Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie 1

Oznaczanie jonów Fe⁺³ metodą kolorymetryczną

Absorpcjometria należy do metod optycznych, w których wykorzystuje się zjawisko selektywnej absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez badane substancje do ich wykrywania, identyfikacji i oznaczania. Kolorymetria jest natomiast szczególnym przypadkiem absorpcjometrii, w którym oznaczenia spektrofotometryczne wykonuje się w zakresie widzialnym promieniowania elektromagnetycznego (360-770 nm).

Podstawą oznaczeń absorpcjometrycznych jest prawo Lamberta-Beera, które dla roztworów jednorodnych można przedstawić w postaci:

I₀

A= log ^___ = k ^. l ^. c gdzie A- absorbancja

I_I Io- natężenie światła padającego na próbkę

I₁ - natężenie światła po przejściu przez próbkę

k - współczynnik molowy absorbancji (stały

dla danej temperatury i rodzaju substancji)

l - długość drogi jaką przebywa promień światła

c - stężenie badanej substancji [mol/dcm³]

Prawo Lamberta-Beera mówi, że absorpcja światła monochromatycznego o długości λ_max (długość fali, przy której pochłanianie jest największe), przechodzącego przez roztwór, jest proporcjonalna do stężenia roztworu i grubości jego warstwy. W pomiarach spektrofotometrycznych zwykle używa się znormalizowanych kuwet o grubości 1cm (czyli l jest stałe i równe 1 cm), a więc absorbancja badanego związku w danej temperaturze jest tylko funkcją stężenia związku. W pewnym zakresie stężeń jest to zależność liniowa, co pozwala na wykonanie tzw. krzywej wzorcowej to znaczy zależności absorbancji od stężenia (oś X- stężenie, oś Y- absorbancja). Po zmierzeniu absorbancji dowolnej próbki oznaczanego związku można z krzywej wzorcowej odczytać jego stężenie.

W oznaczaniu kolorymetrycznym jonów żelaza wykorzystuje się fakt, że jony Fe⁺³ tworzą z jonami rodankowymi (SCN^-) związek o czerwonym zabarwieniu, a intensywność barwy jest szczególnie duża w środowisku kwaśnym:

Fe⁺³ + 3SCN ^- = Fe(SCN)₃

W ustalonych warunkach ćwiczenia absorbancja roztworu Fe(SCN)₃ zależy tylko od stężenia jonów żelaza w roztworze. Celem ćwiczenia jest oznaczenie ilości jonów Fe⁺³ w roztworze dostarczonym przez prowadzącego zajęcia. Aby wykonać to oznaczenie konieczne jest sporządzenie krzywej wzorcowej.

Wykonanie oznaczenia

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny :

roztwór jonów Fe⁺³ o stężeniu 20 μg/cm³

roztwór jonów SCN^- o stężeniu 5%

roztwór HCl o stężeniu 3 mol/dm³

spektrofotometr Specol

probówki skalowane o pojemności 10 cm³

zestaw pipet o pojemności 1, 2 i 5 cm³

• Wykonanie krzywej pochłaniania

Przygotować dwie probówki skalowane (o objętości 10 cm³), ponumerować 0 i 1. Do obu probówek dodać 5 cm³ roztworu SCN^- i 1 cm³ roztworu HCl. Do probówki 1 dodać 1,5 cm³ jonów Fe⁺³. Obie probówki dopełnić wodą do objętości 10 cm³. Otrzymane roztwory starannie wymieszać i zmierzyć absorbancję próby 1 wobec próby 0 (ślepej) zmieniając długość fali od 400 do 600 nm, co 20 nm. Wykonać wykres krzywej pochłaniania na papierze milimetrowym.

• Wykonanie krzywej wzorcowej

Ponumerować sześć probówek skalowanych (o objętości 10 cm³) od 0 do 5, a następnie do każdej z nich dodać 5 cm³ roztworu SCN^- i 1 cm³ roztworu HCl. Probówkę _„0^” (próba ślepa - zawierająca wszystkie substancje z wyjątkiem związku oznaczanego, czyli jonów Fe⁺³) dopełnić wodą do objętości 10 cm³, a do pozostałych probówek dodać jony żelaza w podanej poniżej ilości:

nr probówki Fe⁺³ [cm³]

1 0,5

2 1,0

3 1,5

4 2,0

5 2,5

Wszystkie probówki dopełnić wodą do objętości 10 cm³.

Otrzymane roztwory starannie wymieszać i zmierzyć ich absorbancję na spektrofotometrze wobec próby ślepej przy długości fali ustalonej na podstawie krzywej pochłaniania..

Wykonać wykres krzywej wzorcowej na papierze milimetrowym.

• Oznaczenie ilości jonów żelaza w otrzymanej próbce

Do otrzymanego od prowadzącego zajęcia roztworu zawierającego nieznaną ilość jonów Fe⁺³ dodać 5 cm³ roztworu SCN^- i 1 cm³ roztworu HCl, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać i zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej. Odczytać z krzywej wzorcowej stężenie jonów żelaza w otrzymanym roztworze.

Zaliczenie ćwiczenia :pisemne sprawozdanie z wykonania doświadczenia zawierające tytuł ćwiczenia, zasadę oznaczenia, uzyskane wyniki, wykresy oraz odczytane z krzywej wzorcowej stężenie jonów Fe⁺³.

1

---