(grupa E):
1. czego sie uzywa do znakowania dna gdy uzywany jest fragment klenowa.
2. pytanie o nukleaze s1, do czego sluzy, jakie ma wlasciwosci.
3. pytanie pierwsze, dotyczace tego rysunku:
- czy wystepuja polilinkery,
- czy wystepuja dwa rozne markery,
4. podac najlepsza temperature do PCR gdy podana jedna nic,
5. jaki produkt powstanie, gdy strawimy dna nukleaza ktora tworzy lepkie konce, a pozniej potraktujemy to s1, a nastepnie bal31

jak transformowano bakterie pBR322 (chyba) otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.
2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA
3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension

bylo cos jeszcze o transformacji bakterii.
o ile pamietam to cos bylo o szalce o srednicy 12 cm, i do jednych bakterii dodano plazmid z genem opornosci na (bodajze) ampicyline i odrazu wysiano na pozywke zawierajaca tenze antybiotyk, a drugie bakterie zmieszano z plazmidami, inkubowano jakis tam czas i dopiero wysiano na pozywke z tym antybiotykiem.

9.Przy pomocy techniki primer extension mozna mapowac 5' koniec transkryptu.w tym celu mozna tez posłużyc sie techniką wykorzystujaca nukleazę SI.która z podanych ponizej informacji nie ma miejsca przy primer extension?:
a)....
b)denaturacja DNA i elektroforeza
c)hybrydyzacja
d)wariant tej techniki może być uzyty do mapowania 3' końca,reakcja przy udziale rekombinowanego enzymu
e) ....
W metodzie selekcji przez komplementację transformanty są białe - powstaje tylko niekompletny fragment, powiedzmy LacZ' (bis), B-galaktozydazy. Komórki transformowane 'pustym' wektorem są niebieskie - insert nie rozrywa genu LacZ'. Komórki nietransformowane giną pod wpływem Amp.

1. jak transformowano bakterie pBR322 otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.
   
   odp. mniej bo im mniejsza cz. DNA tym lepiej bakteria ją łyknie (z insertem jest wiekszy niz sam plazmid)
   
   2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA
   
   ja dalam polimeraza DNA I , bo odwrotna transkryptaza ma starter komplementarny do AAAAAA na 3' koncu mRNA a jak ona juz zrobi ta cz. DNA to pol.DNA I moze miec problem ze starterem
   
   5-------------------------------AAAAAAAAAAA3 mRNA
   _________TTTTTT (starter dla odw. transkryptazy)
   
   
   5---------------------------------AAAAA3 (RNA)
   3---------------------------------TTTTT5 (1szy DNA)
   ^^^ tu jest problem wlasnie (a to robi pol. DNA)
   
   3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension
   tu nie pamietam co bylo
   
   to sie robi kinaza polinukleotydowa wiec moze byc jakikolwiek ale zeby byw pozycji GAMMA, bo to kinaza i ona nie wbudowuje do lancucha tylko przenosi tą grupe PO4 co jest najdalej cukru

Metody otrzymywania ssDNA do sekwencjonowania:
1) klonowanie w plazmidzie a potem denaturacja (np. ciepłem czy alkaliami)
2) klonowanie za pomocą faga M13
3) użycie fagemidów + fagów pomocniczych - zakaża się E. coli jednym i drugim co prowadzi do powstania
ssDNA
4) klonowanie za pomocą techniki PCR

dpp genes kodują białka odpowiedzialne za prawidłowy rozwój osiowy krękowców (ale i nie tylko np u Drosophila melanogaster też) podczas embriogenezy.

Coś na temat wektorów (pochodnych fagowi Lambda):
a dokładnie o wektorach
1) insercyjnych;
2) zastępczych;

EMSA - test zmiany ruchliwości podczas elektroforezy (wywołany np związaniem białka do DNA)

Gene targeting - czyli wyłączanie genów. Po co? Żeby móc określić funkcję nieznanego genu tzn jego produktu!

Czy jesteście pewni co do tego, że kinaza polinukleotydowa używa dATP i ATP (konkretnie- gamma-fosforanów z tych związków), a nie używa innych trójfosforanów (np. dGTP, GTP, dCTP...)?

Słuchajcie! Mam wątpliwość odnośnie poprawności obliczeń ilości fragmentów o zdefiniowanej długości . Wg. mnie nie było popr. odpowiedzi na to pytanie, gdyż :

Aby obliczyć liczbę powielonych fragmentów możemy zrobić to nie wprost.
Zdefiniujmy najpierw fragment DNA jako parę komplementarnych do siebie łańcuchów DNA o jednakowej długości.
Załóżmy, że na początku jest 1 fragment DNA. Wiadomo, że PCR działa w ten sposób, że w jednym cyklu całkowita liczba fragmentów (wszystkich, niezależnie od długości) się podwaja. Zatem po pierwszym cyklu będzie 2, po drugim 2^2,... po n cyklach całkowita liczba fragmentów wynosi 2^n. Fragmentów o pośredniej długości (między dł. fragmentu początkowego a dł. fragmentu docelowego) będzie więc n ( w każdym cyklu powstaje dokładnie 1 nowy fragment o pośredniej długości- powstaje on z pierwotnej matrycy! ). Po n cyklach PCR jest ciągle zawsze tylko 1 fragment o początkowej długości.
Wobec tego zdefiniowanych fragmentów po n cyklach jest 2^n-n-1.

Dokładny wzór na ilość produktu po PCR to:

N=N'*((1+Y)^n)

gdzie N' - to ilość cząsteczek matrycy
n - ilość cykli
Y - efektywność polimerazy (od 0 do 1)

(miałam to na laborce)
Zakładając, że mieliśmy 1 matrycę oraz wiedząc z treści, że polimeraza nie traci aktywności (czyli efektywność=1), wzór upraszcza się do 2^n! Zresztą to jedyny wzór, jaki Endrju podał na wykładzie - więc nad czym tak debatować.

Z moich notatek:
Nukleaza S1:
- endonukleaza
- preferuje pojedyńcze nici
- substraty: DNA, RNA
- produkty 5'-p(Np)n-N

Bal 31:
zaliczana do end, ale zachowuje siejak egzonukleaza
Rzeczywista:
- endonukleaza
- substrat:ssDNA
- produkty:5'-p(Np)n-N
Pozorna:
- egzonukleaza
- substrat:dsDNA
- produkty: 5'-NMP

jeśli chodzi o ten spór z produktami PCR to na bank jest to odpowiedź 2^(n-2) ponieważ w pytaniu chodziło o ZDEFINIOWANEJ długości odcinki. Potwierdzenie możecie znaleźć w którymś z moich linków który tu wisi!

5'---wektor----wiązanie----insert----wiązanie---wektor----3'
3'---wekto r----wiązanie----insert----wiązanie---wektor----5'
czaisz?

bo rozumiem ze mozna sobie inaczej liczyc cząsteczki po pcrze (chociaż tych o dł. od jednego primera do drugiego na pweno bedzie 2^(n-2)), ale tu to juz nie przesadzaj :)

Nicze : Zauważ, że jak podzielisz dane w Twojej tabelce przez 2 to otrzymasz dokładnie wyniki, zgodnie podanym przeze mnie wzorem : 2^n-n-1.
Oni bowiem podają całkowitą liczbę nici w sekwencjach docelowych, a powyższy wzór liczbę sekwencji docelowych (traktowanych jako dwuniciowe kompleksy).
Poza tym podpisy pod tabelką są nieprecyzyjne :
jest napisane np. double stranded target molecules, a tak naprawdę liczby odpowiadają ilościom pojedynczych nici sekwencji docelowych (a nie, jak sugeruje opis sekwencjom dwuniciowym).

Czyli wszystko się zgadza. Obowiązuje wzór 2^n-n-1.

kasiamal : Podany przez Ciebie wzór jest OK, dla dużej ilości cykli. Wtedy podany przeze mnie wzór przechodzi w Twój wzór, gdyż dla dużych n 2^n >> n+1.
Dla małych n się nie sprawdza. Mówię, sprawdź sobie dla n=3 :)
W wyprowadzeniu wzoru 2^n-n-1 również zakłada się efektywność polimerazy jako Y=1.

Informacje o enzymie Bal31 ze strony firmy Fermentas:

Bal31 - katalizuje degradację ssDNA, liniowego dsDNA i RNA do 5'-mononukleotydów.

Liniowe dupleksy DNA:DNA i RNA:RNA są degradowane jednocześnie od końców 5' i 3' (z obu stron odtrawiane są mononukleotydy).

Bal31 jest także endonukleazą, która przecina nicki i regiony ss dupleksów DNA:DNA i RNA:RNA.

Rzecz o nukleazie S1, z podręcznika 'Genomes 2':

Nukleaza S1 - enzym degradujący ssDNA i RNA.

Nie ma wpływu na DNA:DNA, RNA:RNA, DNA:RNA.

Degraduje jednak regiony jednoniciowe (np. nicki) ww. dupleksów.

Jednym słowem, degraduje wszystko, co jednoniciowe.

Z tego, co widzimy Bal31 działa tak samo jako S1, ale potrafi dodatkowo degradować liniowe dupleksy.

Było zadanie na egzaminie, w którym użyto obu enzymów. IMHO wynikiem powinna być mieszanina mononukleotydów (na skutek działania Bal31), a więc nie ma poprawnej odpowiedzi :/ No chyba, że Fermentas się myli, w co wątpię.

Może lepiej na rysunku pokażę, o co mi chodzi i jak może działać Bal31:
stan początkowy:

ATGCGTTC
TACGCAAG
1.
ATGCGTT C
TACGCAAG
2.
ATGCGTT C
TACGCAA G
3.
ATGCGT T C
TACGCAA G
4.
ATGCGT T C
TACGCA A G
Po wielu krokach dostajemy mieszaninę nukleotydów.

Była poprawna odpowiedź. Bowiem powiedziane zostało, że najpierw działano endonukleazą S1, która odtrawiła lepkie końce, a następnie ten dwuniciowy kompleks był nadtrawiany enzymem Bal31 (działa tak jak egzonukleaza symetrycznie odtrawiająca nukleotydy zarówno od 3' jak i 5' końca DNA). W wyniku tego powstał zatem fragment o końcach tępych.  

Majuma : tak, przy założeniu, że reakcja jest przeprowadzona do końca. Lecz moim zdaniem należało przyjąć, że reakcja została w jakiś sposób przerwana. Zresztą, był tylko 1 fragment o tępych końcach, co sugerowało takie, a nie inne spojrzenie na to wszystko.

Okazuje się, że chromosomy YAC są równie bezużyteczne. Cytując za 'Genome 2':

The original plan was that the sequencing phase of the Human Genome Project would be based on YAC libraries, because this type of vector can be used with DNA fragments longer than can be handled by any other type of cloning system. This strategy had to be abandoned when it was discovered that some YAC clones contain non-contiguous fragments of DNA. The Project therefore turned its attention to BACs.
Więc nie tylko wektor plazmidowy, ale taże YAC należy zaznaczyć.

Wektor trawiony jest przez EcoR1 (to chyba chodziło o faga lambda) i wstawiany jest do środka fragment 20 kbp:
a) mogą ze sobą ligować
b) dłuższy o 20 kbp
c) dłuższy o 40 kbp
d) łysinka zawiera cały genom wektorów
e) ?

wektor był na pewno substytucyjny i chodzilo o to że nie wejdzie więcej niż 20 kbp więc wektor nie będzie dłuzszy o 40 kbp, najwyzej o 20 kbp, sam genom faga też nie moze być bo one są tak konstruowane ze sie nie zapakuje i takich łysinek nie będzie też, a ostatniej odpowiedzi nie pamietam

a co do bezużyteczności i YAC-ów, to masz racje, ale w pytaniu zapewne chodziło o to który z wymienionych jest NAJBARDZIEJ bezuzyteczny czyli jedna odpowiedz prawidłowa, a nie powiesz chyba ze taki plazmid mieszczący pare kbp jest bardziej uzyteczny przy sekwencjonowaniu genomu czlowieka niż YAC do ktorego mozna wsadzic duuuzo wiecej. poza tym jak wywali sie YAC-a to należałoby wywalic wszystko inne poza BAC-ami, nie? a maxymalnie mialy byc 2 prawidlowe

Majumo,pytałeś o kinaze polinukleotydową:
tyle mam w sowim zeszycku-prosto ze Stryerka :)
--)kinaza polinukleotydowa fosoryluje 5`-koniec=przyłącza 32P do 5`OH przenoszony z ATP'

a gdzie indziej mam napisane ze substratem dla kinazy jest dATP
wiec może rzeczywiścia bedzie zarówno ATP jak i dATP

Sam Ożyhar powiedział, że prawidłową odpowiedzią do pytania o ilość produktu po PCR jest 2^(n-2), bo dwa pierwsze cykle są bezużyteczne.

Fagemidy : najprościej rzecz ujmując plazmidy, które zawierają miejsce replikacji faga M13. Stosuje się je dlatego, że do samego faga M13 można wklonować bardzo małe fragmenty, chodzi o zwiększenie długości insertów. Aby mogło dojść do ich pakowania, należy nadkazić hodowlę fagami M13. A ssDNA jaki dzięki temu uzyskujemy możemy użyć np. dla celów sekwencjonowania metodą dideoksy.

Miejsca cos- skrót od cohesive sites , miejsca jednoniciowe w genomie faga lambda, umożliwiają tworzenie kolistej cząsteczki faga lambda, która jest konieczna do integracji z genomem. Poza tym mają duże znaczenie przy replikacji i pakowaniu faga lambda.

Kosmidy : plazmidy, które zawierają miejsca cos. Tym razem zależy nam na tym, żeby zwiększyć pojemność fagów lambda. Tak naprawdę, zauważono, że DNA , które zawiera miejsca cos może zostać pakowane do płaszcza białkowego fagów lambda np. przez pakowanie in vitro.
Wykorzystano tę własność do tworzenia kosmidów- są to małe plazmidy, nie zawierające zbędnych informacji strukturalnych o fagu lambda takich jak genów białek otoczki, genów odpowiedzialnych za cykl lizogeniczny itp. Mają tylko miejsca cos, miejsce restrykcyjne, i marker odporności na antybiotyk. Jeżeli do takiego kosmidu wklonujemy insert, to tylko jeżeli będzie on określonej długości (odpowiednio duży) zostanie upakowany do cząsteczek fagowych. Potem infekujemy takimi 'pseudofagami' komórki bakteryjne - wszystkie klony są rekombinantami, gdyż kosmidy, które uległy np. religacji są zbyt małe aby mogły być upakowane.
Oczywiście nie powstają łysinki ponieważ nie dochodzi do lizy komórek gospodarza.

Jeżeli insertem jest syntetyczny oligonukleotyd, to wtedy powstaną dwa wiązania, bowiem on nie ma grup fosforanowych na swoich 5' końcach.

Dokładnie nie pamiętam.
Natomiast wiem, że YACi, BACi bardzo dużo (nawet kilkaset kb) i kosmidy- b. dużo :) i fagi lambda - zastępcze mogą przyjąć do 20 kb. Plazmidy z reguły nie wychodzą poza 8kb.
Także te najmniejsze (czyli plazmidy) się nie nadają, bo byśmy mieli za bardzo rozfragmentaryzowaną bibliotekę (genom ludzki ma 3 000 000 kb )  

Madzia : No najwyraźniej zostaną. Nie sądzę, by miało to decydujący wpływ na przebieg eksperymentu. Jeżeli DNA z nickami jest stabilne to to tym bardziej (bo tutaj tylko nie ma 2 wiązań fosfodiestrowego, ale struktura jest usztywniona poprzez oddziaływania między zasadami.

Jeśli chodzi o BAC... to w mądrej książce jest napisane, że jest używany do klonowania fragmentów przynajmniej 300kb

Z notatek z wykładu: pojemnosci w [kb]:
cosmid 40
wektor fagowy 20
ale M13 2
plazmid 8
BAC 300.
Madziu, moze byc jak najbardziej tak zligowany insert ze bedą dziury czyli nicki i wtedy mamy 2 wiazania fosfodiestrowe. Jezeli sie wczesniej 5` konca nieufosforylowalo w tym sztucznym insercie to nic sie juz z tym nie da zrobic; zostaną 2 nicki. Kinaza przenosi reszte fosforanowa z dATP na 5` koniec. Pa

Te "dziury" są łatane przez system naprawy DNA gospodarza. Taki problem był na laboratorium podczas wklonowywania EcRDBD do pGEX-2T. W ten sposób można wklonować insert w dwóch orientacjach, z czego jedna tylko ma sens z punktu widzenia ekspresji produktu. Komórki z wektorami z nieprawidłowo wklonowanym insertem należy odrzucić :D

Zapamiętaj tyle: kolonie rekombinantów są BIAŁE. Kolonie nierekombinantów (z "pustym" wektorem; bez insertu) są NIEBIESKIE. Komórki nietransformowane (w ogóle bez wektora) giną.

Oligonukleotydy syntetyczne oczywiście można ufosforylować, bo niczym się one nie różnią od normalnego DNA, ale w treści zadania nie ma słowa o tym, że coś takiego wykonano. Więc większość z nas (wszyscy) się na to złapała.

Kinaza polinukleotydowa jest enzymem specyficznym dla ATP i tylko dla ATP. Żadne inne entepy albo inne deentepy nie wchodzą w grę.

Co innego Polimeraza DNA - bierze dNTP a także ddNTP. Najwyraźniej dla niej te podstawniki hydroksylowe są bez różnicy, skoro metoda Sangera działa.

Kinaza polinukleotydowa - dowód, że używa tylko ATP.

czy ktos mi moze dac odpowiedz na to pytanie??9.Przy pomocy techniki primer extension mozna mapowac 5' koniec transkryptu.w tym celu mozna tez posłużyc sie techniką wykorzystujaca nukleazę SI.która z podanych ponizej informacji nie ma miejsca przy primer extension?:
a)....
b)denaturacja DNA i elektroforeza
c)hybrydyzacja
d)wariant tej techniki może być uzyty do mapowania 3' końca,reakcja przy udziale rekombinowanego enzymu
e) ....

tu tzreba bylo wskazac nieprawidlowa odp z tego co pamietam. I zaznaczylam d bo tak mis ie wydawalo. Inne procesy maja miejsce wiec sa prawdziwe.

ależy zaznaczyć b) i d).

B) dlatego, że 'denaturacja DNA' NIE zachodzi. Zachodzi za to denaturacja dupleksu DNA:RNA.

Pisałem już przecież, że TYLKO ATP i podawałem dowód ze strony firmy o światowej renomie - Fermentas.

przy pytaniu dot. wektora....: Do tworzenia bibliotek genomowych są używane: YACi BACi i plazmidy (dla małych fragmentów)...

O tym, że YACi były chybionym pomysłem i nie są już używane też pisałem. Kurczę, czytajcie to forum ze zrozumieniem.

mam pytanie do tego zadania ze starterami, one byly komplementarne do siebie i moim zdaniem nie powinny byc urzyte. wiec odpowiedz to e czyli zadna?? jak Wy zaznaczyliscie?

Pod żadnym pozorem nie mogą być użyte. Nawet mała komplementarność jest wysoce niepożądana.

Zresztą ja obliczyłem temperatury topnienia i wyszły mi bardzo różne. Maksymalnie dopuszcza się 1 st. różnicy w Tm, a to i tak warunkowo.

temperatury wyszly mi takie same. jesli byly komplementarne to musi wyjsc taka sama temperatura przeciez. pisze jesli bo nie wiem czy byly. kolezanka powiedziala mi po egzaminie. moze ktos to wie??

Chyba nie zauważyłem jakiegoś nukleotydu i mi wyszły różne temp. :P Ale to i tak bez znaczenia. Należało zaznaczyć E) - zostały źle zaprojektowane i nie nadają się do niczego.
No ja też na tym padłem. Profesor zaszalał z tym pytaniem :)

A zaznaczyliście, że przy primer extension nie zachodzi także denaturacja DNA (oprócz tego, że nie istnieje jej wariant dla okreslenia 3' konca)? Ja to zaznaczyłem, bo uważam, że DNA nie można utożsamiać z hybrydem DNA-RNA

---