17. OKREŚLANIE LICZEBNOŚCI MIKROORGANIZMÓW W GLEBIE

• Mikroorganizmy są ważnym czynnikiem kształtującym jej żyzność

• Uczestniczą one w procesach rozkładu i przemianach organicznych i mineralnych związków występujących w glebie i w syntezie próchnicy.

• Podstawową analiza jest określenie ilości bakterii, promieniowców i grzybów

• Wykonuje się to przy pomocy metody płytkowej posiewu rozcieńczeń glebowych

• W porównaniu z met. Bezpośredniego liczenia uzyskuje się mniejsze liczebności, ale przy użyciu selektywnych pożywek określamy wielkość różnych grup fizjolog. i taksonomicznych

• Liczebność zależy od typu, rodzaju, wilgotności, temperatury, odczynu gleby, pory roku, uprawy roślin, stosunków powietrznych, nawożenia, rodzaju i dawki.

• Oznaczona metodą posiewu rozcieńczeń glebowych liczba bakterii wynosi kilka kilkadziesiąt milionów, promieniowców kilkaset tys. do kilku mln, grzybów od kilku do kilkuset tys. W 1g gleby

WYKONANIE PREPARATU:

• Bierzemy 10g gleby i umieszczamy ja w suszarce w celu oznaczenia wilgotności i ważymy szalkę z gleba po wysuszeniu (ustalamy masę pustej szalki)

• Do 6 kolbek wlewamy po 90cm3 sterylizowanej wody destylowanej

• Oznaczamy 10-1, 10-2,10-3; 10-4, 10-5, 10-6

• Odważamy 10g gleby i wsypujemy ja do kolbki 10-1 i odstawić na 15 min na wytrząsarkę

• Szalki Petriego oznaczyć dermatografem wpisując na nich w 3 powtórzeniach rodzaj mikroorganizmów wg schematu:

• Bakterie B10-4; B 10-5; B 10-6; Promieniowce P 10-3; P10-4; P 10-5; Grzyby: G10-3; G 10-4

• Po zakończeniu wytrząsania gleby z kolbki stożkowej oznaczonej 10-1 pobrać 10cm3 zawiesiny wody z gleba i przenieść do 10-2, wymieszać, 10-2 przenieść 10cm3 do kolby10-3 i tak aż do 10-6

• Z kolbek 10-4, 10-5, 10-6 pobrać w 3 powtórzeniach po 1cm3 płynu i przenieść do sterylnych szalek oznaczonych: B 10-4; B 10-5; B 10-6;

• Z kolbek 10-3, 10-4, 10-5 pobrać w 3 powtórzeniach po 1cm3 płynu i przenieść do sterylnych szalek oznaczonych: P 10-3; P 10-4; P 10-5;

• Z kolbek 10-3, 10-4 pobrać tak samo tyle, że do G10-3; G 10-4

• Do szalek z B wlać technika sterylna ostudzoną do ok. 45st pożywkę Bunta i Roviry w ilości ok. 15cm3, tak by przykryła dno szalki, następnie wymieszać zawiesiny gleby z pożywką przesuwając szalkę kolistym ruchem po pow. Stołu

• Do szalkę P wlać tą sama techniką pożywkę Cyganowa 1cm3, wymieszać

• Do G tak samo- pożywka Martina

• Szalki Petriego po zastygnięciu umieścić w cieplarce w 20st; ułożone dnem do góry, co zapobiega wysychaniu pożywki

OBLICZENIA

• Do obliczania mikroorganizmów użyć po 1 rozcieńczeniu bakterii, promieniowców i grzybów, wybierając takie, w którym na 1 szalce występuje od 30 do 300 kolonii, dla grzybów ok. 50, szalki z pozostałymi rozcieńczeniami odrzucić ( robimy dużo rozcieńczeń, bo nie wiemy, które bezie prawidłowe)

• Posługując się licznikiem liczymy B, P, G, odwracamy szalkę do góry dnem, pod lup i dermatografem zaznaczamy już te policzone by uniknąć błędu związanego podwójnym liczeniem tego samego

• Wykonać obliczenia i wpisać do tabeli

Liczba B,G,P w 1g świeżej masy gleby Liczba B,G,P w 1g suchej masy gleby

18. IZOLACJA CZYSTYCH SZCZEEPÓW Z GLEBY

• Kolonie są nagromadzonymi w wyniku podziałów i wzrostu skupiskami komórek tego samego gatunku, widocznymi gołym okiem

• W formie typowej powstają na podłożach stałych

• W badaniach mikrobiologicznych posługujemy się czystymi kulturami, takimi hodowlami, gdzie w 1 naczyniu występuje tylko 1 gatunek.

• Można je uzyskać przenosząc sterylnie z kultur mieszanych za pomocą ezy lub igły nieco materiału wybranej kolonii na jałowa pożywkę w szalce lub probówce.

• Czyste kultury mikroorganizmów nazywamy szczepami, np. na pożywce z posiewu glebowego wyhodowano 5 kolonii bakterii należących do 1 gatunku = 5 szczepów wyizolowano

19. WOLNOŻYJĄCE ASYMILATORY AZOTU

• Na terenach nieużytkowanych rolniczo i nienawożonych azotem nie stwierdza się braku azotu u roślin, gdy ubytki azotu (na skutek denitryfikacji) są uzupełniane dzięki wiązaniu azotu atmosferycznego

• Zjawisko występuje w dużej ilości w bilansie azotu również na terenach uprawnych

• Zdolność wiązania azotu posiadają liczne mikroorg: wolnożyjące i symbiotyczne

• Wolnożyjące to heterotroficzne formy bakterii tlenowych: Azotobacteracacae (rodzaj: Azotobacter, Azomonas, Derxia, Beijerincka)

• W glebach o odczynie obojętnym, zasobnych w substancję organiczną występuje Azotobacter chroococcum, charakterystyczny dla gleb strefy miarkowanej, asymilujący wolny azot, hodujemy go na bez azotowej pożywce i tworzy śluzowate kolonie, które starzejąc się dają kolor brązowo- czarny na skutek barwnika podobnego do melaniny

• Komórki Azotobacter mają kształt zaokrąglonej pałeczki o wymiarach 2-5 mikrom, występują w parach albo większych skupiskach, rzadziej pojedynczo, otoczone śluzem i tworzą zoogleję, z czasem otaczają się grubą błoną, przybierając postać cysty

20. SYMBIOTYCZNE ASYMILATORY AZOTU

• Przede wszystkim bakterie brodawkowe z rodzaju Rhizobium współżyjące z różnymi roślinami motylkowymi

• W glebie występują w postaci drobnych, ruchliwych pałeczek, niemających zdolności wiązania azotu i w tej postaci mogą się tam rozwijać bez kontaktu z roślina motylkową.

• Gdy jednak znajda się w strefie korzeniowej odpowiedniej rośliny, dochodzi do wytworzenia układu symbiotycznego, w którym bakterie wiążą azot korzystając z dostarczanych przez roślinę węglowodanów i soli mineralnych

• Wygląd bakterii występujących w brodawkach powstających na korzeniach ma inną formę niż te występujące w glebie. Ulęgają one powiększeniu i zniekształceniu, przybierają postać bakterioidów.

• Rhizobium trifolii - współżyje z koniczyną, inkarnatką, posiada gruszkowate bakterioidy, nabrzmiałe, rzadziej w kształcie litery X lub Y

• Rhizobium leguminosaruim- współżyjące z grochem, wyką, bobikiem, peluszką, soczewicą, posiada bakterioidy o kształcie X i Y, gwiazdkowate lub maczugowate

• Rhizobium meliloti- współżyjące z lucerną, nostrzykiem, posiada bakterioidy maczugowate lub rozwidlone

• Rhizobium lupini- współżyjące z łubinem, seradelą, esparcetą, posiada bakterioidy pałeczkowate, rzadziej rozwidlone

• Rhizobium japonicum- współżyjące z soją, posiada bakterioidy nieco dłuższe niż normalne komórki, cienkie, a tylko wyjątkowo nabrzmiałe i rozwidlone

• Rhizobium phaesoli- współżyje z fasolą, bakterioidy zwykle pałeczkowate, często z wakuolami, rzadko rozwidlone

• W obrębie rodzaju Lupinus brodawki występują w formie nabrzmień ulokowanych na korzeniu głównym, natomiast u pozostałych obserwuje się je zarówno na korzeniu głównym jak i bocznych

• Przy uprawie roślin motylkowatych w praktyce rolniczej zaleca się stosowanie szczepionek bakteryjnych Nitragina, zawierających aktywne, wirulentne szczepy odpowiedniego Rhizobium. Stwarza to gwarancję obecności w glebie bakterii brodawkowych oraz wł. przebiegu symbiozy.

• W 1984 wprowadzono nowa systematykę, opierającą się na szybkości wzrostu szczepów, ich morfologii, a także określaniu stopnia homologii DNA.

Nowe nazwy	Dawne nazwy
Azorhizobium caulinodans	Rhizobium ORS 571
Bradyyrhizobium japonicum	Rhizobium japonicum
Bradyhizobium sp	Rhizobium lupini
Bradyhizobium sp	Rhizobium species
Rhizobium fredii
Rhizobium galeage
Rhizobium leguminosaruim	Rhizobium phaseoli Rhizobium trifolii Rhizobium leguminosarum

21. HYDROLIZA BIAŁEK

• Rozkład białka zaczyna w glebie cykl przemian materii organicznej prowadzącej do uwolnienia mineralnych połączeń N, S i C.

• Proces ten przebiega od wpływem wydzielanych przez mikroorganizmy egzoenzymów proteolitycznych

• Białka są hydrolizowane do peptonów, te do peptydów, a one do aminokwasów

• Do hydrolizy białek zdolne są

• Bakterie tlenowe (Bacillus, Proteusz, Pseudomonas)

• Bakterie beztlenowe (Clostridium)

• Promieniowce

• Grzyby

• Jednym e sposobów określania właściwości proteolitycznych bakterii jest badanie upłynniania przez te organizmy słupka żelatynowego.

• Do probówek wlewamy pożywkę z żelatyną, która powinna zastygnąć w postaci słupka, szczepi badanymi bakteriami, przeprowadza inkubację a następnie przed dokonaniem odczytu wstawia do lodówki.

• Zestalona pożywka po wyjęciu z lodówki świadczy o braku aktywności proteolitycznej szczepu, a upłynniona świadczy o wydzielaniu przez nie Żelatynazy.

22. AMONIFIKACJA

• Drugi po proteolizie etap przemian mikrobiologicznych w cyklu krążenia azotu.

• Wspólna cechą reakcji nazywanych tym mianem jest wydzielanie do środowiska amoniaku, który następnie w postaci soli amonowych bierze udział w dalszych przemianach przy udziale drobnoustrojów lub jest pobierany przez rośliny albo mikroorganizmy (zbiałczanie)

• Przeprowadzają ja bardzo liczne org. Glebowe

• Wynik takiej działalności można zaobserwować w laboratorium przy użyciu płynnych lub stałych pożywek zawierających pepton, do których po wymaganym okresie hodowli dodaje się odczynnika Nesslera.

• Jeżeli w pożywce wydzielany jest amoniak to zabarwia się ona na kolor jasnożółty przez ciemnożółty do brązowego (również strącony osad)

• Intensywność barwy zależy od ilości amoniaku (soli amonowych) wytworzonych przez mikroorganizmy

23. HYDROLIZA MOCZNIKA

• Mocznik wprowadzany jest do gleby jako nawóz lub powstaje w niej w wyniku przemian obornika i gnojówki

• Jego rozkład zachodzi przy udziale urazy (enzym hydrolityczny) i prowadzi do wydzielenia amoniaku, CO2 i H20

• W glebie rozkład mocznika przeprowadzają bakterie mocznikowe (Sarcina ureae)

• Rozkład mocznika bada się na płynnej pożywce wskaźnikowej z czerwienią fenolową

• Żółte zabarwienie świadczy o środowisku kwaśnym (pH=6,8)

• Zabarwienie czerwone (ciemnoróżowe) o odczynie alkalicznym (pH=8,4), takim, jakie towarzyszy wydzielaniu NH3 do podłoża w wyniku hydrolizy mocznika

24. NITRYFIKACJA

• Mikrobiologiczny proces zachodzący w warunkach tlenowych przy udziale bakterii chemolitotroficznych. Przebiega w 2 etapach:

• Pierwszy przy udziale bakterii z grupy Nitroso (Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosobulus)

• Drugi przy udziale bakterii Nitro z rodzaju Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus

• Proces nitryfikacji, przebiegający z wytworzeniem szeregu związków pośrednich,

• NH4 + 1,5 O2 = NO2 + H20 + 63,8 kcal

NO2 + 0,5 O2 = NO3 + 17,5 kcal

• Wydzielana w trakcie reakcji energia jest wykorzystywana przez bakterie w procesie chemosytezy

• Inne cudzożywne bakterie mogą prowadzić ten sam proces w glebie (nitryfikacja heterotroficzna), jednak ich działalność ze względu na wytwarzany azot nie jest wyjaśniona

• Nitryfikacja powoduje wzbogacenie gleby w taka formę azotu, która jest korzystniejsza z punktu widzenia roślin, jednak w okresach mniejszego zapotrzebowania może przyczynić się do jego strat, ze względu na łatwość wymywania azotanów z gleby

• Wykrywanie nitryfikacji polega na zadaniu badanej próby odczynnikami dającymi barwne reakcje w obecności NH3, NO2, NO3

• Jony amonowe wykrywa się odczynnikiem Nesslera

• Przebieg pierwszej fazy obserwować przy pomocy odczynnika Griessa Issolwaya, dającego w obecności azotynw zabarwienie różowe

• Do obserwacji drugiej fazy wykorzystujemy dwufenyloaminę, dającą granatowe zabarwienie w obecności azotanów (zabarwienie jest nietrwałe i zanika)

• Do badania stosuje się płynna mineralną pożywkę, w której N dodawany jest w postaci soli amonowych.

25. DENITRYFIKACJA

• W warunkach beztlenowych, przy dostępie łatwo przyswajalnych zw. Org. powstałe w nitryfikacji lub wprowadzone przez nawożenie azotany ulegają redukcji. - Denitryfikacji.

• Jeżeli produktem redukcji są azotyny, potem sole amonowe, mówimy o denitryfikacji częściowej

• Jeśli produktem końcowym jest gazowa forma azotu - NO i N2- denitryfikacji całkowitej.

• Prowadzi ona do strat azotu z gleby.

• B. denitryfikacyjne nie są wyspecjalizowana gr., reprezentowane przez gat. hetero i autotroficzne

• W przemianach katabolicznych zachodzących w ich komórkach azotany SA wykorzystywane zamiast tlenu, jako akceptor elektronów, odłączonych w procesie utleniania od związków organicznych będących substratami w procesie oddychania.

• Przebieg denitryfikacji bada się na płynnych pożywkach, np. przez obserwacje nagromadzania się gazowych produktów (N20, N2) w rurkach Durhama, umieszczonych dnem do góry w probówkach z pożywka zawierającą azotany i zaszczepioną glebę z kulturami bakterii

26.ROZKŁAD CELULOZY

• Celuloza (błonnik) jest głównym składnikiem ścian komórkowych roślin, polisacharydem składającym się z Beta-D-Glikozy.

• Wraz z resztkami roślin dostaje się ona do gleby i jest tam rozkładana przez mikroorganizmy cellulolityczne: Cytophaga, Sporocythophaga, Pseudomonas, Cellulomonas, Clostridium,

• Promieniowce (Streptomyces i Streptosporangium)

• Oraz grzyby (Trichoderma viride, Chaetomium, Trichocladium)

• Jedna z metod na wykrywanie mikroorganizmów celulolitycznych polega na sprawdzeniu po 4 tyg. Hodowli, trwałości pasków bibuły umieszczonych w probówkach z płynną pożywką, zaszczepioną badaną glebą lub kulturą.

• Paski wyrugowanej i wysterylizowanej bibuły stanowią jedyne źródło węgla dostępne w probówce testowej, bo w skład pożywki wchodzą jedynie sole mineralne niezwierające tego pierwiastka.

• W probówkach dochodzi do rozkładu bibuły, uwidacznia się to jako zmiana zabarwienia pasków, a przede wszystkim ich przerwanie na 2 części, świadczy o obecności mikroflory cellulolityczne

• W miejscu przerwania bibuły może występowa galaretowata masa powstała w wyniku jej rozkładu

• Żółte łososiowate lub ceglaste zabarwienie wywołuje obecność bakterii (zwłaszcza śluzowych z rodzaju Cythophaga)

• Obecność grzybów wskazuje zabarwienie na kolor ciemnobrązowy, ciemnozielony lub czarny

27. HYDROLIZA SKROBII

• Skrobia jest polimerem zbudowanym z cząsteczek glikozy połączonych wiązaniami glikozydowymi.

• Jej hydroliza pod wpływem alfa-amylazy wydzielanej przez mikroorganizmy prowadzi poprzez dekstryny do maltozy

• Mikroorganizmy amylolityczne występują bardzo licznie w glebie i są reprezentowane przez wiele tlenowych i beztlenowych bakterii, promieniowce i grzyby.

• Wokół kolonii takich mikroorg. Po zalaniu pożywki płynem Lugola powstają bezbarwne strefy świadczące o rozkładzie skrobii na skutek wydzielania do podłoża egzoenzymu alfa-amylazy

• W miejscach, w których skrobia nie została rozłożona podłoże ma barwę granatową

28. HYDROLIZA TŁUSZCZU

• Jednym z elementów przemian związków org. W glebie jest rozkład tłuszczów

• Zachodzi on pod wpływem egzoenzymów- lipa, wydzielanych przez mikroorganizmy, w wyniku, czego powstaje glicerolu i kwasy tłuszczowe.

• Takimi właściwościami charakteryzują się zarówno bakterie: Bacillus subtilis i grzyby Pennicilium, Aspergillus

• Badanie obecności org. Lipolitycznych polega na szczepieniu badaną próbką gleby lub też czystą kulturą, podłoży zawierających zemulgowany tłuszcz, a następnie po okresie inkubacji, obserwowaniu wystąpienia przeźroczystych stref.

• W obrębie tych stref tłuszcz został zhydrolizowany, w związku z czym pierwotnie mętna pożywka staje się przeźroczysta

• Szerokość stref jest miarą aktywności lipolitycznej







---