PRZECIWCIAŁA

MONOKLONALNE

1.

Wstęp.

2.

Co to są przeciwciała monoklonalne?

3.

Produkcja przeciwciał monoklonalnych.

4.

Mianownictwo przeciwciał monoklonalnych

5.

Mechanizmy działanie PM.

6.

Zastosowanie PM.

7.

Główne problemy terapii z użyciem PM.

CO TO SĄ PRZECIWCIAŁA
MONOKLONALNE?

Cząsteczki przeciwciał o tej

samej swoistości są normalnie
heterogenne, ponieważ
pochodzą z różnych linii
komórek wytwarzających
przeciwciała.

Heterogenność jest przeszkodą

w wyjaśnianiu mechanizmów
procesów biologicznych.

Pierwsze trudności pokonano

dzięki wykorzystaniu komórek
szpiczaka mnogiego,
wytwarzających przeciwciała.

Szpiczak mnogi

charakteryzuje się tym, że pojedynczy,

zmieniony limfocyt lub komórka plazmatyczna dzieli
się w niekontrolowany sposób.
W rezultacie powstaje bardzo wiele komórek jednego
rodzaju.
Komórki te stanowią

klon

, ponieważ pochodzą od

jednej komórki i maja identyczne właściwości.
Nowotwór wytwarza zatem duże ilości przeciwciał
jednego rodzaju. Przeciwciała wytwarzane przez klon
komórek szpiczaka są normalnie pod względem
struktury

homogenne

.

Szpiczak może być przeszczepiony od jednej myszy do
drugiej, gdzie kontynuuje namnażanie.

Komórki nowotworowe wytwarzające
przeciwciała dają

ten sam

rodzaj

przeciwciał, pokolenie po pokoleniu.

PRODUKCJA PRZECIWCIAŁ

MONOKLONALNYCH



Ograniczeniem w badaniu immunoglobulin wytwarzanych

przez komórki szpiczaka jest to, że odpowiadający im
antygen przeważnie nie jest znany.



W roku 1975 C.Milstein i G.Kohler odkryli, że wielką ilość

monoklonalnych przeciwciał

o niemal każdej swoistości

można uzyskać dzięki fuzji komórek wytwarzających
przeciwciała z komórkami szpiczaka.



Immunizuje się mysz antygenem i po kilku tygodniach

pobiera się od niej śledzionę.



Mieszaninę limfocytów i komórek plazmatycznych ze

śledziony poddaje się in vitro fuzji z komórkami szpiczaka.



Każda z powstałych komórek hybrydowych, zwanych

komórkami hybrydoma

, stale wytwarza homogenne

przeciwciała o swoistości określonej przez macierzystą
komórkę śledziony.



Powstałą populacje komórek hybrydoma przeszukuje się w

celu wyselekcjonowania komórek wytwarzających
przeciwciała o pożądanej swoistości.



Komórki dające oczekiwane przeciwciała można namnażać

in vitro lub wszczepiać myszom w celu wywołania szpiczaka.



Komórki te można również zamrażać i przechowywać przez

dłuższy czas.

MIANOWNICTWO PRZECIWCIAŁ

MONOKLONALNYCH



Na świecie istnieje kilkadziesiąt firm i koncernów biotechnologicznych tworzących PM z

zamiarem testowania ich w klinice. Pierwotnie tworzone PM miały (i często mają) różne
nazwy i identyfikacyjne skróty, nic nie mówiące o charakterze przeciwciała.



Od pewnego czasu istnieją zalecenia nadawania nazw PM, określające ich biologiczną rolę

oraz źródło. Podstawowym zaleceniem jest użycie w nazwie PM lub produktu wywodzącego
się z PM końcówki -mab, poprzedzonej jedno - lub dwuliterową wstawką, charakteryzującą
źródło (charakter) przeciwciała.



Końcówka:

- -ximab - mówi, że przeciwciało jest chimeryczne (najczęściej mysie-ludzkie) (np. rituximab),

- -zumab - wskazuje, że przeciwciało jest humanizowane (np. trastuzumab).



Ponadto aprobuje się, by potencjalna dziedzina zastosowania (lub tkankowe

oddziaływanie) PM była zakodowana w nazwie przeciwciała poprzez wstawienie dwóch lub
trzech liter przed końcem nazwy. Proponowane wstawki to:
- -vir-lub -vi - dla PM stosowanych w kontekście zakażeń wirusowych (np. palivizumab),
- -bac - lub -ba - dla PM stosowanych w zakażeniach bakteryjnych (np. nebacumab).



Dodatkowe zalecenia dotyczą kodowania w nazwie PM nowotworu docelowego, poprzez

użycie podstawnika zamiennego w miejsce wstawki -tum-. Wstawka -col- lub -co- jest
rezerwowana dla raka okrężnicy (np. edrecolomab), analogicznie -mel-  - dla czerniaka, -mar-
- dla raka sutka.



Uznaje się za wskazane ujawnianie w nazwie PM także dodatkowych przyrostków, skrótów

toksyn,
nazw izotopów itp., w zależności od modyfikacji PM.

MECHANIZMY DZIAŁANIA PM

PM, podobnie jak przeciwciała zwykłe, oprócz

wysoce wybiórczej zdolności reagowania z
antygenem, angażują różne mechanizmy
efektorowe, których celem ostatecznym
jest

eliminacja

rozpoznawanej struktury

docelowej lub komórki.

Największe nadzieje wiązano z użyciem PM w

leczeniu nowotworów i w istocie najwięcej
zaaprobowanych w medycynie PM i
najwięcej prób klinicznych z użyciem PM
dotyczy onkologii. Wiążąc się z
odpowiednią cząsteczką (np. antygenem
związanym z nowotworem), PM mogą
niszczyć komórki nowotworowe
bezpośrednio:

- blokując receptor dla czynników wzrostu,
niezbędny do proliferacji komórek nowotworowych
-aktywując dopełniacz
- uczestnicząc w zjawisku cytotoksyczności
komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)
- aktywując za pośrednictwem odpowiedniej
cząsteczki szlak apoptozy

-hamując rozwój w nim naczyń krwionośnych po

zablokowaniu receptora dla czynnika wzrostu
śródbłonka

ZASTOSOWANIE PRZECIWCIAŁ

MONOKLONALNYCH



Opracowanie metod produkcji przeciwciał monoklonalnych

metodą hybrydoma otworzyło nowe perspektywy badań w

biologii i medycynie.



Możliwa jest produkcja dużej ilości homogennych przeciwciał o

dokładnie określonej swoistości.



Przeciwciała monoklonalne służą też jako precyzyjne

odczynniki analityczne i preparatywna.



Transfuzje krwii stały się bezpieczniejsze po zastosowaniu

przeciwciał do sprawdzania krwii dawcy na obecność w niej

wirusów powodujących AIDS, żółtaczkę i innne chioroby

zakaźne.



Ocenia się również możliwość użycia PM do leczenia raka.



Co więcej,dzięki ogromnej różnorodności immunoglobulin,

można wytworzyć katalityczne przeciwciała o właściwościach

nie spotykanych wśród naturalnie występujących enzymów.

1.TRADYCYJNE PRZECIWCIAŁA

MONOKLONALNE

Kliniczne zastosowanie znalazły już PM przeciw cytomegalowirusowi, przeciw bakteriom:

Psudomonas aeruginosa, Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae

PM są używane do wykrywania i określania stężeń leków, hormonów, enzymów, nawet

jeżeli występują one bardzo małych ilościach w płynach tkankowych

PM usprawniają również diagnostykę chorób zakaźnych. Dysponując przeciwciałami

przeciw określonym mikroorganizmom można skrócić czas potrzebny do wykrywania ich

obecności z kilku dni do kilku minut

Jednymi z najczęściej używanych PM są OKT3 skierowane przeciwko przeciw cząsteczkom

CD3 na limfocytach T. Indukując pobudzenie, a następnie niszczenie limfocytów T

wywołują one immunosupresję, czyli zmniejszenie reaktywności immunologicznej, co

wykorzystuje się np. w przeciwdziałaniu odrzucaniu przeszczepów

Odpowiednio wyznakowane PM przecie miozynie próbuje się stosować do dokładnego

umiejscawiania zawału serca

Fragmenty Fab PM przeciw digoksynie znalazły zastosowanie do leczenia zagrażającego

życiu zatrucia glikozydami naparstnicy

2.IMMUNOTOKSYNY

Immunotoksyny

powstają przez połączenie chemicznego przeciwciała z

jakąś toksyną. Do produkcji I. zastosowano najskuteczniejsze toksyny: roślinne,

bakteryjne, grzybowe. Niektóre z nich, np. rycyna, dyfterotoksyna, wykazują

ogromną aktywność, gdyż do zabicia komórki zdolna jest nawet jedna

cząsteczka toksyny.

Do zastosowania I. należy:

-usuwanie komórek białaczkowych ze szpiku autogennego przed

przeszczepianiem

-leczenie nowotworów

Z PM przeciwnowotworowymi sprzęga się różne leki przeciwnowotworowe

lub enzymy mające właściwości aktywowania nieczynnego proleku w aktywny

lek przeciwnowotworowy.

Można również PM opłaszczać liposomy wypełnione odpowiednim lekiem i

PM naprowadzaja te liposomy do właściwych tkanek i komórek.

Z kolei PM przeciw włóknikowi połączone z aktywatorem plazminogenu

mogą znaleźć zastosowanie w likwidacji zakrzepów w naczyniach krwionośych.

3.KONIUGATY PM Z

RADIOIZOTOPAMI

Ogólnie do celów diagnostyki używa się koniugatów z radioizotopami

emitującymi cząsteczki gamma, a w terapii nowotworów koniugatów z

radioizotopamii emitującymi cząsteczki beta.

Do umiejscawiania nawet małych ognisk nowotworowych używa się PM

przeciwnowotworowych sprzężonych z radioizotopamii.Metoda ta umożliwia

wykrywanie rozmieszczenia w organizmie ognisk nowotworowych.

Opracowano bardzo czułą metodę śródoperacyjnego wykrywania przerzutów

nowotworowych w obrębie jamy brzusznej z użyciem ręcznie sterowanego

detektora promienni gamma. Można go przesuwać bezpośrednio po

powierzchni narządów wewnętrznych i wykrywać ogniska niewykrywalne

innymi metodami.

Przeciwciała sprzężane z radioizotopamii próbuje się również stosować do

leczenia nowotworów. Atutem ich, w przypadku prób leczenia nowotworów

litych, jest zdolność do zabijania komórek oddalonych nawet o kilkadziesiąt

pokładów komórek od miejsc ich wiązania.

4.PRZECIWCIAŁA O PODWÓJNEJ

SWOISTOŚCI

Przeciwciała o podwójnej swoistości można uzyskać sprzęgając

chemicznie dwa różne przeciwciała. Chemicznie można również połączyć

fragmenty Fab pochodzące od różnych przeciwciał.PPS można też

wyprodukoać w tzw. podwójnych hybrydach, czyli hybrydach hybryd

(kwadroma) . Powstaja one w procesie fuzji dwóch hybryd, z których

każda wytwarza PM innej swoistości. Każdy z dwóch fragmentów Fab

takiego przeciwciała wiąże inny antygen. Jeden fragment może np.

wiązać komórkę nowotworową, a drugi toksynę.

PPS próbuje się już stosować w klinice, m.in. do leczenia: raka jajnika,

sutka, glejaków, ostrej białaczki szpikowej.

PPS można również stosować w szczepionkach. Wówczas jeden fragment

Fab wiąże antygen, przeciw któremu chcemy immmunizować organizm,

a drugi fragment Fab jest skierowany przeciw komórkom prezentującym

antygen.Ułatwia to odpowiedź na dany antygen.

5.PRZECIWCIAŁA CHIMERYCZNE

Większość PM jest pochodzenia mysiego. Podawanie ich ludziom wywołuje odpowiedź

immunologiczną przeciw obcogatunkowemu białku, która ogranicza ich efektywność. Z pomocą

przyszła inżynieria genetyczna.

Można skonstruować geny immunoglobularne,których część V pochodzi od myszy, a część C od

człowieka.Udało się nawet otrzymać takie geny, których tylko sekwencje kodujące regiony

hiperzmienne pochodzą do myszy, a reszta genu od człowieka.

PM, których części zmienne łańcuchów H i L pochodzą od myszy, a części stałe od człowieka,

nazywamy tradycyjnie chimerycznymi, natomiast takie PM, których regiony hiperzmienne

pochodzą od myszy, a pozostałe sekwencje od człowieka, przyjęto nazywać „uczłowieczonymi” .

PCH nie wywołując przeciw sobie efektywnej odpowiedzi immunologicznej nie są szybko

eliminowane z krążenia. U ludzi znalazły one zastosowanie w :

-PCH anty-CD20 podaje się pacjentom z chłoniakami nieziarnyczymi
-otrzymano również PCH przeciw produktowi protoonkogenu HER-2/neu, który podlega

amplifikacji w niektórych nowotworach

6. PRZECIWCIAŁA

KATALITYCZNE

Choć w warunkach naturalnych przeciwciała nie spełniają funkcji enzymów,

to ich dopasowanie do antygenu przypomina dopasowanie enzymu do

substratu.

Udało się otrzymać przeciwciała, które stabilizują stan przejściowy

zmniejszając energię aktywacji danej reakcji chemicznej, przyspieszając ją

nawet milion razy. Noszą one nazwę abzymów lub przeciwciał katalitycznych.

Otrzymano już abzymy mające właściwości hydrolityczne (proteaz, lipaz), a

także zachowujące się jak specyficzne transferazy i ligazy.

Otrzymuje się je przez:

- uczulanie cząsteczek będącymi analogami stanu przejściowego określonej

reakcji chemicznej

- ukierunkowane mutacje w genach immunoglobularnych

7. PRZECIWCIAŁA

ANTYGENIZOWANE

Strategiczne znaczenie trzeciego regionu hiperzmiennego
łańcucha H immunoglobulin (CDR3) w wiązaniu antygenu
zależy m.in. od jego mobilności i dostępności do substancji
obecnych w roztworze, w którym znajduje się przeciwciało.

Okazało się, że jeżeli mało immunogenny epitop wbudować w
ten region, to staje się on bardziej immunogenny i skuteczniej
immunizuje zwierzęta.Takie przeciwciało z wbudowanym w
region CDR3 epitopem jakiegoś antygenu nazywamy właśnie
przeciwciałem antygenizowanym.

Otrzymuje się je wprowadzając do genu dla łańcuch ciężkiego
gen kodujacy dany epitop i uzyskuje ekspresję przeciwciała w
odpowiednich komórkach.

GŁÓWNE PROBLEMY TERAPII Z UŻYCIEM
PM

Mimo wielu zalet przeciwciał monoklonalnych ich użycie sprawia pewne

problemy. Wiąże się to z następującymi zagadnieniami:
ze względu na trudność w pozyskaniu i hodowli ludzkich linii szpiczakowych

oraz etyczne przeszkody w immunizacji ludzi do fuzji używa się komórek

mysich. Powoduje to, że produkowane są mysie przeciwciała, mogące

wywołać reakcję ludzkiego układu odpornościowego. Problem ten jest

rozwiązywany przez przeciwciała chimeryczne i "uczłowieczone". Próbuje się

także uzyskać transgeniczne myszy z wprowadzonymi ludzkimi genami dla

przeciwciał.
immunotoksyny mogą przypadkowo uszkadzać inne komórki organizmu, nie

tylko te, które są ich celem. Tutaj próbuje się unieszkodliwiać toksyny w ten

sposób, aby mogły działać jedynie na komórki, z którymi przeciwciało się

łączy swoiście. Stosuje się także immunotoksyny bazujące na przeciwciałach

o podwójnej swoistości, przeciwko np. dwóm różnym antygenom

nowotworowym.
przeciwciała monoklonalne są dużymi cząsteczkami i dlatego bardzo powoli

migrują do tkanek. Problem ten jest rozwiązywany przez próby wiązania

toksyn i leków z częściami zmiennymi przeciwciał.
otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych wymaga stosunkowo dużych

nakładów finansowych, jednak rozwój inżynieriigenetycznej z pewnością

doprowadzi do znacznego zmniejszenia kosztów.