Immunologia p. Sylwia Wrotek 3.02.2007
Western Blot
Elektroforeza w warunkach denaturujących.
Mamy zel w mieszaninie, pod nim błona nitrocelulozowa i to pomiędzy dwoma błonami nasączonymi buforem. Odczekać, potem grawitacyjnie może być przeniesione albo za pomocą urządzenia (elektrotransfer). Nitroceluloza wiąze oprócz antygenów też białka. Trzeba zablokować wolne miejsca np.roztworem albuminy lub roztwór mleka w proszku odtłuszczonego. Najpierw trzymamy błonę w mleku, po przepłukaniu buforem dopiero teraz można umieścić błonę w roztworze przeciwciał.
Reakcja pośrednia: przeciwciało pierwotne (pierwszorzędowe) specyficzne względem antygenu badanego, ale nie jest znakowane. Trzeba zastosować przeciwciało drugorzędowe znakowane (np. izotop, enzym) - antyimmunoglobuliny. One rozpoznają przeciwciała pierwszorzędowe łączą się z nimi (z częścią nie enzymatyczną).
Reakcja bezpośrednia: antygen jest badany i przeciwciała są od razu wyznakowane (przeciwciała komercyjne). Jesteśmy w stanie oznaczyć masę cząsteczkową antygenu.
Western Blot dot Blot - nie jesteśmy w stanie oszacować masy cząsteczkowej antygenu. Antygen bezpośrednio nanoszony na nitrocelulozę
Potencjał zeta lubiany przez profesora.
W strefie równowagi tworzą się duże agregaty wypadające z roztworu.
Test ciążowy.
3 rodzaje przeciwciał monoklinalnych. Ciążowe testy immunoenzymatyczne wykorzystują przeciwciała monoklinalne przeciw łańcuchowi β gonadotropin
1 okienko - przeciwciała A znakowane enzymem, nie związane z nitrocelulozą, skierowane przeciw ludzkiej gonadotropinie, wiąże hormon obecny w próbce moczu.
2 okienko - przeciwciała B. Przeciwciałą B wiązą kompleks gonadotropina-przeciwciala A. Przeciwciała B są związane z nitrocelulozą.
3 okienko - Ab C związane z nitrocelulozą, wiążą wolne przeciwciała A, w trzecim okienku musi być zawsze prążek.
Przeciwciała poliklonalne powstają w bardziej naturalny sposób. Mieszanina przeciwciał względem białka którym immunizowano zwierzę.
Przeciwciała monoklonalne. Sztuczny twór. W latach 70tych Milstein i Kohler opracowali technikę generowania przeciwciał monoklinalnych. Dostali nagrodę Nobla. Są to przeciwciała specyficzne, identyczne. Uzyskali kom. Plazmatyczne, które są nieśmiertelne - komórki nowotworowe (zaleta dla naukowców).
Ab monoklonalne to homogenie populacja cząstek immunoglobulin, pochodząca z jednej komórki produkującej przeciwciała. Wszystkie przeciwciała są w tym przypadku identyczne i posiadają identyczną specyficzność i wrażliwość względem danego epitopu.
Podstawowym problemem była długość życia komórek , wykryto komórki nowotworowe
- nieśmiertelne
- niezdolne do wydzielania przeciwciał
- wykazywały niedobór enzymu HGPRT (transferaza hipoksantyno-guaninowa)
Te komórki trzeba połączyć z komórkami odizolowanymi ze zwierzęcia (z komórkami śledziony) od myszy immunizowanej jakimś antygenem.
Mamy komórki szpiczaka, one dają nieśmiertelność, mają niedobór enzymu, przeciwciała będą produkowały po połączeniu z kom. B śledziony. Kom śledzony myszy są HGPRT +/+, komórki będące hybrydami komórek plazmatycznych nowotworowych po fuzji z kom B od myszy dawcy przeżywają w medium pozbawionym enzymu, kom nie będące hybrydami umierają.
Zespół HAMA - skutek powstawania w organizmie człowieka przeciwciał na przeciwciała mysie. Objawy: wysypka, obrzęk ciała, niewydolność nerek.
Humanizacja przeciwciał: zastąpienie przeciwciała mysiego przeciwciałem ludzkim
Inżynieria genetyczna daje różne możliwości - immunoglobulina składa się z obcinka mysiego i odcinka ludzkiego (dimer przeciwciała)
Np. powielanie odcinka DNA z zastosowaniem PCR
Zastosowanie monoklinalnych przeciwciał:
- prognozowanie chorób nowotworowych
- oczyszczanie odczynników i hormonów
- diagnostyka róznicowa i lokalizacja nowotworów
- leczenie nowotworów
- wykrywanie i określanie stężenia róznych czynników i hormonów, enzymów i leków
- immunosupresja
*u pacjentów ze szczepem allogenicznym
*u pacjentów z chorobą autoimmunologiczną
- wykrywanie antygenów HLA podczas doborów dawców przeszczepów
- wykrywanie antygenów mikroorganizmów w czasie diagnostyki chorób zakaźnych
-neutralizacja toksyn