 μl	1,375 cm^3

*Enzym usieciowany EU: pobrać 300 μl wyjściowego roztworu enzymu usieciowanego, dopełnić buforem octanowym do 1000 μl, wymieszać i z tego pobierać do oznaczeń 250 μl, wg tabeli powyżej.

**Substrat OPNG: 740 mg rozpuszczone w 100 cm³ 0,1 M buforu octanowego pH 4,5 (przygotowany).

Aktywność wyraża się w jednostkach laktazy (LU), zdefiniowanych jako liczba mikromoli nitrofenolu uwolnionego w ciągu 1 minuty w warunkach testu (30^oC, pH 4,5); i oblicza wg wzoru:

Aktywność (LU/g) = ΔA·30/(ε·t·W)

ΔA - różnica absorbancji między próbką testową i ślepą

W - ilość enzymu w g zawarta mieszaninie reakcyjnej

molowy współczynnik ekstynkcji: ε = 4,7

t - czas reakcji

Opracowanie wyników

Uzyskane wartości aktywności β-galaktozydazy (LU/g) usieciowanej EU i pułapkowanej EP wpisać do tabeli 1.

Następnie:

1. Obliczyć wydajność pułapkowania (%) enzymu w żelu. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli 2 i na tej podstawie wytypować najbardziej efektywny model pułapkowania.

2. Dla danego żelu obliczyć procentową zmianę aktywności enzymu sieciowanego EU oraz poddanego pułapkowaniu EP, w wyniku działania zastosowanych czynników środowiska reakcji, i wpisać do tabeli 1.

3. Określić współczynnik wydajności efektu ochronnego danego żelu jako stosunek:


% zachowanej aktywności EP po zadziałaniu czynnika

% zachowanej aktywności EU po zadziałaniu czynnika

Im wyższa wartość współczynnika, tym większy efekt ochronny żelu.

Wyniki zebrać w tabeli 3 i wytypować żel dający największy efekt ochronny.

Tabela 1

	kontrola	czynnik
				H2O2 + Cu^2+		Ca^2+	SDS		proteaza
EU (enzymu usieciowany)
aktywność (LU/g)
% zachowanej aktywności	_
EP (enzym pułapkowany w żelu …...............................................................................)
aktywność (LU/g)
% zachowanej aktywności	_

Tabela 2 Wydajność pułapkowania

rodzaj żelu	poliakrylo- amidowy	agarozowo-guarowy	agarozowo-karagenianowy	żelatynowy
% aktywności wyjściowej EU

Tabela 3 Wydajność efektu ochronnego żeli

		czynnik
		H2O2 + Cu^2+	Ca^2+		Ca^2+	proteaza
poliakrylo- amidowy
agarozowo-guarowy
agarozowo-karagenianowy
żelatynowy

4. Wyjaśnić, jaki może być mechanizm działania zastosowanych czynników

5. Wymienić zalety i wady zastosowanych metod pułapkowania

Literatura

Kozik `Zastosowania immobilizowanych białek w biotechnologii i biochemii analitycznej' Instytut Biologii Molekularnej Uniwersytetu Jagiellońskiego, 1999 Kraków; Kozik, M. Rąpała-Kozik, I. Guevara-Lora `Analiza instrumentalna w biochemii - wybrane problemy i metody instrumentalnej biochemii analitycznej' Instytut Biologii Molekularnej Uniwersytetu Jagiellońskiego, 2001 Kraków; Bednarski W., Fiedurek J. (red.) `Podstawy biotechnologii przemysłowej', 2007; Adv Drug Delivery Rev 1998, 31: 267-285; Enzyme Microb Technol 2002, 30: 613-619; Adv. Synth. Catal. 2002, 344, 815-835; Polymer Degradation and Stability 2004, 86, 455-459; International Journal of Biological Macromolecules 2003, 31, 177-185

6

o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd β-galaktoza o-nitrofenol

β-galaktozydaza

żółty

---