Interakcje antygen - przeciwciało w diagnostyce i badaniach naukowych.

Oddziaływania przeciwciał z antygenami In vitro leży u podstaw wielu współczesnych klinicznych technik diagnostycznych oraz laboratoryjnych metod identyfikacji jakościowo ilościowej.

Serologia tj. klasyfikacja antygenów mikroorganizmów z pomocą specyficznych surowic, była jedną z najistotniejszych technik immunologicznych używanych w klinice i nauce (m.in. w mikrobiologii i wirusologii)

Immunoglobuliny (przeciwciała)

Jest 5 klas przeciwciał. Są to białka surowicy klasy globulin występujących w 5 podklasach (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD) wytwarzane przez limfocyty B (i ich pochodne komórki plazmatyczne) w odpowiedzi na antygeny infekcyjne, alergeny oraz antygeny tkankowe, zarówno własne (autop. Ciała) jak i obce

Proces wiązania się Ig z epitopem nazwany został reakcją pierwotną interakcji przeciwciała z antygenem.

Uwaga: powyższa reakcja pierwotna nie jest tym samym co reakcja pierwotna w procesie immunizacji

Epitop- jest to fragment antygenu z którym łączy się przeciwciało

Niektóre właściwości reakcji pierwotnej:

- współczynnik asocjacji pod względem pojedynczego epitopu (K=[AbAg]/[Ab][Ag]) jest miarą powinowactwa Ig do epitopu (powinowactwo określa się np. metodą równowagi dializacyjnej)

- wiązanie się Ig z multiwalentnym antygenem lub kilkoma cząsteczkami antygenu nosi nazwę zachłanności (avidity) Wielkość ta zależy od walętności przeciwciała. IgM ma wyższe avidity niż IgG, chociaż w stosunku do tego samego antygenu mogą one mieć jednakowe powinowactwo.

Różnorodność interakcji przeciwciał z antygenami daje w rezultacie kilka zjawisk o naturze fizyko-chemicznej m.in. jest to:

- precypitacja - jeżeli antygen jest rozpuszczalny oraz

- aglutynacja - jeśli antygen jest cząsteczką nierozpuszczalną.

Aby doszło do tych zjawisk przeciwciało musi posiadać 2 miejsca wiążące się z epitopem, antygen musi być multiwalentny.

Do precypitacji nie dojdzie jeżeli przeciwciało ma tylko jedno aktywne miejsce wiążące nawet jeżeli antygen jest multiwalentny. Z kolei antygen nie może być haptenem (antygenem monowalentnym) Do precypitacji dojdzie, gdy przeciwciało ma wiele miejsc wiążących, a antygen jest multiwalentny.

Właściwości reakcji wtórnej:

-podstawowym wymogiem precypitacji i aglutynacji jest połączenie krzyżowe (crosslinking). Aby doszło do połączenia krzyżowego, przeciwciało musi posiadać minimalnie dwa miejsca wiążące, natomiast antygen musi być multiwalentny.

Precypitacja jest to swoista reakcja serologiczna polegająca na wytrąceniu się rozpuszczalnego antygenu pod wpływem przeciwciał, zwanych precypłynami zawartymi w surowicy krwi

Aglutynacja- jest to zjawisko skupiania się i zlepiania rozproszonych w środowisku płynnym komórek np. bakterii, krwinek pod wpływem aglutynin - przeciwciał zawartych w osoczu krwi.

Reakcja aglutynacji

Miareczkowanie- aglutynacja zależy od właściwej proporcji Ab i Ag

-(Ab>Ag) zbyt duże stężenie Ab w stosunku do Ag w surowicy uniemożliwi aglutynację, jest to efekt protonu (tło niebieskie)

-(Ab<Ag) zbyt małe stężenie Ab w stosunku do Ag da w efekcie niemierzalną aglutynację (tło różowe)

Potencjał zeta antygenu np. ujemny ładunek na powierzchni erytrocytów będący wynikiem obecności kwasów sjalowych)

Potencjał ten uniemożliwia zbliżanie się cząsteczek do siebie, co w konsekwencji utrudnia aglutynację naładowanych antygenów przez przeciwciała. Jest to szczególnie widoczne w przypadku aglutynacji erytrocytów przez IgG.

Odległość pomiędzy ramionami Fab IgG jest zbyt mała nawet przy największym rozwarciu przeciwciała, aby wytworzyć most pomiędzy dwoma erytrocytami oddalonymi od siebie w wyniku działania potencjału zeta.

Natomiast przeciwciała klasy IgM ze względu na swoją pentemeryczną budowę mają odcinki Fab wystarczająco oddalone od siebie aby mogły połączyć dwa lub więcej erytrocytów i aglutynować je.

Właśnie ta właściwość czyni immunoglobuliny IgM bardzo efektywną w aglutynowaniu antygenu cząsteczkowego.

Przez szereg lat usiłowano stworzyć metody osłabienia potencjału zeta. Żadna z tych metod nie była wystarczająco efektywna. W połowie XX wieku Coombs opracował genialną metodę obejścia tego problemu. Metoda ta ułatwia aglutynację erytrocytów przy pomocy IgG specyficznej dla antygenu na erytrocytach.

Test Coombsa (test anty-Ig)

Zasada testu opiera się na dwóch faktach:

- immunoglobuliny jednego gatunku (np. człowieka) są immunogenne u innego (np. królika)

- Anty-Ig (np. królicze anty-ludzkie) wiążą się z determinantami antygenowymi w części FC, natomiast pozostawiają wolną część Fab.

Jeżeli ludzka IgG połączy się z odpowiednimi epitopami na erytrocytach, to dodanie króliczego przeciwciała anty-IgG ludzkiej wytworzy wiązania aglutynujące erytrocyty.

Rozróżnia się dwie wersje testu Coombsa:

Test bezpośredni: służy do wykrycia przeciwciał związanych np. anty-Rh związanych na powierzchni erytrocytów

Test pośredni: służy do wykrycia przeciwciał wolnych np. anty-Rh w surowicy matek.

Test bezpośredni: W teście bezpośrednim antyimmunoglobulinę dodaje się do roztworu antygenu np. erytrocytów Rh+ (plus) które podejrzewa się o to, że są już połączone z przeciwciałami (np.anty-Rh) na swojej powierzchni.

Dla przykładu można podejrzewać, że erytrocyty nowo urodzonego dziecka posiadają matczyne przeciwciała anty-Rh przyłączone do swojej powierzchni -dziecku grozi choroba hemolityczna (konflikt serologiczny)

Jeżeli przypuszczenie jest słuszne tzn. dziecko jest Rh+, a matka posiada IgG anty-Rh, to wówczas bezpośredni test Coobsa da nam następujący wynik: dodanie anty-immunoglobulin do zawiesiny erytrocytów dziecka spowoduje wiązanie się matczynych powierzchniowych przeciwciał z dodaną anty-immunoglobulią i nastąpi aglutynacja erytrocytów.

Test pośredni: Pośredni test Cooomsa służy do wykrycia obecności (w surowicy) przeciwciał specyficznych na dany antygen występujący na powierzchni cząsteczki np. erytrocytów. Takie przeciwciała surowicze dodane do antygenu cząsteczkowego nie wywołują aglutynacji (potencjał zeta). Uzupełnienie anty-immunoglobuliny wywoła oczywiście aglutynację.

Pośredni test Coombsa ma najczęściej zastosowanie w wykrywaniu przeciwciał anty-Rh w surowicy kobiet Rh- (minus). Test składa się z etapu łączenia się IgG anty-Rh w surowicy z erytrocytami Rh+, a następnie aglutynacji takich erytrocytów przy pomocy anty-immunoglobulin.

Zdolność przeciwciał do aglutynacji po połączeniu się z antygenem wykorzystuje się w tzw. Szybkich testach diagnostycznych

-test na antyRh

-test na grupy krwi AB

-test reumatologiczny

-test hemolityczny leków

-test na ciążę

Reakcje precypitacji w roztworach.

Reakcja przeciwciała dwuwalentnego z rozpuszczalnym antygenem multiwalentnym

Agregat-wytrącenie z roztworu

Tworzenie się agregatu zależy w pierwszym rzędzie od wzajemnych proporcji [Ab]/[Ag]

Jeżeli ilość precypitatu przedstawić w stosunku do ilości dodawanego antygenu przy stałym stężeniu Ig, to otrzymamy krzywą jak na poniższej rycinie

Precypitacja w żelach

Identycznie jak tworzenie się agregatu precypitacji w żelach zależy w pierwszym rzędzie od wzajemnych proporcji [Ab]/[Ag]

Dyfuzja podwójna (metoda Ouchterlony) pozwala na określenie tzw. Wzorca identyczności antygenów.

Dyfuzja radialna - ocena stężenia antygenu np. hormonu. Ig jest równomiernie zmieszano z żelem. Roztwór antygenu umieszcza się w otworach.

Immunoelektroforeza

Metoda ta łączy elektroforezę w żelu z immunoprecypitacją. Składa się z dwóch etapów, w pierwszym mieszaninę antygenów (np. surowicę krwi) umieszcza się w studzience i poddaje elektroforezie. W drugim etapie wycina się rowek w którym umieszcza się antysurowicę. Dyfundując w agarze antysurowica precypituje elektroforetycznie.

Stosując immunoelektroforezę w surowicy odkryto niedobór przeciwciał (agammaglobuinemia, sydrom Bnefona)

Western Blot (immunoblot)

W metodzie tej antygen lub mieszanina antygenów jest najpierw rozdzielana na żelu. Rozdzielony w żelu materiał jest następnie transferowany do strefy (błony) wiążącej np. dla białka jest to zwykle błona nitrocelulozowa.

Służy do tego technika zwana elektroblotting. Następny etap obejmuje płukanie błony nitrocelulozowej w roztworze zawierającym specyficzne przeciwciało. Zwykłe przeciwciało to jest w jakiś sposób znakowane np. ma wbudowany pierwiastek radioaktywny lub jakąś grupę fluoryzującą. W ten sposób można bardzo dokładnie zlokalizowany poszukiwany antygen i nawet oznaczyć jego ilość i ciężar cząsteczkowy.

Immunodetekcja

A. Radio- immunodetekcja (wiązanie bezpośrednie)

W metodach radio-immunodetekcji stosuje się cząsteczki znakowane izotopami. Technika ta umożliwia detekcję bardzo małych ilości antygenu, przeciwciała lub kompleksu antygen-przeciwciało.

Stężenie znakowanej substancji oznacza się mierząc bezpośrednio radioaktywność bez potrzeby stosowania metod chemicznych. Dlatego czułość tych metod jest o kilka rzędów wyższa w stosunku do czułości metod chemicznych.

Metody te rozwinęła Rosalyn Yalow, za co otrzymała nagrodę Nobla.

Metody radio-immunodetekcji odegrały olbrzymią rolę w badaniach nad substancjami występującymi w małych stężeniach w płynach ustrojowych np. hormony, transmitery, cytokiny.

1. Oznaczenie wartości standardowej (znana ilość znakowanego izotopem antygenu reaguje z niewielką, znaną ilością przeciwciała)

2. Oznaczanie stężenia antygenu nie znakowanego (im więcej jest nie znakowanego antygenu w roztworze tym mniej antygenu znakowanego zwiąże się z przeciwciałem)

Ważnym etapem radio-immunodetekcji jesy oddzielenie kompleksu antygen-przeciwciało od wolnego antygenu. Służą do tego rożne techniki nie mniej jednak głównie oparte są one na technikach antyimmunoglobulinowych. Zasadą tych technik jest precypitacja kompleksu przy pomocy anty-immunoglobulin. Stosuje się również metody wysalania siarczanem amonu- przeciwciało (białko globularne) precypituje wraz ze związanym antygenem w roztworze 33% siarczanu amonu pozostawiając niezwiązany antygen w roztworze.

B. Immuodetekcja w fazie stałej.

Obecnie jest to jedna z najpowszechniej stosowanych technik immunodetekcji. Wykorzystuje ona absorbujące właściwości poliwynylu i polistyrenu.

Jej odmianą są metody immunoenzymatyczne oraz metody immunofluorescencyjne

1. Metody immunoenzymatyczne

Podstawą jest ELISA- jest jednym z pierwszych i podstawowych testów badających czy dany pacjent jest pozytywny na pewne patogeny takie jak HIV.

---