SPRAWOZDANIE Z ĆWICZEŃ NR. 2 z dnia 16.03.2011

TEMAT ĆWICZENIA: Wyznaczanie zmian stopnia hydrolizy białek podczas reakcji katalizowanej alkalazą.

Cel ćwiczenia: wyznaczenie zmian stopnia hydrolizy białek w czasie reakcji katalizowanej alkalazą

Alkalaza: jej substancją czynną jest subtylizyna A. Używana jest do katalizowania hydrolizy białek. Enzym hydrolizujący wiązania wewnątrz cząsteczki białka o małej specyficzności, rozszczepiający wiązania peptydowe pomiędzy resztami różnych aminokwasów. Największa aktywność w temperaturze 55-60 ̊C przy pH 8.5

1. Enzymatyczna hydroliza białek mięsa i oznaczanie DH metodą pH stat.

Wykonanie: do 150 g otrzymanego surowca dodajemy 300ml wody destylowanej, wprowadzamy do zlewki elektrodę pH- metru, ogrzewamy mieszaninę do 55 ̊C i doprowadzamy do pH 8.5 za pomocą 4M NaOH. Do próbek dodajemy 4ml alkalazy i dokonujemy pomiarów pH co 5min.

Otrzymane wyniki:

Pomiar/czas	Ilość zużytego NaOH
0 wstępna regulacja pH	4.4
1. po 5 min	5.2
2. po 10min	1.5
3. po 15min	0.5
4. po 20min	0.4
5. po 25 min	0.4
6. po 30min	0.3
7. po 35min	0.3
8. po 40min	0

Opracowanie wyników:

• Obliczenie DH (stopnia hydrolizy) po każdym pomiarze:

Korzystamy ze wzoru: DH (%) = (V ∙ M/ α ∙h∙m_p) ∙100

gdzie:

V - wyrażona w ml objętość 4 M roztworu NaOH zużytego w celu przeciwdziałania zmianom pH podczas procesu,

M - stężenie molowe NaOH - 4 h- współczynnik zależny od ogólnej ilości wiązań peptydowych w białku ,którego średnia wartość dla białek mięsa wynosi 7.6 m_p - wyrażona w gramach masa białka w próbce 33g

stopień dysocjacji α = 10 ^pH-pK/ (1+10 ^pH-pK) wartość α w temp.55 ̊C przy pH 8.5 wynosi 1.6232

Pomiar/czas	DH
1. po 5 min	5.1093
2. po 10min	6.5831
3. po 15min	7.0744
4. po 20min	7.4674
5. po 25 min	7.8605
6. po 30min	8.1552
7. po 35min	8.4500
8. po 40min	8.4500

Wykres zależności stopnia hydrolizy białek od czasu prowadzenia procesu

2. Oznaczenie wolnych grup karboksylowych i DH metodą miareczkowania for molowego.

Wykonanie: pobieramy 5ml hydrolizatu, dodajemy kroplę fenoloftaleiny i doprowadzamy próbę do lekko różowej barwy za pomocą NaOH, dodajemy 5ml aldehydu mrówkowego i miareczkujemy 0.02 M roztworem NaOH (3powtórzenia)

Obliczamy zawartość wolnych grup karboksylowych:

1ml 0.02 M roztworu NaOH reaguje z 20 µmolami kwasu karboksylowego

Próba	Ilość zużytego NaOH (ml)	Zawartość wolnych grup karboksylowych (µmol)
1	22,5	450
2	25,5	510
3	24,0	480

Następnie oznaczamy zawartość wolnych grup karboksylowych w kolejnych próbkach poddanych całkowitej hydrolizie w środowisku 6M HCl

Obliczamy stopień hydrolizy:

Korzystamy z wzoru: DH (%) = (N₁/N₂) ∙100%

gdzie:

N₁ - zawartość wolnych grup karboksylowych w hydrolizacie

N₂ - zawartość wolnych grup karboksylowych w próbce po całkowitej hydrolizie.

PORÓWNANIE DWÓCH METOD:

Maliszewska Elwira Orłowska Kinga Jeziorska Anita Grzelecka Katarzyna Gagoś Krystian Dzierżanowski Igor Białek Joanna Szczęsna Żaneta

Nie znam tylko tej końcowej objętości…;/ dlatego nie obliczyłam tej metody miareczkowej… a jeśli chodzi o miareczkowanie to w pierwszym było: 0.65, 0.1, 0.9

A w drugim: 22,5, 21, 28 (ale tą można zmienić i to uśrednić;))

możesz popatrzyć może Ty wpadniesz na to jaka to powinna być wartość, bo tak to zostało tylko popodstawiać to do wzoru

Ja jeszcze pomyślę nad tym, może wymyślę o co tu chodzi.. miałam problem ze zrobieniem wykresu i nie podpisałam osi, ale to najwyżej jak wydrukuje to dopiszę

4

---