Interakcja antygen-przeciwciało w diagnost.i badaniach naukowych.

Oddziaływania przeciwciał(Ab)z antygenami(Ag)-in vitro leży u po

dstaw wielu współcz.klinicznych technik diagnost.oraz laboratoryjny.

metod identyfikacji jakościowo ilościowej.Przeciwciała obecne w sur

owicy krwi,skierowane przeciwko innym organiz.świadczą o wcześni

ejszym kontakcie z tymi organizmami.Przeciwciała o określonej swois

tości stosuje się do wykryw.antygenów.Serologia-dziedzina nauk me

dycznych,dział immunologia zajmujący się interakcjami między anty

genami i immunoglobulinami in vitro.Bada właściwoś.surowicy krwi

człowieka i innych zwierząt.Metody badawcze stosowane w serologii

umożliwiają diagnost.i leczenie wielu chorób.Reakcja serologiczna-

odczyn serologiczny.Reakcja polegająca na swoistym łączeniu się ant

ygenów z przeciwciałami.W diagnostyce laborat.reakcje serologiczne

wykorzys.się do rozpoznawa. nieznanych antygenów przy użyciu zna

nych przeciwciał oraz do rozpoznaw.nieznanych przeciwciał przy uży

ciu znanych antygenów.Antygen-generator przeciwciał,każda substa.,

która wykazuje 2 cechy:immunogenność,czyli zdolność wzbudzenia

przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej,antygenowość-

zdolność do reagowania z przeciwcia.oraz TCR.Ze względu na wystę.

tych cech,wyróżnia się 2 typy antygenów:immunogeny-charakte.się

tylko immunogenością,hapteny-wykazując.tylko antygenowość.Prz

eciwciała(immunoglobuliny)-białka wydziel.przez kom.plazmatycz.

(pobudzone limfocyty B)w przebiegu odpow.immunologicznej typu

humoralnego,które mają zdolność do swoistego rozpozna.antygenów.

Występują w płynach ustrojowych wszystkich kręgowców.Cząst.prze

ciwciała zbudow.jest z 4 łańcuch.polipepty.:2 lekkich i 2 ciężkich po

łączonych wiązan.dwusiarczkowymi.W łańcuchach lekkich i ciężkich

przeciwciała można wyróżnić części stałe(C)i części zmienne(V).Czę

ści zmienne jednego łańcucha ciężkiego oraz jednego łańcuc.lekkiego

tworzą fragment wiążący antygen(Fab).Każde monomeryczne przeci

wciało ma 2 fragmenty Fab i może wiązać jednocześnie 2 antygeny.

Klasy przeciwciał:IgA(immunoglobuliny wydzielnicze-składnik np.

śliny,łez;odgrywają rolę w mechanizmach odpornośc.w obrębie błon

śluzowych przewodu pokarm.,dróg oddech.,itp.),IgD(odgrywają rolę

jako receptory na kom.B dla antygenów),IgE(odpow.za reakcje aler

giczne,odgrywają rolę w zwalczaniu pasożytów),IgG(podstawowa w

odporności klasa immunoglobulin),IgM(immunogl.pierwszego rzutu,

eliminują patogeny zanim zostaną wyproduk.wystarczając.ilości IgG).

Przeciwciało rozcięte przez papainę-zastosowanie papainy umożli.

rozcięc.przeciwciała i uzyska.z pojedynczej cząst.2 fragmentów Fab

-wiążących antygen oraz 1 fragmentu Fc-krystalizującego.Miejsce cię

cia enzymu wypada powyżej regionu zawiasoweg.Dzieki temu udało

się potwierdz.istnienie 2 funkcjonaln.części:fragmentów Fab,odpow

ia.ramionom przeciwciała i wiążących się z antygenem;fragm.Fc,peł

niącego funkcję efektorową,odpow.za różne zjawiska,które zapocząt

kow.związanie antygenu.Epitop-fragm.antygenu,który łączy się bez

pośr.z wolnym przeciwciałem.Proces wiązania się immunologbuliny

z epitopem nazwany został reakcją pierwotną interakcji przeciwcia.

z antygenem.Właściwości reakcji pierwotnej:*powinowactwo(siła

wiązan.antygenu-monowalentnego,przez pojedynczy paratop;miarą

powinowactwa jest współczyn.asocjacji(K=[AbAg]/[Ab][Ag]);powin

owactwo określa się np.metodą równowagi dializacyjnej);*wiązanie

się przeciwciała z multiwalentnym antygenem (posiadającym więcej

niż 1 różnych lub jednakowych epitopów)lub kilkoma cząs.antygenu

nosi nazwe zachłanności.Zachłanno.nie jest sumą powinowactw,jest

od nich większa.Zachłanność zależy od formy przeciwciała.IgM ma

wyższą zachłanność niż IgG,chociaż w stosunk.do samego antygenu

mogą one mieć jednakowe powinowactwo.

Różnorodność interakcji przeciwciał z antygenami daje w rezultacie

kilka zjawisk o naturze fizyko-chem.,m.in.jest to:precypitacja(jeżeli

antygen jest rozpuszczalny-białko,wyizolowa.polisacharyd bakterii),

aglutynacja(jeżeli antygen jest cząst.nierozpuszczalną).Podstawo.

wymogiem precypitacji i aglutynacji jest połączenie krzyżowe(cro

sslinking).Aby doszło do połączenia krzyżowego,przeciwciało musi

posiadać min.2 miejsca wiążące się z epitopem,a antygen musi być

multiwalentny.Reakcja wtórna-reakcja immunologiczn.,gdzie dany

składnik ukł.immunologicznego(np.przeciwciało lub receptor kom.)

reaguje z 2 molekułami różnymi pod względem określonej właściwo

ści biologicznej,ale posiadający.takie same epitopy.Do precypitacji

lub aglutynacji nie dojdzie jeżeli przeciwciało ma tylko1aktywne

miejsce wiążące,nawet jeżeli antygen jest multiwalentny.Z kolei ant

ygen nie może być haptenem(antygenem monowalentnym).Precypi

tacja-swoista reakcja serologiczna polegająca na wytrąceniu się roz

puszczalnego antygenu pod wpływem przeciwciał,zwanych precypł

ynami zawartymi w surowicy krwi.Aglutynacja-zjawisko skupiania

się i zlepiania rozproszonych w środowis.płynnym kom.np.bakterii,

krwinek pod wpływ.aglutynin-przeciwciał zawartych w osoczu krwi.

Wynik pozytywny aglutynacji świadczy o obecności swoistych prze

ciwciał,a negatywny o ich braku.Reakcja aglutynacji-Miareczkowa

nie-aglutynacja zależy od właściwe.proporcji Ab i Ag.*(Ab>Ag)zbyt

duże stężenie Ab w stosunk.do Ag w surowicy umożliw.aglutynację,

jest to efekt protonu(tło niebieskie).*(Ab<Ag)zbyt małe stężenie Ab

w stosun.do Ag da w efekcie niemierzalną aglutynację(tło różowe).

Potencjał zeta antygenu-np.ujemny ładunek na powierzchni erytro

cytów będący wynikiem obecności kwasów sjalowych.Potencjał ten

umożliwia zbliżenie się cząst. do siebie,co w konsekwencji utrudnia

aglutynację naładowanych antygenów przez przeciwciała.Jest to wid

oczne w przypadku aglutynacji erytrocytó.przez IgG.Test Coombsa

(test anty-Ig)-zasada testu opiera się na 2 faktach:*immunoglobulin.

jednego gatu.(np.człowieka)są immunogenne dla immunoglobul.inn

ego(np.królika),*Anty-Ig(np.królicze anty-ludzkie)wiążą się z deter

minantami antygenowymi w części Fc, natomiast pozostają wolną

częścią Fab.Jeżeli ludzka IgG połączy się z odpowiedn.epitopami

na erytrocytach,to dodanie króliczego przeciwciała anty-IgG ludzkiej

wytwor.wiązania aglutynujące erytrocyty.Wersje testu Coombsa:

*test bezpośr.(służy do wykry.przeciwciał związanych np.anty-Rh

związanych na powierzch.erytrocytów.*test pośredni(służy do wykr

ycia przeciwciał wolnych np.anty-Rh w surowicy matek).Test bezpo

średni-Anty-immunoglobulinę dodaje się do roztworu antygenu np.

erytrocytów Rh+,które podejrzewa się o to,że są już połączone z prz

eciwciałami(np.anty-Rh)na swojej powierzchni.Można podejrzewać,

że erytrocyty nowo urodzonego dziecka posiadają matczyne przeci

wciała anty-Rh przyłączone do swojej powierzch.-dziecku grozi cho

roba hemolityczna(konflikt serologiczny).Jeżeli przypuszczenie jest

słuszne tzn.dziecko jest Rh+,a matka posiada IgG anty-Rh,to wówcz

as bezpośredni test da nam następujący wynik:dodanie anty-immun

oglobulin do zawiesiny erytrocytów dziecka spowoduj.wiązanie ma

tczynych powierzchniowych przeciwciał z dodaną anty-immunoglo

buliną i nastąpi aglutynacja erytrocytów.Test pośredni-służy do wy

krycia obecności(w surowicy)przeciwciał specyficzn.na dany antyg

en występujący na powierz.cząst.np.erytrocytów.Takie przeciwciała

surowicze dodane do antygenu cząsteczkowego nie wywołują agluty

nacji(potencjał zeta).Uzupełnie.anty-immunoglobuliny wywoła ocz

ywiście aglutynację.Pośredni test Coombsa ma najczęściej zastoso.

w wykrywaniu przeciwciał anty-Rh w surowicy kobiet Rh-.Test skła

da się z etapu łączenia się IgG anty-Rh w surowicy z erytrocytami

Rh+,a nastep.aglutynacji takich erytrocytów przy pomocy anty-imm

unoglobulin.W jakim przypadku stosuje się test bezpośredni?Słu

ży on do wykry.przeciwciał związanych na erytrocytach.Krew pobie

ran.jest od dziecka,jeżeli podejrzew.się konflikt serologiczny.Dodaje

się wtedy anty-immunoglobulinę i patrzy czy zaszła aglutynacja eryt

rocytów.Różnice testu bezpośredni.i pośred.:*test bezpośredni:prz

eciwciała są połączone z antygenem,krew pochodzi od dziecka,eryt

rocyty muszą być Rh+,aby połączyć przeciwciała,po dodaniu anty-

immunoglobuliny patrzymy czy zaszła aglutynacja erytrocytó*test

pośredni-przeciwciała są wolne,krew pochodzi od matki.Zdolność

przeciwciał do aglutynacji po połączenia się z antygenem wykorz

ystuje się w tzw.szybkich testach diagnostycznych:test na antyRh,

test na grupy krwi AB,test reumatologiczny,test hemolityczn.leków,

test na ciążę.Precypitacja-jeden z podst.procesów łączenia się anty

genu ze swoistym względem niego przeciwciałem w warunkach in

vitro.W odpow.warunk.tak powstałe kompleksy antygen-przeciwci.

wypadają z roztworu w postaci osadu(zmętnienia).Precypitacja pie

rścieniowa-odczyn jakościowy,wykorzy.do wykrywani.przeciwciał,

antygenów bakteryjnych,klasyfikacji bakterii,ustalania przynależno

ści gatunkowe.białek krwi.Wykonu.się go w małych w probówkach,

do których dodaje się badaną surowicę,po czym sprawdza się czy na

granicy faz obu roztworów pojawia się zmętnienie w postaci pierści

enia.Jeśli odczyn jest dodatni(pojawia się pierścień precypitacyjny),

świadczy to o obecności w środowis.reakcji przeciwciała swoistego

względem określoneg.antygenu,lub odwrotnie,w zależności od tego,

jakiego reagentu obecność chcieliśmy zdiagnozować.Precypitacja

w żelach-(odczyn immunodyfuzji)w żelu agarowym lub agarozow

ym.Identycznie jak tworzenie się agregatu precypitacji w żelach w

pierwszym rzędzie zależy od wzajemnych proporcji [Ab]/[Ag].Dyf

uzja pojedyncza-surowicę(z przeciwciałami)miesza się z żelem i

wylewa na płyt.Petriego.Po zakrzepnięciu agaru wycina się w nim

zbiorniczki,które wypełn.się antygenem w różnym stężeniu lub róż

nymi antygenami.Dyfuzję pojedynczą polega na tym,że 1 reagent

związan.jest w żelu,a 2 w głąb niego dyfunduje.Dyfuzję podwójna-

metoda Ouchterlony,pozwala na okreslenia tzw.wzorca identyczno

ści antygenów.Z dyfuzją ta mamy do czynienia,kiedy oba reagenty

dyfundują w głąb żelu.Dyfuzja radialna-ocena stężen.antygenu np.

hormonu.Ig jest równomiernie zmieszano z żelem(unieruchomione);

roztwór antygenu umieszcza się w otworach;pole precypitacji jest

wprost proporcjo.do stężen.antygenu.Różnice międz.aglutynacją,a

precypitacją?Aglutynacja-antygen jest nierozpuszczalny.Precypita

cja-antygen jest rozpuszcz.Przykłady aglutynacji?TestyCoombsa.

Przykłady precypitacji?dyfuzja probówkowa.Aglutynacja i prec

ypitacja należą do tzw.bezpośr..testów immunologicz.pozwalają

wykryć określ.antygen za pomocą znakowanych przeciwciał.Ag+

Ab>Wynik.Antygeny wirusowe czy bakterie występ.bardzo często

w ustroju w bardzo małej ilości,która znajduje się poniżej progu

detekcji.Z tego względu stosu.się testy immunologiczn.pośrednie.

Testy pośrednie-interakcje antygen-przeciwciało(wykrywan.anty

genów).Testy pośrednie opierają się na założeniu,że jeśli organiz.

kręgowca zetknął się z konkretny.antygenem,to w surowicy tego

organ.będą się znajdow.swoiste wobec tego antygenu przeciwcia.

Przykłade.testu pośredniego jest Immunoelektroforeza.Metoda

ta łączy elektroforez.w żelu z immunoprecypitacją.Składa się z 2

etapów,w pierwszym mieszaninę antygenów(np. surowicę krwi)

umieszcza się w studzience i poddaje elektroforezie.W drugim et

apie wycina się rowek w którym umieszcza się antysurowicę.Dy

fundując w agarze antysurowica precypituje elektroforetycznie.

Stosując immunoelektroforezę w surowicy odkryto niedobór prz

eciwci.(agammaglobuinemia,sydrom Bnefona-charakt.się całko

witym brakiem przeciwciał i śladową obecnoś.limfocytów B w

krążeniu,poniżej 1%).Western Blot (immunoblot)W metodzie

tej antygen lub mieszanina antygenów jest najpierw rozdzielana

na żelu poliakrylamido.(PAGE)w obecności siarczanu dodecylu

sodu(SDS),co pozwala rozdzielić cząst.ze względu na ich wielko

ść.Rozdzielony w żelu materiał jest następn.transferowany do str

efy(błony)wiążącej np.dla białka jest to zwykle błona nitrocelulo

zowa.Służy do tego technika zwana elektroblotting.Następny etap

obejmuje płukanie błony nitrocelulozowej w roztworze zawierają.

specyficzne przeciwciało.Zwykłe przeciwciało to jest w jakiś spo

sób znakowane np.ma wbudowany pierwiastek radioaktywny lub

jakąś grupę fluoryzującą.W ten sposób można bardzo dokładnie

zlokalizowany poszukiwany antygen i nawet oznaczyć jego ilość

i ciężar cząsteczkowy.Immunodetekcja: a)Radio- immunodete

kcja(wiązanie bezpośredn.)-W metodach radio-immunodetekcji

stosuje się cząst.znakowane izotopami.Technika ta umożliwia det

ekcję bardzo małych ilości antygenu,przeciwciała lub kompleksu

antygen-przeciwciało.Stężenie znakowanej substancji oznacza się

mierząc bezpośrednio radioaktywność bez potrzeby stosowania

metod chemiczn.Dlatego czułość tych metod jest o kilka rzędów

wyższa w stosunku do czułości metod chemicznych.Metody te ro

zwinęła Rosalyn Yalow, za co otrzymała nagrodę Nobla.Metody

radio-immunodetekcji odegrały olbrzymią rolę w badaniach nad

substancjami występującymi w małych stężeniach w płynach ust

rojowych np.hormony,transmitery,cytokiny.*Oznaczeni.wartości

standardowej(znana ilość znakowanego izotopem antygenu reagu

je z niewielką,znaną ilością przeciwciała);*Oznaczanie stężenia

antygenu nie znakowanego(im więcej jest nie znakowanego anty

genu w roztworze tym mniej antygenu znakowanego zwiąże się

z przeciwc.)Ważnym etapem radio-immunodetekcji jest oddziele

nie kompleksu antygen-przeciwciało od wolnego antygenu.Służą

do tego rożne techniki nie mniej jednak głównie oparte są one na

technikach antyimmunoglobulinowych.Zasadą tych technik jest

precypitacja kompleksu przy pomocy anty-immunoglobulin.Stos

uje się również metody wysalania siarczanem amonu- przeciwcia

ło(białko globularne)precypituje wraz ze związanym antygenem

w roztworze 33% siarczanu amonu pozostawiając niezwiązany

antygen w roztworze.b)Immuodetekcja w fazie stałej-Obecnie

jest to jedna z najpowszechniej stosowanych technik immunode

tekcji.Wykorzystuje ona absorbujące właściwości poliwynylu i

polistyrenu.Jej odmianą są metody immunoenzymatyczne oraz

metody immunofluorescencyjne. Metody immunoenzymatycz

ne(EIA)-zbliżone do metod radioimmunologicznych,ale zamiast

znacznika izotopowego stosuje się aktywny enzym,np.peroksy

dazę chrzanową(HRP)lub alkaliczną fosfatazę AP.Metody te cha

rakter.się większą czułością niż testy(metody)immunofluorescen

cyjne.Podstawą jest test ELISA- test immunoenzymatyczny,jest

jednym z pierwszych i podstaw.testów badających czy dany pac

jent jest pozytywny na pewne patogeny takie jak HIV.Służy on

do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem

przeciwci.poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych

z odpowiednim enzymem.W podstaw.wersji testu ELISA,pewna

ilość antygenu unieruchomiona jest na powierz.fazy stałej.Wyko

nanie testu polega na wprowadz.materiału biologicz.zawierając.

przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu.Przeci

wciała te powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalen

cyjnym z enzymem.Test ten należy do szerszej grupy tzw.testów

fazy stałej.Metody immunofluorescencyjne:Subst.fluoryzująca

posiada właściwoś.emitowania światła o określonej długośc.,gdy

jest pobudzana światłem o krótszej dług.fali.Immunofluorescen

cja(IF)metoda badania reakcji antygen–przeciwciało stosowana

najczęściej w badaniach immunohistochemicznych,z wykorzysta.

flourochromów,którymi znakuje się antygen lub przeciwciało;wy

nik reakcji w postaci świecących kompleksów odczytuj.się w św

ietle ultrafioletowym w mikroskopie lub za pomocą cytometru

przepływowego.Stosuje się 2 odmienne techniki immunofluor

escencji:*Immunofluorescencja bezpośredn.-służy przede wsz

ystkim do detekcji antygenu i polega na wiązaniu się przeciwcia.

z antygenem w tkankach(immunohistologia),kom.(immunocytol

ogia)np.limfocytach,makrofagach.Jeden ze składnik.reakcji(prze

ciwciało lubantygen)swoisty dla drugiego,poszukiwanego,znako

wany jest fluorochromem.Po nałożeniu znakowan.czynnika inku

buje się badany skrawek,po przemyciu bada obecność świecenia.

*Immunofluorescencja pośrednia-w pierwszy.etapie zachodzi

reakcja nie znakowanego czynnika z poszukiwanym-reakcja ant

ygenu z nieznakowanym przeciwciałem(np.badane przeciwciało

nakrapia się na skrawek), a dopiero po inkubacji i przemyciu prz

eprowadza się drugi etap,tzn.reakcję znakowanej surowicy z czy

nnikiem związanym w pierwszym etapie.Metody immunofluor

escencyjne znalazły zastosowanie w: diagnostyce chorob o pod

łożu autoagresji,diagnostyce chorób nowotworowych,wykrywan.

patogenow w materiale klinicznym,identyfikacji organelli kom.,

receptorow,ligandow,miejsc syntezy hormonow,czynnikow wzro

stu Kom.tuczne(mastocyty)-kom.wchodzące w skład tk.łącznej,

występ.w skórze,błonach śluzowych i ukł.limfatycznym.Odgryw.

olbrzymią rolę w mechanizm.alergii, ze względu na zawartość

mediatorów tkankowych takich jak:histamina,serotonina czy hep

aryna,zmagazyn.w ziarnistościach komórko.W stanach alergicz

nych mastocyty są opłaszczone przez immunoglobuli.klasy IgE.

Po przyłączeni.alergenu do IgE dochodzi do uwalniania ziarnist

ości mastocytów,co z kolei wywołuj.typowe objawy alergii.Test

ciążowy-jest przykład.wykorzys.metod immunoenzymatycz,test

pozwalając.wykryć(najczęściej w moczu)produkowaną przez tro

foblast gonadotropinę kosmówkową(hCG),której pojawienie się

świadczy o zagnieżdżeni.się jaja płodowego(Blastocysty) w błon.

śluzowej macicy.Test ma postać membrany kapilarnej(służy ona

do tego,żeby po naniesieniu na nią próbki z moczem-nasiąkła

moczem).Występ.3 miejsca w teście ciążowym:okienko R(przec

iwciała monoklonalne przeciw hCG,połączone z enzymem)-strefa

reakcyjna R;strefa testowa T-zawiera unieruchomio.poliklonalne

przeciwciała na hCG oraz barwny substrat;okienko kontrolne C

(zawiera unieruchomione przeciwciała przeciw przeciwciałom

mysim oraz barwny substrat.Przeciwciała monoklonalne-takie sa

me-skierowane na 1 antygen.Przeciwcia.poliklonalne-takie same-

skierowane na różne antygeny.Wynik negatywny-Próbka nasiąkła

przy pomocy sił kapilarnych.Przeciwciała docierają do okienka

testowego,następnie do okienka kontrolnego C.Antymysie przeci

wciała łączą się z przeciwciał.mysimi-powstaje barwny substrat.

Wyniki pozytywny-Gonadotropina wiązana jest do przeciwciał

mysich(okienko reakcyjne).Może dojść do wiązania krzyżowego-

gdy do tego dojdzie,to enzym zdolny jest do przereagowania z su

bstratem.Okienko kontrolne-wiązanie się z kozimi antygenami

mysimi.2 kreski świadczą o tym,że wynik jest pozytywny i test

dział.1 kreska-test działa,wynik negatywny.Czynniki wpływają

ce na wynik testu ciążowego:zbyt wczesne wykonani.testu ciąż

owego,przyjmowanie leków hormonalnych zawierających hCG,

przebyty poród lub poronienie,stany patologiczne,ciąża pozamac

iczna.Na wynik testu ciążowego nie wpływa:przyjmowanie ant

ybiotyków,alkoholu,….