mikro egz prakt opracowanie2

M I K R O B I O L O G I A

EGZAMIN PRAKTYCZNY-ZAGADNIENIA

1.Zasady pobierania i transportu materiałów np.: krew, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy.

Miejsce pobierania (skąd), sposób pobierania, objętość (ilość) pobranego materiału, rodzaj podłoża, transport materiału.

Podstawowe zasady pobierania materiałów do badania bakteriologicznego.

Miejsce zmienione chorobowo
Czas pobrania (patofizjologia, antybiotyki)
Odpowiedni i odpowiednio przygotowany sprzęt (wymazówki, jałowe naczynia, podłoża)
Objętość próbki
Oznakowanie próbki
Skierowanie (dane pacjenta, oddział, data i godz. pobrania, rodzaj materiału, rozpoznanie, wymagane badanie, antybiotyki, podpis i pieczątka lekarza)

Podstawowe zasady pobierania materiałów do badania wirusologicznego.

Miejsce zmienione chorobowo
W ostrym okresie choroby
Krew, płyn m-r, plwocina, popłuczyny z nosa, oskrzeli, bronchoaspirat, mocz, kał, zmiany skórne, ze spojówek, płyn owodniowy
W przypadku trudności z izolacją wirusa z narządu docelowego (wątroba, tk. mózgowa) pobieramy z innych miejsc-wrota wnikania lub wydalania: drogi oddechowe, kał, mocz
Transport próbki w niskiej temperaturze 4 C
Podłoża transportowe VIB, SPG (inne niż do bakterii)
Wstępne opracowanie materiału (dodanie antybiotyku)

2.Pobieranie materiałów-przydatność poszczególnych zestawów: wymaz, podłoże transportowe, podłoże transportowo-wzrostowe.

ZASADY OGÓLNE:

→ materiał ma być pobrany z miejsca gdzie toczy się proces zapalny i w taki sposób aby uniknąć zanieczyszczenia z okolicznych tkanek

→ o odpowiednim czasie

→ w odpowiedniej ilości

→ przy pomocy wymazówek, jałowych pojemników, specjalnych podłoży

→ przy krótkim czasie transportu w odpowiednich warunkach

→ z jak najszybszym rozpoznaniem

KREW: posocznica, bakteriemia, fungemia, wiremia

⇒ 2-3 próbek w ciągu dnia z różnych miejsc-bakteriemia

⇒ ½ h przed szczytem gorączki

⇒ bakteriemia intermitująca - 2 próbki na raz

⇒ nie znane dwie próbki w odstępie 1 h

⇒ posiew na podłoża płynne 1:10, 1:5

⇒ pożywki:

*TSB - bulion tryptozowo-sojowy

*BHJ - bulion mózgowo-sercowy

antykoagulant SPS polinetosulfonian sodu

witaminy B6 U-dla beztlenowców

⇒ pożywka wyjęta z lodówki, ogrzana do temperatury ciala

⇒ przenoszenie w termosie, ochrona przed zimnem

⇒ inkubacja 7-8 dni (wynik--)

⇒ jeśli rośnie to rośnie szybciej (1-2 dni) pobieramy kolonie, barwienie metodą Grama, antybiogram, podłoże Mueller-Hintona

⇒ SYSTEM BACTEC,

*automatyczny system do posiewu krwi

*czujniki mierzące co 15 min. stężenie CO₂ (wzrost CO₂ - ALARM)

PŁYN MÓZG-RDZEŃ. -takie same zasady co przy krwi

⇒ nakłucie lędźwiowe

⇒ 37 C, Meningomedium - podłoże

UKŁAD ODDECHOWY

⇒ plwocina ranna

⇒ umyć zęby,

⇒ jamę ustną przepłukać letnią wodą

⇒ głębokie odkrztuszenie do jałowego pojemnika

⇒ bronchoskopia - nakłucia przeztchawicze

UKŁAD MOCZOWY

mocz-podstawowy materiał, bardzo dobra pożywka

„z nocy”, środkowy strumień po dokładnym podmyciu, odciągnięciu napletka, rozchyleniu warg sromowych
do jałowego pojemnika nakłucie nadłonowe pęcherza
cewnikowanie (po zmianie cewnika)
noworodki-jednorazowe woreczki przylepne (problem!!)
można przechować w lodówce 1-2 h
bezpośredni posiew na podłoża:

*transportowo wzrostowe: Uromedium, Uncult

*McConkey, CLEO

*Sabourauda dla grzybów

DROGI RODNE

wymazy z cewki, pochwy, szyjki macicy

PODŁOŻE TRANSPORTOWE

⇒ bakterie mało wymagające nie zdominują innych

⇒ lodówka 4 C

!!! - Wirusy przenosimy w 4 C

3.Barwienie metodą Grama-wykonanie preparatu, zabarwienie, nastawienie, interpretacja.

Podstawowa metoda barwienia w bakteriologii i mikologii:

Barwienie fioletem krystalicznym 1min.
Płukanie wodą
Płyn Lugola 1min.
Płukanie wodą
Odbarwienie alkoholem 20sek.
Płukanie wodą
Barwienie fuksyna 20sek.
Płukanie wodą
Suszenie
Oglądanie pod mikroskopem przy użyciu olejku immersyjnego

Drobnoustroje barwiące się pozytywnie są koloru niebieskiego (bakterie Gram(+), drożdżaki i grzyby drożdżopodobne)

Drobnoustroje nie barwiące się są koloru różowego(bakterie Gram(-)

4.Ocena preparatów w mikroskopie świetlnym (preparaty barwione metodą Ziehl-Neelsena-1, Grama-2)

Opisujemy co widzimy:
- czy w ogóle są bakterie
- G (+) czy G(-)

- kształt bakterii (pałeczki, ziarenka, laseczki, maczugi itd.)

- wielkość

- różnorodność

- grupowanie (dwoinki, paciorki, gronka itd.)

- otoczki

- ziarnistości

- dodatkowo: komórki zapalne, śluz, nabłonki itd.

Popłuczyny oskrzelowe- GRUŹLICA- barwienie metodą Ziehl-Neelsena (kwasooporne prątki, świecące prątki w świetle ultrafioletowym)

5.Kolejne etapy diagnostyki mikrobiologicznej: schemat badania materiałów np. ropa z jamy brzusznej, krew, mocz, plwocina.

Badanie bezpośrednie (preparat bezpośredni barwiony lub nie, oglądany w mikroskopie)
Metody hodowlane: podłoża stałe
Identyfikacja wyosobnionych bakterii: morfologia komórek-preparat barwiony metoda Grama, morfologia kolonii i określenie cech metabolicznych (za pomocą szeregów biochemicznych)
Oznaczenie wrażliwości na chemioterapeutyki

6.Testy API -zastosowanie w diagnostyce.

biochemiczne, zastosowanie w diagnostyce

⇒ Testy przesiewowe

⇒ Oparte na reakcjach biochemicznych

⇒ Określone probówki zawierajęce substraty (węglowodany, zw.chem.), które są rozkładane przez dany gatunek bakt.; zachodzą reakcje barwne umożliwiające odczyt i identyfikację bakterii,

⇒ Cechy biochemiczne (biotyp) drobnoustrojów: właściwości fermentacyjne, specyficzne produkty metabolizmu.

7.Podłoża wzrostowe (ujemne): agar krwawy, podłoże Chapmana, czekoladowe, McConkeya, Saburauda, tioglikolan sodu i ich zastosowanie.

8.Podłoża bakteryjne (dodatnie): krwawy, podłoże Chapmana, czekoladowe, McConkeya, Sabourauda, tioglikolan sodu -ocena morfologii koloni.

AGAR z krwią

1.Paciorkowce β-hemolizujące (cakowicie) barwa przezroczysta

grupy A, B,C,F,G GAS (group A streptococci), Streptococcus pyogenes

2.Paciorkowce α - hemolizujące - barwa zielona

Streptococcus pneumoniae

Grupa viridans - zieleniejące: Str. sanguis, salivarius, mutans, intermedius, milleri

PODŁOŻE CHAPMANA - wybiórczo-różnicujące dla gronkowców

Czynnik wybiórczy - 7% NaCI - rosną tylko gronkowce

Czynnik różnicujący mannitol

mannitolo (+), zmiana barwy na żółtą

Staphylococcus aureus ,

Czasami St. Saprophiticus

mannitolo (-) bez zmiany barwy

Staphylococcus epidermidis (czewone zab.)

PODŁOŻE MC CONKEYA - wybiórczo-różnicujące dla pałeczek G(-) z rodziny Enterobacteriaceae

Czynnik wybiórczy: sole kw. żółciowych

Czynnik różnicujący laktoza

fermentujące laktoze - ciemnoróżowe

nie fermentujące laktozy - biało-przezroczyste

PODŁOŻE SABOURAUDA - grzyby

- 4% glukoza

- chloramfenikol, cykloheksymid - hamuje rozwój bakterii

PODŁOŻE TIOGLlKOLANOWE- tioglikan sodu, 0,5%agar

- płynne - namnażająco-różnicające

- wykrycie beztlenowców, hodowla Clostridium

- błękit metylenowy, wskaźnik tlenowości

- wśród beztlenowców przechodzi w postać zredukowaną - bezbarwną

9.Antybiogram-metoda dyfuzyjno-krążkowa, wypisanie i interpretacja wyniku. Mechanizmy oporności- MRSA, ESBL, MLS_B, HLAR.

⇒ Krążki bibułowe nasycone antybiotykiem w stęż. jakie osiąga w surowicy

⇒ Określenie wrażliwości bakterii na antybiotyki

⇒ Racjonalna chemioterapia

⇒ Podłoże specjalne do antybiogramu Mueller-Hillton agar

- odpowiednia grubość, gęstość bakt. 0,5 w skali McFarlanda.

-24 h.

MRSA - metycylino oporne S. aureus

- oporne na wszystkie β-Iaktamy

- oporność przekazywana chromosomalnie (gen MEC A)

- test z oksacyliną

MRCNS - metycylino oporne gronkowce koagulazo (-)

MSCNS - metycylino wrażliwe gronkowce koagulazo (-)

MSSA - meticilin sensitive Staph. aureus

MRSE - metycylino oporne S. epidermidis

VISA - wankomycyno średnio wrażliwe S.aureus

VR CNS - wankomycyno oporne gronkowce koagulozo (-)

ESBL - G(-), pałeczki ( E.coli, Klebsiella) β-laktamazy o rozszerzonym spektrum

Test 3 krążków, zniekształcenie strefy wzrostu, nie stosujemy penicylin i cefalosporyn

0.5 w skali McFarlanda

HLAR - wysokiego stopnia oporność na aminoglikozydy,

Enterokoki są wrażliwe na wysokie stęż. aminoglikozydów i β-Iaktamów, NIE wolno ich stosować w szczepach HLAR

Gentamecyna 120, streptomycyna 300

MLSβ - gronkowce, paciorkowce β-hemolizujące gr. A

- makrolidy, linkozamidy, streptograminaB B

- zmiana miejsca docelowego podjednostki 50S rybosomu

- krążek z klindamycyną (Dalacin) i erytromycyną - charakterystyczne ścięcie strefy zahamowania wzrostu wokół Dalacinu

- oporność indukowana, geny metylazowe rRNA (oporność na erytromycynę, koregulacyjne plazmidy i transpozony).

MECHANIZMY OPORNOŚCI

MRSA jak wyżej, oporność przechowywana chromosomalnie - gen hccA - nowe białko PBP 2a; oporność na wszystkie β laktamy

alternatywa: makrolidy, klindamycyna, cefaIosporny I gen., fluorochinolony, klotrimazol, kw. fusydowy, mupirocyna

MLSβ - zmiana miejsca działania docelowego podjednostki rybosomu 50S

ESBL - pałeczki G(-) o rozszerzonym spektrum β-laktamaz (Enterobacteriaceae - naturalna oporność na penicylinę G i penicyliny izoksazolinowe),

- mutacje klasycznych TEM 1, TEM 2, SHV 1, chromosomalne, plazmidowe

- test 3 krążków, nie stosujemy penicyliny i cefalosporyn

10.E-test -interpretacja.

E-test jest to metoda dyfuzyjna przy użyciu pasków bibułowych nasyconych antybiotykiem w gradiencie stężeń. Badanie wygodne i proste, ale drogie.

11.Kontrola procesu sterylizacji-odczyt posiewu Sporali i interpretacja.

Odczyt posiewu Sporali i interpretacja.

Proces sterylizacji powinien być regularnie monitorowany wskaźnikami fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi.

Fizyczne: termometry, manometry mierzą punktowo dany parametr fizyczny, powinny być okresowo sprawdzane i kalibrowane.

Chemiczne: zawierają substancje, które po osiągnięciu wymaganych parametrów sterylizacji zmieniają barwę (rurka Browna)

Biologiczne: spory wyselekcjonowanych szczepów bakterii wysoce opornych na dany czynnik sterylizujący. Negatywny wynik posiewu, odczytany po okresie inkubacji, informuje nas o fakcie zabicia drobnoustrojów i daje gwarancję uzyskania sterylności materiałów.

Sporal A - do autoklawu, Attest

zawiera przetrwalniki Bacillus stearothermophilus 10⁷

Sporal S - sterylizacja na suche powietrze, sterylizatory

zawiera przetrwalniki Bacillus subtilis 10⁷

12.Różnicowanie gronkowców, lekooporność.

Gronkowce koagulazo(+):

1 - Staphylococcus aureus

2 - Staphylococcus intermedius

3 - Staphylococcus hyicus, schleiferi

Gronkowce koagulazo(-) CNS:

- oporne na nowobiocynę:

Staphylococcus saprophyticus

Staphylococcus xsylosus

-wrażliwe na nowobiocynę:

Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus haemoliticus,

Staphylococcus hominis ,capitis

Wszystkie MANNITOLO(+) Podłoże CHAPMANA

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

- mannitolo(+) zmiana podłoża na żółte

-katalazo(+), koagulazo(+)-dodatnia reakcja CF(+)-koagulaza związana, fermentuje mannitol, glukozę, wytwarza barwnik kremowo-żółty

⇒ Zespół wstrząsu toksycznego, egzotoksyna TSS -1

⇒ Koagulaza chroni przed fagocytozą, opłaszcza neutrofile, fibryna ścina osocze

⇒ Nukleaza, DNAza w obecności aktywatora koagulazy

lipaza,

⇒ stafylokinaza-aktywność fibrynolityczna, plazmina

⇒ clamping factor, CF - „koagulaza związana”, ścina fibrynogen bez udziału aktywatora koagulazy, uczestniczy w osłonie gronkowców przed leukocytami i przeciwbakteryjnymi czynnikami zawartymi w surowicy

პ Test -surowica królika + zawiesina badanego szczepu, kłaczki w ciągu 30 sek.

Toksyny S. aureus

Enterotoksyny A, B, C1, C2, D, E, F - powodują zatrucia pokarmowe
Hemolizyny α, β, γ - wywołują lizę erytrocytów
Koagulaza - powoduje aktywację kaskady krzepnięcia krwi.
Eksfoliatyna (toksyna epidernonekrotyczna)- działa na warstwę ziarnistą naskórka powodując jej łuszczenie
Leukocydyna - uszkadza leukocyty, głównie granulocyty i makrofagi
Czynnik CF - ścina fibrynogen

Hialuronidaza - ułatwia wnikanie i rozprzestrzenianie się gronkowców
fibrynolizyna - rozpuszczanie skrzepu i rozprzestrzenianie się procesu chorobowego
Penicylinaza - warunkuje oporność gronkowców na penicylinę.

STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS - oporny na nowobiocynę

პ zakażenia dróg moczowo-płciowych

პ tropizm tkankowy do błony śluzowej nabłonka dróg moczowych

პ kwas lipotejchoiowy LPA - ściana kom., białka wiążące fibronektynę, hemaglutynina, aglutynacja krwinki baraniej

პ ureaza uszkadza kom. nabłonka dróg moczowych

პ koagulazo(+)

STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS - nowobiocyno wrażliwy

პ pacjenci hospitalizowani: krew, płyn mózg.-rdzeń., mocz, plwocina

პ bakteriemia, posocznica, zakażenie wsierdzia, ran, dróg oddechowych, kości, szpiku, opon mózg.-rdzeń.

პ zakaż. polimerów: lipopolisacharyd w błonie komórkowej

პ adhezyny, hemaglutyniny, otoczki, peptydoglikany, kw. tejchojowy, ureaza, proteaza,

hemolizyny, DNAzy

RÓŻNICOWANIE I DIAGNOSTYKA - typowa wydzielina ropna, barwią się G(+), gronka

A.PODŁOŻA

* agar zwykły

*Chapmann - wybiórczo różnicujące dla gronkowców

7 % NaCI - rosną tylko gronkowce

mannitol-różnicowanie gronkowców na:

MANNITOLO(+): zmiana zabarwienia na żółte - S.aureus, S.saprophyticus- czasami

II. MANNITOLO(-): nie ma zmiany zabarwienia - S.epidermitidis

Wskaźnik - CZERWIEŃ FENOLOWA

B.TEST KATALAZY

Z odpowiednio procentowym PERHYDROLEM

katalazo(+) katalazo(-)

C.TEST KOAGULAZY:

*koagulazo (+) S.aureus

*enzym mający zdolność ścinania plazmy króliczej

D.TEST CF

*związana koagulaza

*plazma królicza+ zawiesina z gronkowców natychmiastowa kłaczki po 30 sek.

E.TEST DNAzy

*agar na płytce zawiera DNA

*enzym DNAza rozrywa nici DNA, przejaśnienia wokół gronkowców

STAPH AUREUS, dodatni test DNAzy

F.Antybiogram: podłoże Mueller-Hintona:

PSSA - 5-10%, PRSA - 90%, MSSA - 0%, MRSA - 0%

Typowanie fagowe, serologiczne, biochemiczne API; Typowanie fagowe - infekujemy badane szczepy fagami - „mapy fagowe”

13.Różnicowanie paciorkowców, lekooporność.

Podstawą diagnostyczną jest typ hemolizy.

Gram(+), katalazo(-), gr.serologiczne A, B, C. Klasyczny podział na grupy serologiczne uwzględnia różnice węglowodanów (wielocukier C) wchodzących w skład ściany komórkowej paciorkowców.

Podział praktyczny:

paciorkowce ropotwórcze
paciorkowce jamy ustnej (zieleniejące, viridans)
paciorkowce wybredne

Ad.a) PACIORKOWCE ROPOTWÓRCZE -STREPTOCOCCUS PYOGENES

- całkowita hemoliza

- zap.gardła, migdałków, płonica, róża, cellulitis, zap.kosci, stawów

- GAS - grupa A streptococcus

- hemoliza β na podłożu z krwią baranią wywołana przez streptolizynę S (hemolizyna), nie ma właściwości antygenowych

STREPTOLIZYNY

*powodują powstanie swoistych przeciwciał antystreptolizyn, ASO,

które ją unieczynniają.

*streptolizyna O: aktywna w stanie zredukowanym; powoduje hemolizę na podłożu agarowym

*toksyna erytrogenna: -wysypka płonicza,

-właściwości antygenowe

-wstrząs toksyczny ---A - SPE A

-niszczenie tkanek, zap.powięzi---B - SPE B

-toksyny pirogenne ropotwórcze---C - SPE C

*Streptodornaza - DNA-za

*Hialuronidaza

*Streptokinaza - fibrynolizyna

Antygeny S. pyogenes:

- grupowo swoisty antygen A, polisacharyd błony kom.

- typowo swoisty antygen białkowy typu M, ciepłostabilny, pow. kom. i w ścianie, różne serotypy, główny czynnik zjadliwości S.pyogenes - oporne na fagocytozę (obniżenie aktywności dopełniacza na drodze alternatywnej), szybko namnażają się we krwi ludzkiej

*zakażenia ropne

*róża, płonica

*paciorkowcowy zespół podobny do wstrząsu toksycznego: STSL, SPE A

*nabyta oporność na makrolidy

STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

*grupa B

*bakteriemia, zap. płuc i opon mózg.-rdzeń.

*GBS

*β hemoliza

*mikroflora: gardło, pochwa, kał

*zakażenia okołoporodowe: infekcje ukł. moczowego, zap. pochwy

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

*grupa C

*α HEMOLIZA

*jama ustna, gardło, tchawica

*otoczka polisacharydowa

*brak antygenu grupowego C (polisacharyd)

*płatowe zap. płuc, ucha środkowego, zatok, posocznice, otrzewnej, oskrzeli, zap. opon m-r.

Ad.b) PACIORKOWCE ZIELENIEJĄCE, GRUPA VIRIDANS

*Str. mutans (próchnica, zap. wsierdzia)

*Str. salivarius

*Str. oralis, intermedius, anginosus, mitis, sanguis - ropnie narządowe, wsierdzie

*paciorkowce jamy ustnej

*hemoliza α

RÓŻNICOWANIE:

-nie wyrosną na podłożach bez krwi

-agar z krwią.

- hemoliza:

α - zieleniejące - S. pneumoniae, mitis, oralis, sanguis, większość komensali jamy ustnej

β - całkowita, ropotwórcze - S. pyogenes (A), agalacticae (B)

γ - brak hemolizy, zwykle komensale - S. salivarius, mutans

HEMOLIZA β - całkowita, bardzo niebezpieczne i chorobotwórcze paciorkowce, serotypy A,B,C,G

- GAS --- Str. pyogenes: wrażliwe na bacytracynę

- GBS --- Str. agalactiae: oporne na bacytracynę

HEMOLIZA α - podłoże zielenieje

- Str. pneumoniae - wrażliwe na optochinę, otoczki,

- Str. viridans - oporne na optochinę

TEST ASO - ilościowy odczyn oznaczania przeciwciał w surowicy osób po zakażeniu paciorkowcowym, oznaczanie stężenia streptolizyny.

Streptolizyna O + antystreptolizyna = zahamowanie hemolizy

200 - przebyte zakażenie

600 - zap. kłębuszków nerkowych, reumatyczne, autoimmunologiczne.

METODY Z UŻYCIEM LATEKSU: na lateksie opłaszczona streptolizyna + antystreptolizyna = aglutynacja lateksowa.

STREPTOKIT:

- podział paciorkowców β-hemolizujących na grupy

- zawiesina w enzymie, enzym uwidacznia poszczególny polisacharyd

- nakrapla się na specjalne płytki z surowicami anty-A, anty- B, anty-C, anty-D

TESTY API

- szeregi biochemiczne.

- streptokoki, stafylokoki, enterokoki

14.Różnicowanie pałeczek Gram(-), lekooporność.

TLENOWE:

→ Enterobacteriaceae: E. coli, Klebsiella, Serratia, Proteus, Citrobacter, Salmonella, Shigella

→ Haemophilus

→ Legionella

→ niefermentujące: P. aeruginosa, Acinetobacter

BEZTLENOWE:

→ Bacteroides

→ Prevotella

→ Porphyromonas

→ Fusobacterium

Enterobacteriaceae:

⇒ - zakażenia p. pokarmowego, zatrucia pokarmowe

⇒ - zakażenie dróg moczowych, oddechowych

⇒ - bakteriemie, posocznice, zap. opon mózgowo - rdzeniowych

⇒ - ukł. kostno-stawowego

⇒ - zak. oportunistyczne

E.coli

- symbiont, rozkłada pokarmy, wytwarza wit. B, K,

- serotypy na podstawie zróżnicowanej budowy

- antygenu somatycznego O (LPS)

- antygenów rzęskowych H

- polisacharydowych antygenów otoczkowych K

- wrażliwości na bakteriofagi

-Fimbrie:

MR - mannose resistant (mannozooporne)

MS - mannose sensitive (po dodaniu mannozy aktywność autoregulacji hamowana)

-Toksyny: - polischarydowa LPS

10 -18h- ciepłochwiejne enterotoksyny LT - biegunka sekrecyjna

6h - ciepłostabilne enterotoksyny - biegunka sekrecyjna

- toksyny podobne do toksyny SHIGA (to ta u S.typhi) - SLT

- urotoksyny UT

- wykazywanie toksyn: na zwierzętach laboratoryjnych, hodowle tkankowe, metody serologiczne

- enteritis, gastroenterocolitis

⇒ ETEC - enterotoksyczne - enterotoksyny LT i/lub ST , biegunka sekrecyjna, niemowlęta, dzieci, podróżni, 16-72h,

⇒ EPEC - enteropatogenne - właściwości adhezyjne (fimbrie), biegunki u dzieci i niemowląt,

⇒ EIEC - enteroinwazyjne - neutrofile, śluz, krew w kale, penetracja kom. nabł. jelitowego, biegunka zapalna, 16 - 36h,

⇒ EHEC - enterokrwotoczne - ureotoksyny, krwotoczne zap. jelita grubego, zespół hemolityczno-mocznikowy, krwawa biegunka,

⇒ EAEC - enteroadherentne - przewlekłe biegunki u niemowląt - do 2 tyg., biegunki krwotoczne, verotoksyny (=verocytotoksyny), zespół hemolityczno-mocznicowy

Shigella

⇒ Pałeczki G(-), bezrzęse, mało aktywne biochemicznie

podgrupy serologiczne:

S. dysenteriae A

S. flexneri B

S. boydli C

S. sonnei D

⇒ Testy serologiczne LA, test aglutynacji szkiełkowej z surowicami odpornościowymi A, B, C, D

⇒ Swoiste zakażenie jelit

⇒ Tropizm do jelit, nie wnika do układu limfatycznego, krwi i innych narządów

⇒ Może być komesalizm, nosicielstwo

⇒ S. dysenteriae - toksyna Shiga, najbardziej zjadliwy serotyp

Salmonella

Ruchome, laktozo(-), maloniano(+), H₂S (+), indolo(-), rosną na podłożu Simmonsa

⇒ Typowanie biochemiczne

⇒ Typowanie serologiczne:

antygen somatyczny O antygen rzęskowy H

⇒ Krew, mocz, kał

⇒ S. typhi, gr. serologiczna D, dur brzuszny

⇒ S. paratyphi gr. A, B, C, dury rzekome - gastroenteritis, biegunka podróżnych, gorączka jelitowa

⇒ S. enteritidis - salmonellozy, biegunka, zap. jelita cienkiego, zatrucia pokarmowe

⇒ S. typhimurium, S.dublin, S.bovis, S.heidenberg

⇒ S. choleresuis - bakteriema, posocznica.

⇒ Kolonizacja, nosicielstwo

Klebsiella

⇒ Hydroliza mocznika

⇒ Otoczki, śluzowe kolonie ESBL(+)

⇒ K. pneumoniae - zap. płuc, alkoholicy, narkomani, starsze osoby, meningitidis: niemowlęta; zap.dróg mocz.-płciow. - dzieci

⇒ K. oxytoca - zakażenia oportunistyczne

⇒ K. rhinoskleromatis - twardziel (drogi oddechowe)

⇒ K. ozenae - cuchnący nieżyt nosa, rzadko

Proteus

⇒ H₂S (+) ,MR(+), VP(-), phe(+), w KCN(+), ureazo(+)

⇒ Mirabilis - inodolo(-): zakażenie dróg moczowych

⇒ Vulgaris - inodolo(+): amoniak-alkalizacja, odkładanie soli wapnia i magnezu, kamienie

Providencia, Morganella, Serratia, Citrobacter, Enterobacter - mogą zakażać oportunistycznie, szpitalne szczepy oporne, ESBL, AmpC, inne β-laktamazy

Pałeczki G(-) niefermentujące, bardzo małe wymagania, tlenowe

⇒ Zakaż.oportunistyczne: drogi moczowe, oddechowe (cewniki, rurki), bakteriemie, rany, oparzenia, spojówki oka

⇒ Pseudomonas aureginosa - ucho pływaka, śluz, otoczka alginaniowa, egzotoksyna A, enterotoksyna, hemolizyny, fosfolipaza

⇒ Acinetobacter - A. baumanii, A. lirofii, A. calcoacetinus

Wzory oporności na antybiotyki

DIAGNOSTYKA:

⇒ Hodowla: podłoża McConkeya - 24h

* laktozo(+) - różowe E.coli (wybiórczo-różnicujące)

* laktozo(-) - jasne-Salmonella, Shigella

*sole kwasów żołciowych - wybiórczo-namnażające

⇒ Wstępna identyfikacja, testy biochemiczne-API 20ε, API ID 32ε

⇒ Testy serologiczne-różnicowanie:

*polisacharydowych antygenów otoczkowych K

-Shigella - podgrupy serologiczne A, B, C, D

-Salmonella - grupy serologiczne A, B, C, D

Dodaje się odpowiednie surowice wzorcowe, test aglutynacji szkiełkowej i lateksowej

⇒ Podłoża dla Salmonella, Shigella

*SS - czarne kępki Salmonella

Wilson-Blair zdejmujemy kolonie, czarna plama

*SP - płynne, selenian sodu (tam florę fizjologiczną, wybiórczo-namnażające dla Salmonella i Shigella)

Diagnostyka durów

⇒ Salmonella typhi

⇒ Choroba uogólniona

⇒ We krwi szukamy bakterii, ok. 3 dnia posiew krwi -przewód pokarmowy, próbka moczu

⇒ Krótki test biochemiczny

Inodolo(+) odczyn Eichnera = różowy krążek

Malonian: (+)granatowy (-)zielony

Indolo(+), malonian(-) - E. coli

Indolo(-), malonian(+) - Klebsiella, Salmonella

Odczyn WIDALA

*krew, ślina, BAL, mocz, płyn z opłucnej

*krew krzepnie, wirujemy

*dla antygenu rzęskowego - aglutynacja obłoczkowa

*dla antygenu somatycznego - aglutynacja grudkowa

Pałeczki G(-) - oksydazo(+), zakrzywione, ruchome, przecinkowce

Vibrio cholerae

⇒ Cholera epidemiczna, pandemiczna

⇒ Grupa serologiczna 01

⇒ Gastroenteritis: *zespoły biegunkowe, enterotoksyny i aktywność cyklazy adenylowej

*objawy po 15 -30min do 1h

*odwodnienie, kwasica metaboliczna, hipokaliemia

*hemolizyny I i II

⇒ posiewy:

agar z krwią, 1 % NaCI

podłoże wybiórcze TCBS

optymalne pH 8,6 - 9

⇒ testy biochemiczne

Helicobacter pylori

⇒ kolonizuje odźwiernik

⇒ przewlekłe zapalenie żołądka i dwunastnicy

⇒ szczepy cagA(+), bardzo toksyczne - rak żołądka, Iymphoma

⇒ ureazo(+)

⇒ szybka diagnostyka test ureazowy z bioptatu

⇒ przeciwciała w surowicy IgG, IgA - Elisa, Western blot

15.Lekooporność prątków gruźlicy-interpretacja wyniku.

Zasady leczenia gruźlicy są uwarunkowane swoistymi właściwościami prątków i różnią się od sposobu leczenia większości infekcji bakteryjnych. Prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis) są bezwzględnymi tlenowcami, mają wolny metabolizm, dzielą się najwyżej raz na 10 h - leki działają tylko na bakterie aktywne metabolicznie. Prątki w organizmie człowieka tworzą 3 populacje:

liczna populacja prątków dzielących się w lekko zasadowym lub obojętnym środowisku zewnątrzkomórkowym - poza makrofagami, przy dobrym dostępie tlenu: izoniazyd, streptomycyna, ryfampicyna.
mniej liczna populacja wolniej dzielących się prątków wewnątrz makrofagów, o podziałach zahamowanych przez kwaśne środowisko wnętrza komórki, zabijana głównie przez pyrazynamid (?) działający tylko w pH 5,3 - 5,5, ale także przez ryfampicynę i izoniazyd. Streptomycyna i inne aminoglikozydy tracą aktywność.
prątki zamknięte w masach serowatych, dzielą się rzadko, z wielotygodniowymi przerwami. Tu działa tylko ryfampicyna.

Charakterystyka:

⇒ Mycobacterium tuberculosis, Gram(+), kwasooporne, pasożyt wewnątrzkomórkowy

⇒ Gruźlica płucna

⇒ Do kompleksu tuberculosis zalicza się: M. tuberculosis, bovis, bovis BCG, africanum, necroti

⇒ Barwienie, Ziehl-Neelsena: prątki wybarwiają się na czerwono

⇒ Podłoża:

* Lowenstein-Jensena - podłoże jajowe

*selektywne z kwasem oleinowym

*37 stopni, 12-25 dni do 7 tygodni, tlenowe

⇒ Leczenie:

I rzut - izoniazyd, rifampicyna, parazynamid, etambutol, streptomycyna

II rzut - etionamid, cykloseryna, kopreomycyna, fluorochinolony

Zasady leczenia:

długotrwałe - jeśli ma doprowadzić do eradykacji,

skojarzone - co najmniej dwa preparaty, ponieważ istnieje pierwotna oporność prątków na leki, dotyczy ona najczęściej izoniazydu i streptomycyny; po 3 miesiącach podawania samego izoniazydu ok. 71% prątków wykazuje niewrażliwość na ten lek, zatem NIGDY nie leczymy gruźlicy w monoterapii!!

16.Odczyt odczynu Widala.

⇒ Określenie - miana p/ciał, w surowicy

⇒ Aglutynacja

⇒ Diagnostyka duru

Odczyn aglutynacji (test ilościowy do określenia mian przeciwciał w surowicy)

Dur brzuszny (S. typhi)
Dury rzekome (S. paratyphi A,B lub C)
Salmonelozy i inne choroby wywołane przez pałeczki Gram(-) z rodziny Enterobacteriaceae

17.Diagnostyka biegunek: wirusowe, bakteryjne, toksyny.

Biegunka to wydalanie ponad 200g kału na dobę

Obfita biegunka wodnista (wydzielnicza)-egzotoksyny lub wirusowe zakażenie błony śluzowej jelita
Biegunka krwawa-zawiera śluz i ropę, kurczowe bóle brzucha, bolesne parcie, cytotoksyny lub inwazja błony śluzowej przez bakterie lub pasożyty

Bakterie nieinwazyjne:

Vibrio cholerae
E.coli (ETEC, EHEC)
Shigella dysenteriae typu 1 (pałeczka czerwonki)
Clostridium perfrigens
Clostridium difficile
Vibrio parahaemolyticus
S.aureus

Enterotoksyny:

Toksyna cholery

Cytotoksyny:

Toksyna Shiga
Verotoksyna E.coli
Toksyna C.difficile

Drobnoustroje inwazyjne (penetrują nabłonek jelitowy, indukują ostrą reakcję zapalną):

Salmonella enteritidis
Shigella
Yersinia enterocolitica

Diagnostyka laboratoryjna:

Próbka stolca
Biopsja jelit (gdy podejrzewa się biegunkę inwazyjną)
Posiewy krwi (gdy występują objawy ogólnoustrojowe)
Test immunoenzymatyczny (EIA) (pozwala na identyfikację czynników wirusowych lub egzotoksyn)

18.Serotypowanie E.coli.

Escherichia coli -symbiont jelita grubego

EPEC- enteropatogenne, fimbrie adhezyjne, biegunki u niemowląt i dzieci do lat 2 (serotypy 026, 055, 0111)
ETEC- enterotoksyczne, enterotoksyny ciepłostałe i ciepłochwiejne, biegunki podróżnych (serotypy 06, 078)
EHEC- enterokrwotoczne, verotoksyny, biegunka krwotoczna, zespół hemolityczno-mocznicowy (serotypy 0157, H7) zakażone mięso, hamburgery
EIEC- enteroinwazyjne, biegunki
EAEC- enteroagrekacyjne, biegunki przewlekłe (ponad 2 tyg.) u niemowląt
Zap. dróg moczowych- specjalne fimbrie adhezyjne P i antygeny O
Zap. opon m-r u noworodków- szczepy K1 (otoczka)
Zakażenia szpitalne-statystycznie najczęstszy czynnik.

19.Interpretacja posiewu moczu i antybiogramu.

Cz. Etiologiczne

- E.coli

- St. Saprophyticus (rzadko) - młode kobiety

- Proteus, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, Enterobacter, Providencia, Pseudomonas, Acinetobacter

- gronkowce, paciorkowce, enterokoki

- NIE!!! - S. aureus, chyba, że zakażenie jest zstępujące (krwiopochodne).

- mocz alkaliczny pH>7, kamica

W zakażeniach najczęściej jeden gatunek bakterii. Przy większej ilości gatunków lub u dzieci bakterurię diagnozuje się już przy niższym rzędzie wielkości!! (10³, 10⁴).

Posiew ilościowy - ezą kalibrowaną; jakościowy - na agar krwawy i McConkeya

Leczenie:

I rzut: kotrimoksazol = sulfmetaksazol + trimetoprim

Nitrofurantoina = pochodna nitrofuranu

Norfloksacyna = fluorochinolony

Antybiogram: szczepy ESBL; wykonujemy dla mężczyzn, dzieci, kobiet w ciąży, kobiet z nawracającymi zakażeniami.

Oznaczamy ilość komórek bakterii w 1 ml moczu. Bakteruria: 10⁵ jednego gatunku bakterii.

20.Ocena preparatu-stopień czystości pochwy.

Preparat bezpośredni barwiony metodą Grama oglądany pod immersją.

Lactobacillus- wykładnik czystości pochwy
Inne bakterie (ziarniaki Gram(+), paciorkowce, maczugowce, pałeczki Gram(-), Gardnerella, Mobiluncus („clue cells”), Neisseria gonorrhoeae, ale nie Chlamydia-nie widać w preparacie)
Drożdżaki (blastospory, formy inwazyjne)
Trichomonas vaginalis (preparat w kropli soli)
Leukocyty (wskaźnik stanu zapalnego, fagocytoza)

	I	II	III	IV	IV	IV
Lactobacillus	+++	+	-	-	-	-
Inne bakterie	-	+	+++	++	+++	+++(wewn. leukocytów)
Drożdżaki	-	+	-	++	+	-
Trichomonas vaginalis	-	-	-	-	++	-
Nabłonki	++	+	++	+	++	+
Leukocyty	-	+	+	++	++	+++
	FIZJOLOGIA		PATOLOGIA

21.Diagnostyka drożdżycy-preparat bezpośredni, hodowla, test filamentacji.

Candida albicans

⇒ Preparat bezpośredni: barwienie metoda Grama- Gram(+), formy inwazyjne

⇒ Test filamentacji = kiełkowania - szybki test w celu określenia zdolności do tworzenia form plemnikopodobnych z kom. drożdżowej

*po 1-3h inkubacji z surowicą króliczą lub ludzką

*tylko dla C.albicans tworzą się po 2 h

*szybka identyfikacja C.albicans

⇒ Hodowla: podłoże Sabourauda, wilgotne błyszczące kolonie o szarobiałym zabarwieniu

⇒ Leki: Polieny: nystatyna, natamycyna,

Gryzeofulwina,

Azole,

22.Interpretacja wyników posiewów z dróg oddechowych.

Zakażenia górnych dróg oddechowych

*ostre zapalenie gardła i migdałków:. Streptococcus pyogenes. Haemophilus influenzae. Moraxella catarrhalis. Streptococcus pneumoniae. Candida albicans

*zapalenie nagłośni: . H. influenzae

*zapalenie ucha środkowego: Str. pneumoniae. H influenzae

*zapalenie zatok: . Str. pneumoniae, . H. influenzae

*ostre zapalenie błony śluz. nosa:. H. influenzae

Zakażenia dolnych dróg oddechowych

*wrodzone przezłożyskowe:. Listeria monocytogenes, . Treponema pallidum

*pierwotne zapal. płuc u dzieci:. Str. pneumonie, . H.influenzae, . S. pyogenes

*pierwotne zapalenie oskrzeli u dzieci:. Bordetella pertussis i parapertussis, . Str.pneumoniae, . Moraxella catarrhalis. Hemofilius influenzae

*przewlekłe: . H.influenzae, . Str.pneumonie, . M.catarrhalis--pseudostrzępki, pseudomycelium (inozytolo(+))

23.Dochodzenie epidemiologiczne-typowanie bakteriofagami, interpretacja PFGE.

⇒ Typowanie bakteriofagami

⇒ PFGE - kariotypowanie, typowanie genetyczne.

*analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

*elektroforeza pulsacyjna

bakteriofagi:

*łagodny-lizogennie

*Iityczny-pękanie kom. bakteryjnej; wyjałowienie pożywki -przejaśnienie

Opracowanie standardowych zestawów typów fagowych, swoistych dla określonych bakterii.

DIAGNOSTYKA BIEGUNEK

-droga fekalno - oralna / droga pokarmowa

⇒ Bakterie: *płyny i elektrolity

*toksyny: Vibrio cholerae, ETEC, EHEC, S. dysenterie, Clostridium difficile, Clostridium perfrigens

*inwazja błony

⇒ Próbki stolca: wodnista biegunka / inkubacja, czas trwania, bóle brzucha, wymioty, gangrena

⇒ Biopsja jelit - biegunka inwazyjna

⇒ Posiew krwi - objawy ogólnoustrojowe

⇒ Test immunoenzymatyczny - EIA - wirusy (antygeny w kale) / egzotoksyny.

24.Diagnostyka laboratoryjna kiły i rzeżączki-ocena preparatu bezpośredniego i odczynu FTA-ABS.

KIŁA- Treponema pallidum

Preparat bezpośredni- niebarwiony- ciemne pola widzenia (nie barwią się metodą Grama)
Hodowla- nie rosną na podłożach, pasaże na jądrach króliczych, przeżywają bez namnażania na podłożu Nelsona (albuminy)
Serologia- przeciwciała powstają od 6 tyg.
Odczyny nieswoiste (klasyczne)
VDRL, USR (kłaczkujące)- obecnie skryning
Kiedyś Wassermana, Kolmera - OWD
Odczyny swoiste (nowoczesne)
FTA, FTA-ABS -weryfikacja
Odczyn immobilizacji Nelsona-Meyera (unieruchomienie żywych krętków w obecności dopełniacz)

RZEŻĄCZKA- Neisseria gonorrhoeae

Preparat bezpośredni- metoda Grama, Lofflera
Wykrycie antygenu w rozmazie- PCR, IF, Elisa
Hodowla- 24-48h w 5-10% CO₂
Identyfikacja- oksydaza(+), testy biochemiczne, serologiczne, PCR
Odczyny serologiczne-poziom przeciwciał w surowicy (zakażenie przewlekłe)

25.Diagnostyka laboratoryjna zakażeń wywołanych przez Chlamydiae.

Gatunki patogenne:

Chlamydiae psittaci
Chlamydiae trachomatis
Chlamydiae pneumoniae

Bezwzględnie wewnątrzkomórkowe bakterie

Diagnostyka laboratoryjna

Nie mogą być hodowane na podłożach bakteriologicznych
Rosną w hodowlach komórkowych

Po 48-72h inkubacji hodowle komórkowe barwi się przeciwciałami fluoryzującymi (które mogą być swoiste dla rodzaju lub gatunku) lub jodyną (która pozwala wykryć tylko C.trachomatis). Identyfikacja opiera się na wykryciu obecności ciałek wtrętowych.

Ciałka wtrętowe, które łączą się z przeciwciałami swoistymi dla rodzaju Chlamydia i przeciwciałami przeciwko C.trachomatis, świadczą o zakażeniu C.trachomatis.
Ciałka wtrętowe, które łączą się z przeciwciałami przeciwko rodzajowi Chlamydia, ale nie z przeciwciałami przeciwko C.trachomatis, świadczą o zakażeniu albo C.psittaci, albo C.pneumoniae

1.Zasady pobierania i transportu materiałów np.: krew, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy.

2.Pobieranie materiałów-przydatność poszczególnych zestawów: wymaz, podłoże transportowe, podłoże transportowo-wzrostowe.

3.Barwienie metodą Grama-wykonanie preparatu, zabarwienie, nastawienie, interpretacja.

4.Ocena preparatów w mikroskopie świetlnym (preparaty barwione metodą Ziehl-Neelsena-1, Grama-2)

5.Kolejne etapy diagnostyki mikrobiologicznej: schemat badania materiałów np. ropa z jamy brzusznej, krew, mocz, plwocina.

6.Testy API -zastosowanie w diagnostyce.

7.Podłoża wzrostowe (ujemne): agar krwawy, podłoże Chapmana, czekoladowe, McConkeya, Saburauda, tioglikolan sodu i ich zastosowanie.

8.Podłoża bakteryjne (dodatnie): krwawy, podłoże Chapmana, czekoladowe, McConkeya, Sabourauda, tioglikolan sodu -ocena morfologii koloni.

9.Antybiogram-metoda dyfuzyjno-krążkowa, wypisanie i interpretacja wyniku. Mechanizmy oporności- MRSA, ESBL, MLS_B, HLAR.