Linie

komórkowe

Linia komórkowa

•Jest to populacja komórek

powstająca z hodowli
pierwotnej po pierwszym
pasażu

Pasażowanie

• Pasażowaniem nazywa się

przeniesienie komórek
z dotychczasowego
naczynia hodowlanego do nowego

• Pasażowaniu poddaje się komórki

przed osiągnięciem konfluencji

Konfluentna hodowla

•Konfluentną nazywa się

hodowlę, w której komórki
pokrywają ścisłą warstwą
całą powierzchnię dna
naczynia hodowlanego

Po 3 pasażu zwykle linia
komórkowa staje się stabilna,
co oznacza, że jej komórki mają
określone tempo proliferacji

Linia komórkowa ma zwykle
szybsze tempo wzrostu niż
hodowla pierwotna

Linie komórkowe uzyskane

z normalnych,

diploidalnych komórek i

tkanek

mogą być

hodowane tylko przez

określony

czas

Linie komórkowe uzyskane z
normalnych, diploidalnych
komórek i tkanek

posiadają

ograniczoną liczbę pokoleń
tzw. okres przeżycia – life –
span;

możliwa jest tylko

określona liczba pasaży

Linie komórkowe,

które mają

ograniczony czas

życia nazywa się

finite cell lines

Finite cell lines

• Rosną one przez konkretną

liczbę pokoleń, osiągając zwykle
od 20 – 80 podwojeń populacji

• Potem komórek nie da się już

dłużej pasażować i linia
komórkowa zamiera

Continuous cell lines – linie

ciągłe

• Istnieją takie rodzaje komórek, z

których można wyprowadzić linie
o
nieograniczonym czasie życia, czyli
tzw. linie ciągłe

• Są to komórki nowotworowe

izolowane z guzów

Komórki nowotworowe

izolowane z guzów

• Komórki te maja praktycznie

nieograniczoną zdolność
proliferacji i linie
uzyskane z tego typu komórek
można pasażować nieskończoną
liczbę razy

Krzywa wyprowadzania i wzrostu linii
komórkowej o ograniczonym czasie życia i
linii ciągłej

Ocena wzrostu komórek

w hodowli

• Cykl wzrostu komórek w hodowli

in vitro dzieli się na 3 fazy

»Faza

lag

»Faza

log

»Faza

stacjonarna

(plateau)

Faza lag

•Rozpoczyna się

bezpośrednio po pasażu,
po wysianiu komórek

Faza lag

• Jest to okres adaptacji komórek (dotyczy

to również hodowli pierwotnych), podczas

którego komórki odbudowują elementy

glikokaliksu, czyli warstwy pokrywającej

od zewnątrz błonę komórkową

• Warstwa ta jest złożona głównie

z łańcuchów oligo- i

polisacharydowych; zostaje zniszczona

przez trypsynę podczas pasażowania

Faza lag

•W tej fazie komórki

przyczepiają się i
rozpłaszczają (w procesie
tym bierze udział
cytoszkielet)

Faza lag

•Komórki w tej fazie nie

dzielą się, a nawet ich liczba
może maleć, bo część
komórek zniszczonych nie
przyczepia się i obumiera w
tej fazie

Faza lag

• Wzrasta ilość enzymów, głównie

polimeraz DNA

• Komórki wchodzą w fazę G1

• Długość fazy lag jest różna dla

różnych typów komórek

Faza lag

•W przypadku wzrostu

komórek linii ciągłych
rosnących w
zawiesinie nie ma tej fazy

Faza log – faza

logarytmicznego wzrostu

• Czas największego wzrostu

komórek

• Komórki dzielą się intensywnie

(w czasie mitozy stają się
okrągłe i odrywają się
od podłoża, a po podziale ponownie
się przyklejają)

Faza log – faza

logarytmicznego wzrostu

•Faza ta kończy się jednym

lub dwoma podwojeniami
populacji komórek i
osiągnięciem konfluencji

Faza log – faza

logarytmicznego wzrostu

• Komórki w tej fazie cechuje duża

żywotność i wysokie tempo
metabolizmu

• Długość fazy log zależy od

gęstości wyjściowe hodowli

Faza stacjonarna

(plateau)

•Komórki osiągają

konfluencję i
przestają się dzielić

Faza stacjonarna

(plateau)

• W przypadku komórek

prawidłowych oznacza to, że cała
dostępna powierzchnia naczynia
jest zajęta, a więc
dochodzi do zahamowania
kontaktowego wzrostu

Faza stacjonarna

(plateau)

• Część komórek zaczyna umierać,

więc ilość komórek prawie się nie
zmnienia, sporadycznie obserwuje
się jeszcze podziały komórkowe

• Taka sama liczba komórek

proliferuje i umiera

Faza stacjonarna

(plateau)

•Taka hodowla

najszybciej
wykorzystuje medium

Faza stacjonarna

(plateau)

• Komórki wówczas trzeba

koniecznie przepasażować,
bo dłuższe przetrzymywanie
komórek w konfluencji może
doprowadzić do
transformacji, albo do wyjścia
komórek z cyklu wejścia
w fazę G0

Komórek w fazie G

nie

da się pasażować, taka

hodowla obumiera

Najlepiej jest pasażować

komórki przed

osiągnięciem konfluencji,

czyli przy tzw.

semikonfluencji, kiedy

wciąż są one jeszcze w

fazie logarytmicznego

wzrostu

Banki linii komórkowych

• Na świecie istnieją tzw. BANKI

LINII KOMÓRKOWYCH, gzie
można zakupić wiele uzyskanych
i scharakteryzowanych linii
komórkowych

Banki linii komórkowych

• Europejska Kolekcja Hodowli

Komórkowych (ECAEE – The
European Collection of Cell
Cultures) – Wielka
Brytania, 1984

• Amerykańska Kolekcja Hodowli

Komórkowych (ATCC)

Przeciwciała

monoklonalne

Hybrydomy

• Powstają przez fuzję komórki

nowotworowej mysiej linii
szpiczaka z limfocytami B
pochodzącymi ze śledziony
myszy immunizowanej
określonym antygenem

Hybrydoma

• Dziedziczy

nieśmiertelność

, czyli

zdolność do stałej proliferacji po
komórce szpiczaka, natomiast

zdolność do produkcji przeciwciał

skierowanych przeciw
antygenowi, którym uczulono
myszy dziedziczy po uczulonym
limfocycie B

Otrzymywanie przeciwciał

monoklonalnych

• Swoistość

przeciwciał
określa limfocyt
B

• Komórka

szpiczaka nadaje
hybrydzie
nieśmiertelność

Wydajność metod (np. z

użyciem glikolu

polietylenowego PEG)

prowadzących do fuzji wynosi

1 – 3%, to znaczy, że

na 100 reagujących komórek

nie więcej niż 3 utworzą

hybrydę

Przeżycie komórek hybrydoma w

hodowli warunkuje dostarczenie

przez limfocyt B transferazy

fosforybozylu hipoksantyny

(HGPRT) lub kinazy tymidynowej

(TK), koniecznych do syntezy

DNA, a brakujących w komórkach

szpiczaka

Zastosowanie pożywek

selektywnych zawierających

hipoksantynę i tymidynę

pozwala na wzrost komórek

hybrydoma, natomiast komórki

szpiczaka i limfocyty B, które nie

podległy fuzji obumieraj

Komórki hybrydoma

proliferują nieograniczenie

długo w

hodowli, zachowując stałą

zdolność produkcji

określonego przeciwciała

Przeciwciała chimeryczne

• PM chimerowe mysio/ludzkie, w

którym tylko fragmenty F(ab)
pozostały mysie, natomiast
pozostała część cząsteczki
zawierająca zarówno fragmenty
łańcucha ciężkiego jak i lekkiego
pochodziła z cząsteczki
immunoglobuliny ludzkiej

Przeciwciało

chimeryczne

•Wykazywało dłuższy t

0.5

w krążeniu i
zmniejszoną
antygenowość

PM humanizowane

• Przeniesienie na cząsteczkę

ludzkiej immunoglobuliny
jedynie niewielkich fragmentów
części hiperzmiennej fragmentu
F(ab) mysiej immunoglobuliny
doprowadziło do powstania
humanizowanych PM

PM chimeryczne i uczłowieczone

PM ludzkie

• Są też sposoby uzyskiwania

ludzkich PM; jest to trudna
proceduta

• Hybrydyzacja z użyciem ludzkich

limfocytów B wiąże się z
trudnościami uzyskiwania
produkcji przeciwciał o wysokiej
selektywności

PM ludzkie

• Jedną z metod otrzymywania

ludzkich PM jest
wykorzystanie
transgenicznych szczepów
myszy

PM -

szczegółowo

• Uzyskiwanie PM

• Hodowla hybrydoma

• Oczyszczanie uzyskanych PM

Metoda uzyskiwania PM

• Uczulanie myszy i pobieranie

komórek śledziony

• Hodowla komórek plasmocytoma
• Przygotowanie roztworu PEG
• Przeprowadzenie fuzji komórek
• Podłoża selaktywne i ich działanie
• Selekcja klonów i kontrola

produkcji PM

Uczulanie myszy i

pobieranie komórek

śledziony

• Sposób uczulania zwierząt zależy

od typu antygenu, jego
antygenowości oraz
eksperymentalnych schematów
uczuleń wypracowanych w
danym laboratorium

Uczulanie myszy i

pobieranie komórek

śledziony

• Jako antygen stosuje się

zawiesinę wyizolowanych całych
komórek, które wykazują
ekspresję danej determinanty
(np. CD34, CD25), fragmentów
błony z danym
antygenem lub oczyszczony
antygen

Uczulanie myszy i

pobieranie komórek

śledziony

• Gdy antygenowość zawiesiny jest

wysoka to zwierzętom podaje się
dootrzewnowo przygotowaną
zawiesinę

• Jeżeli antygenowość np.

oczyszczonych antygenów jest niska,
to można wzmocnić odpowiedź
używając tzw. adjuwantów

Uczulanie myszy i

pobieranie komórek

śledziony

• Istnieje kilka różnych

adjuwantów; najczęściej
używany jest niepełny adjuwant
Freunda (lekka parafina i
emulgatory, tworzące po
procesie homogenizacji gęstą,
trwałą emulsję)

Uczulanie myszy i

pobieranie komórek

śledziony

• Adjuwanty spełniają rolę

depozytu antygenu, co zwiększa
antygenowość, jak i pozwala na
immunizację mniejszą ilością
antygenu (np. trudnego do
uzyskania)

Uczulanie myszy i

pobieranie komórek

śledziony

• Szczep mysi, który uczula się

antygenem powinien być
pokrewny lub ten sam, od
którego pochodzi linia
nowotworowa szpiczaka
(plasmocytoma) używana do
hybrydyzacji

Hodowla komórek

plasmocytoma

• Do hybrydyzacji wykorzystuje

się linie nowotworowe
szpiczaka (plasmocytoma lub
myeloma) mysiego

Hodowla komórek

plasmocytoma

• Linie te charakteryzują się

»Brakiem produkcji

patalogicznych
immunoglobulin
(paraprotein)

»Brakiem enzymu

transferazy fosforybozylu
hipoksantyny (HGPRT)
koniecznej do syntezy puryn

Hodowla komórek

plasmocytoma

• Brak produkcji paraprotein przez

komórki linii szpiczaka powoduje,
że komórki hybrydoma produkują
immunoglobuliny pochodzące
tylko z uczulonych
limfocytów B bez domieszki
paraprotein

Hodowla komórek

plasmocytoma

• Brak enzymu HGPRT pozwala na

wprowadzenie selektywnej pożywki
służącej do wyeliminowania z
hodowli niesfuzjowanych komórek
linii szpiczaka i pobudzenia wzrostu
komórek hybrydoma posiadających
ten enzym z materiału
genetycznego limfocytów B

Przygotowanie roztworu

glikolu polietylenowego

(PEG)

• Wykorzystanie glikolu

polietylenowego do fuzji opiera się
na jego właściwościach agregowania
komórek oraz modyfikowania błony
komórkowej tak, że w obrębie
warstw lipidowych tworzą się
cytoplazmatyczne mostki pomiędzy
komórkami

Przeprowadzenie fuzji

komórek

• Podstawowy cel fuzji komórek –

powstanie komórki
mieszańcowej, zawierającej
materiał genetycznych obu
partnerów

Przeprowadzenie fuzji

komórek

• Dziedziczy zdolność do produkcji

przeciwciał i do stałego wzrostu

• Fuzję komórek przeprowadza się

z udziałem PGE lub
przez elektrofuzję

Podłoża selektywne

• Eliminuje niesfuzjowane komórki

szpiczaka, które mogłyby
przerosnąć komórki hybrydoma

• Wspomagają proliferację

komórek hybrydoma, które
przeważnie mnożą się powoli i
słabo

Podłoża selektywne

• W technice tej wykorzystuje się

brak enzymu (HGPRT) w
komórkach szpiczaka nie
pozwalający im na wykorzystanie
hipoksantyny

Selekcja klonów i kontrola

produkcji PM

• Hodowla w miękkim agarze

polega na hodowli zawiesiny
komórek hybrydoma, a następnie
selekcji pojedynczych kolonii
hybrydoma

Selekcja klonów i kontrola

produkcji PM

• Metoda krańcowych rozcieńczeń

– polega na rozcieńczaniu
zawiesiny komórek hybrydoma,
tak aby w studzienkach były
pojedyncze komórki dające
początek koloniom (klonom)

Hodowla hybrydoma

• In vitro
• In vivo
• Hodowla laboratoryjna

i przemysłowa

Oczyszczanie uzyskanych

• Precypitacja z użyciem

siarczanu amonu

• Filtracja w żelu
• Chromatografia jonowymienna
• Chromatografia powinowactwa

Zastosowanie PM

• Do celów naukowych

• Do diagnostyki

»Niedobory odporności

pierwotnej i wtórnej

»Schorzenia nowotworowe

Zastosowanie PM

• Do leczenia

»Schorzenia

nowotworowe

»Transplantologia
»Schorzenia

autoimmunizacyjne

Zastosowanie PM

• Techniki badawcze

wykorzystujące PM

»Immunohistochemia
»ELISA (enzyme-linked

immunoabsorbent assy)

»RIA (radioimmuno assy)
»Cytometria przepływowa

Rituksymab

• Przeciweciało monoklonalne

przeciwko antygenowi CD20

• Zastosowanie: chłoniaki

nieziarnicze, samoistna plamica
małopłytkowa

Rituksymab – działania

niepożądane

• Zespół uwalniania cytokin

(manifestuje się dusznością,
skurczem oskrzeli, gorączką,
dreszczami i obrzękiem
naczynioruchowym

• Zespół rozpadu guza

Rituksymab – działania

niepożądane

• Zespół rozpadu guza – to

zagrażający życiu zespół
zaburzeń metabolicznych
wynikających z szybkiego
rozpadu komórek
nowotworowych

Zespół rozpadu guza

• Nagły rozpad komórek

nowotworowych powoduje
uwalnianie dużych ilości K

puryn pochodzących z kwasów
nukleinowych (metabolizowanych
w wątrobie do kwasu
moczowego) i
fosforanów

Rituksymab – działania

niepożądane

• Zespół rozpadu guza – to

zagrażający życiu zespół
zaburzeń metabolicznych
wynikających z szybkiego
rozpadu komórek
nowotworowych

Zespół rozpadu guza

• Skutkiem jest kwasica

metaboliczna, hiperkalemia,
hiperurykemia
i hiperfosfatemia

• Fosforany wiążą we krwi jony Ca

co prowadzi do hipokalcemii

Rituksymab – działania

niepożądane

• Zespół rozpadu guza – to

zagrażający życiu zespół
zaburzeń metabolicznych
wynikających z szybkiego
rozpadu komórek
nowotworowych

Zespół rozpadu guza

• Dochodzi do wytrącenia się

kryształów kwasu moczowego (w
cewkach nerkowych, cewkach
zbiorczych i drogach
moczowych) i Ca

(PO

)

cewkach nerkowych i w miąższu
nerek), czego skutkiem może być
ostra niewydolność nerek

Rituksymab – działania

niepożądane

• Reakcje anafilaktyczne

• Zaostrzenie choroby wieńcowej lub

niewydolności serca

• Zaostrzenie przewlekłego

wirusowego zapalenia wątroby typu
B prowadzące do ostrej
niewydolności wątroby

Rituksymab

• Przed podaniem leku zaleca się

premedykację z użyciem leku
przeciwgorączkowego
i
przeciwhistaminowego (np.
paracetamol i difenhydramina)
oraz rozważenie premedykacji
glikokortykosteroidami