ENZYMOLOGIA

WYKŁAD 1

18.02.2009r.

Literatura:

Ćwiczenia z enzymologii i technik biochemicznych. Bartoszewska, Niziołek, Paszowski, Wydawnictwo SGGW

ENZYMOLOGIA - dziedzina biochemii, która bada budowę, właściwości oraz funkcjonowanie enzymów.

ENZYMY

• z greckiego: en - w, zyme - drożdże, zaczyn,

• są to NATURALNE katalizatory chemiczne, które mają zdolność do przyśpieszania reakcji (10⁶ - 10¹² razy) nie ulegając przy tym przemianie,

• są to wysoce wyspecjalizowane białka proste lub złożone,

• są wysoce specyficzne względem katalizowanej reakcji, jak i substratów reakcji,

• ich aktywność może być regulowana.

Zastosowanie preparatów w technologii żywności umożliwia:

• przyspieszenie procesów technologicznych produkcji żywności,

• pełniejsze i wydajniejsze wykorzystanie surowców,

• podjęcie produkcji nowych półproduktów i produktów żywnościowych,

• zmniejszenie kosztów produkcji żywności,

• przedłużenie trwałości produktów żywnościowych,

• poprawę cech organoleptycznych produktów,

• wykorzystanie produktów ubocznych przemysły spożywczego.

Źródła preparatów enzymatycznych:

• ok. 50% - z grzybów i pleśni

• ok. 30% - z bakterii,

• ok. 8% - ze zwierząt,

• ok. 4% - z roślin.

Pierwszy patent na preparat enzymatyczny otrzymany przy użyciu Aspergillus oryzae otrzymał w 1894 r Japończyk Tokamine na preparat zawierający głównie α-amylazę

Cechy enzymów, które zdecydowały o ich zastosowaniu w technologii żywności:

1. enzymy ze względu na swoją specyficzność mogą prowadzić ściśle określone, wybrane reakcje.

2. enzymy działają bardzo szybko.

3. enzymy działają w bardzo małych ilościach (stężeniach), są bardzo wydajne, przekształcają bardzo duże ilości substratów (np. 1 g krystalicznej podpuszczki może przekształcić 1000 l mleka, ale jest bardzo droga. W praktyce najczęściej stosuje się 1 ml podpuszczki na 50 l mleka).

4. enzymy nie ulegają przemianie w wyniku reakcji chemicznej (teoretycznie nie zużywają się, ale praktycznie w środowisku reakcji znajdują się czynniki destrukcyjne, które denaturują białko enzymatyczne. W wyniku tego zmniejsza się aktywność enzymów, jednak nigdy nie ulegają przemianom).

5. szybkość procesów enzymatycznych można łatwo regulować (temperatura, pH, stężenie enzymu).

6. enzymy działają w łagodnych warunkach pH i temperatury, co obniża koszty produkcji i umożliwia zachowanie w produkcie składników wrażliwych na ostre traktowanie).

7. działanie enzymów można łatwo przerwać (proste sposoby inaktywowacji).

8. wszystkie enzymy są pochodzenia naturalnego - nie są toksyczne, nie posiadają smaku ani zapachu (ale produkty reakcji katalizowanych przez enzymy mogą mieć).

9. preparaty enzymatyczne zachowują aktywność poza komórką - łatwo jest je wyizolować, oczyścić i stosować. Najczęściej są w postaci płynów lub proszków łatwych do stosowania.

Wykorzystanie enzymów w przeszłości

Człowiek jaskiniowy - mięso przechowywane przez kilka dni ma lepszy smak i jest bardziej kruche i miękkie niż bezpośrednio po uboju, wyrób napojów oszałamiających z ziaren i owoców.

Starożytni Egipcjanie i Grecy - wykorzystywali proces fermentacji owoców do produkcji wina i piwa, fermentacji mleka w produkcji serów, znana też była produkcja chleba.

2500 lat p.n.e. - w dokumentach egipskich z okresu Czwartej Dynastii znaleziono opis słodowania jęczmienia i fermentacji piwa.

2300 lat p.n.e. - znane było chińskie piwo ryżowe.

800 lat p.n.e. - wytwarzanie serów podpuszczkowych z wykorzystaniem soku z żołądków młodych jeleni.

1735 r. - zaobserwowano hydrolizę mięsa przez sok żołądkowy.

1835 r. - J. Barzelius: rozkład skrobi do cukrów prostych przez ekstrakty roślinne lub ślinę, mechanizmy odpowiedzialne za te reakcje nie były znane.

1850 r. - I. Pasteur: fermentacja tylko w żyjących komórkach, tam „siła witalna”, którą nazwał fermentem.

1870 r. - W. Kuhne: coś co jest w drożdżach i powoduje fermentację nazwał enzymem (gr. en - w, zyme - drożdże, zaczyn).

1897 r. - E. Buchner: otrzymał ekstrakt z drożdży, który przeprowadził fermentację sacharozy, który nazwał zymazą (fermentacja bez udziału komórek żywych).

1926 r. - J. B. Sumer (?) udowodnił, że enzym ureaza to białko i wyizolował je w formie krystalicznej z nasion konwalii.

1930 r. - enzymy pektynolityczne do klarowania soków owocowych

1940 r. - enzymy amylolityczne do produkcji syropów słodkich

1982 r. (?) - po raz pierwszy enzym otrzymany dzięki zastosowaniu inżynierii genetycznej został wykorzystany w przetwarzaniu żywności - α-amylaza.

19.. r. (?) - pierwsza zrekombinowana chymozyna została wykorzystana do produkcji żywności.

Kierunki wykorzystania preparatów enzymatycznych:

1. Przemysł gorzelniczy

• Amylazy - upłynnianie i scukrzanie skrobi do cukrów fermentujących

• Proteinazy - uwalnianie aminokwasów dla prawidłowego funkcjonowania drożdży, usuwanie zmętnień, klarowanie i stabilizacja piwa i wina

• Oksydaza glukozowa - stabilizacja piwa i wina

Przemysł piekarski i cukierniczy

• Amylazy - scukrzanie skrobi do cukrów fermentujących, zwiększenie pulchności ciasta

• Proteinazy - częściowa degradacja glutenu mąki, skracanie czasu wyrabiania ciast

• β-galaktozydaza - zapobieganie krystalizacji laktozy

• β-fruktozydaza - produkcja sztucznego miodu

• Glukoamylaza - rozkład skrobi

• Lipazy - poprawa cech organoleptycznych produktów

• Izomeraza glukozowa - produkcja wysokofruktozowych syropów

• Przemysł mleczarski

• Proteinazy - koagulacja mleka, dojrzewanie sera

• β-galaktozydaza - usuwanie laktozy z mleka

• lipazy - dojrzewanie serów, produkcja pełnego mleka w proszku

• Przemysł mięsny, rybny, drobiarski

• Proteinazy - tanderyzacja mięsa, przyspieszanie dojrzewania farszów, produkcja past i hydrolizatów

• Oksydaza glukozy - usuwanie tlenu, ochrona produktów przed utlenieniem - konserwy; ocukrzanie masy jajowej

• Przemysł przetwórstwa owocowo-warzywnego

• Amylazy - usuwanie skrobi w produkcji soków

• Proteinazy - ułatwienie ekstrakcji, stabilizacja klarowności soków

• Pektynazy - usprawnienie tłoczenia oraz filtracji i klarowania soków

• Oksydaza glukozy - ochrona konserwowanych napojów bezalkoholowych przed zmianami barwy, zapachu i korozją puszek





Jedynie ligazy nie znalazły do tej pory bezpośredniego zastosowania przemysłowego, lecz są przydatne w inżynierii genetycznej.

Natura chemiczna enzymów

• to wysoce wyspecjalizowane białka proste lub złożone o masie od 10 kDa do 10 000 kDa,

• białka globularne o kształcie owalnym, charakteryzują się co najmniej strukturą trzeciorzędową,

• właściwości molekularne i funkcję katalityczną enzymów monomerycznych warunkuje ich struktura I, II, III-rzędowa, a oligomerycznych I, II, III, IV-rzędowa.

Aminokwasy hydrofobowe - w pofałdowanym białku w środowisku wodnym są skierowane do wewnątrz.

Aminokwasy polarne - w pofałdowanym białku w środowisku wodnym są skierowane na zewnątrz (na powierzchni).

POWTÓRZYĆ - struktury I, II, III, IV-rzędowe

Struktura pierwotna białek:

Struktura pierwszorzędowa - liczba i kolejność ułożenia reszt aminokwasowych w łańcuchu polipeptydowym

Struktura wtórna białek:

Struktura drugorzędowa - określa wzajemne położenie kolejnych reszt aminokwasowych w łańcuchu (α-helista, struktura β).

Struktura trzeciorzędowa - to przestrzenne ułożenie i wzajemne powiązania różnych regionów pojedynczego łańcucha polipeptydowego.

Struktura czwartorzędowa - przestrzenne ułożenie podjednostek polipeptydowych i sposób ich połączenia.

Enzymy monomeryczne

• zbudowane z 1 łańcucha peptydowego lub z dwu lub więcej połączonych mostkami -S-S- (chymotrypsyna z 3),

• zbudowane ze 100 - 300 aminokwasów, 10 - 35 kDa,

• jest ich mniej niż oligomerycznych, a większość z nich to hydrolazy,

• np. α-amylaza, chymotrypsyna, chymozyna.

Enzymy oligomeryczne

• składają się z 2 lub więcej podjednostek,

• podjednostka jest to element oligomeru łączący się z innymi wyłącznie wiązaniami nikowalencyjnymi,

• podjednostka może się składać z 1 łańcucha polipeptydowego lub kilku połączonych wiązaniami kowalencyjnymi,

• masa oligomeru pow. 35 kDa - 1000 kDa, zdarza się do 10000 kDa

• np. oksydaza glukozy (homodimer - 2 identyczne podjednostki katalityczne), heksokinaza (heterodimer - 2 różne podjednostki).

W skład enzymów oligomerycznych mogą wchodzić podjednostki regulatorowe (nie mające centrum aktywnego), na których znajdują się centra allosteryczne, do których przyczepiają się aktywatory i inhibitory.

Powody występowania struktury IV-rzędowej enzymów oligomerycznych

• błędne łatwo zastąpić,

• miejsce syntezy ≠ miejsce formowania,

• informacja genetyczna może dotyczyć tylko 1 podjednostki,

• budowa podjednostkowa to strukturalna podstawa do realizacji aktywności,

• większa cząsteczka enzymu to lepiej umocowane grupy tworzące centrum aktywne,

• każda podjednostka katalityczna z centrum aktywnym → wydajniejsza kataliza.

Budowa enzymu będącego białkiem złożonym




Jon metalu lub koenzym tylko przejściowo łączący się z apoenzymem podczas reakcji enzymatycznej to tzw. kosubstrat.

Enzymy posiadają ściśle określoną wysoce uporządkowaną strukturę przestrzenną - konformację - warunkującą ich działanie biologiczne (aktywność), a także określoną plastyczność niezbędną do tego działania.

Uszkodzenie tej struktury prowadzi do utraty aktywności biologicznej.

Denaturacja

• zniszczenie wtórnej struktury białka z równoczesnym zanikiem jego aktywności biologicznej i zmianą aktywności fizykochemicznych prowadzi do rozfałdowania łańcucha,

• jest to proces praktycznie nieodwracalny.

POWTÓRZYĆ - czym dokładnie jest denaturacja i jakie czynniki ją powodują.




Trzy zasadnicze etapy

reakcji enzymatycznej

Etap pierwszy

związanie cząsteczek substratu na powierzchni enzymu, powstanie kompleksu ES

Etap drugi

oddziaływanie S i E polegające na przegrupowaniach elektronowych pomiędzy grupami funkcyjnymi S i grupami funkcyjnymi aa kontaktowych E, naprężeniach wiązań w substracie

→ wzbudzonej formy kompleksu E-S

→ E-S‡ „utworzenia stanu przejściowego”

Etap trzeci

zajście reakcji katalitycznej, przekształcenie kompleksu E-S w kompleks E-P i rozpad tego ostatniego na E i P

Centrum aktywne enzymy

• jest to obszar cząsteczki enzymu, w którym cząsteczka(i) substratu zostaje związana i poddana katalizowanej reakcji,

• ma budowę trójwymiarową, leży w zagłębieniu cząsteczki E niedostępnym dla wody

• stanowi tylko niewielką część cząsteczki enzymu




Aminokwasy centrum aktywnego

• k - aminokwasy kontaktowe - leżą w odległości 0,2 nm od substratu; biorą udział w wiązaniu substratu z enzymem oraz bezpośrednio udział w katalizie,

• p - aminokwasy pomocnicze - nie stykają się z substratem, lecz pełnią określoną rolę w katalizie,

• s - aminokwasy stabilizujące strukturę przestrzenną centrum aktywnego.




Miejsce aktywne złożone z reszt aminokwasowych, które należą aa znacznie oddalonych od siebie w liniowym łańcuchu polipeptydowym, ale zbliżonych w przestrzeni na skutek zwinięcia łańcucha w formę globularną.




1. Przestrzenny model lizozymu

Kolor zielony i czerwony - katalityczne reszty aminokwasowi

Kolor żółty - reszty aminokwasowi centrum aktywnego wiążące substrat.

2. Uproszczony diagram lizozymu
   

W odwracalnym wiązaniu substratu najczęściej biorą udział: wiązania elektrostatyczne wodorowe, siły van der Waalsa, rzadziej hydrofobowe oddziaływania oraz wiązania kowalencyjne?

Najczęściej reszt katalitycznych dostarczają:

• Asp, Glu (dodatkowa gr. -COOH),

• Lys, His, Arg (dodatkowa gr. -NH₂),

• Ser (gr. -OH),

• Cys (gr. -SH).

Około 4100 enzymów sklasyfikowanych

Około 100 - 130 enzymów znalazło zastosowanie w technologii żywności

Ok. 4-5%

Ponad 80% to enzymy hydrolityczne

20% inne klasy głównie oksydoreduktazy

70% to proteinazy i amylazy

30% inne hydrolazy

---