Wzmacniacze i wyciszacze:

Elementy regulatorowe położone powyżej promotora podstawowego:

-Wyspa CpG:

*długość około 1 kpz

*region o długości min. 200 pz i z zawartością GC>50%

*około 56% genów człowieka posiada wyspy CpG

*wyspy CpG mogą podlegać metyzacji co prowadzi do inaktywacji genu:

-piętnowanie gametyczne

-inaktywacja chromosomu X u osobników żeńskich (XX)

Metylacja cytozyn w wyspach CpG hamuje ekspresję genu.

Wzór metylacji jest dziedziczony przez komórki potomne.

Utrzymywanie metylacji w kolejnym podziale komórki somatycznej – metylofransferaza (Dnmt1).

Transkrypcja zaczyna się przed kodonem startu translacji i kończy się za kodonem terminującym translację.

Sekwencje UTR:

-podlegają transkrypcji

-nie są wycinane podczas obróbki po transkrypcyjnej

-wyróżniane są sekwencje 5’-UTR i 3’-UTR

-nie podlegają translacji

Charakterystyka UTR:

-funkcja: udział w po transkrypcyjnej regulacji ekspresji (transport mRNA, efektywność translacji, lokalizacja mRNA w obrębie komórki, regulacja po transkrypcyjna za pośrednictwem microRNA)

-długość: 5’UTR: przeciętnie 100-200 nukleotydów

3’UTR: przeciętnie 200-800 nukleotydów

-zawartość: sekwencje niekodujące po stronie 5’ i 3’ a czasami eksony (początkowe i końcowe).

W sekwencji 5’UTR znajdują się ważne sekwencje, związane z inicjacją translacji.

uORF – może indukować przyłączenie rybosomów i własną translację – jednocześnie ograniczając translację właściwej ramki odczytu.

W regionie 3’UTR występują m.in. sekwencje zaangażowane w:

-poliadenylację mRNA

-interferencję RNA (oddziaływanie z cząsteczkami mikroRNA

Sekwencja sygnałowa poliadenylację:

-odpowiedzialna za dobudowanie sekwencji poli(A) do mRNA podczas transkrypcji

-zbudowane jest zazwyczaj: 5’-AAUAAA-3’

-występuje między 10 i 30 nukleotydem przed miejscem poliadenylacji

-za miejscem poliadenylacji występuje sekwencja powtarzalna GU

-Etapy poliadenylacji: przecięcie łańcuchowe mRNA i dobudowywanie Poli(A)

Interferencja RNA:

Cząsteczki mikroRNA (miRNA) mogą się wiązać z komplementarnymi sekwencjami w 3’UTR i przez to blokować wykorzystanie mRNA jako matrycy do translacji.

Wycinanie intronów:

-wymaga obecności specyficznych sekwencji na początku GU i końcu AG intronu

-koniec 3’ poprzedza trakt polipirymidowy (Py)n

-ok. 10-40 nt powyżej traktu (Py)n znajduje się sekwencja rozgałęzienia

ORF – otwarta ramka odczytu:

-początek- kodon ATG

-koniec – jeden z kodonów STOP (TAA, TAG lub TGA)

Metody i narzędzia wykorzystywane w genetyce molekularnej:

-enzymy restrykcyjne

-wektory

-rekombinacja molekularna

-klonowanie molekularne

Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne):

-występują w komórkach bakteryjnych i służą do obrony przed obcym DNA (np. bakteriofagi)

-rozcinają cząsteczkę DNA po rozpoznaniu charakterystycznej dla danego enzymu sekwencji.

Typy cięć przez endonukleazy:

-cięcie lepkie – powstanie jednołańcuchowych „ogonków” – sekwencje palindromowi np.: GAATTC/CTTAAG

-cięcie tępe – po cięciu powstają łańcuchy zakończone parą nukleotydów, np. CCCGGG/GGGCCC

Wektory:

Sekwencje DNA zdolna do replikacji w komórce gospodarza, która nadaje się do modyfikowania genomu komórki gospodarza oraz namnożenia (klonowanie molekularne) fragmentów DNA wprowadzonych do cząsteczki wektor.

Cechy dobrego wektora:

-posiadają miejsce rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne. Miejsca te nie występują w rejonie, którego uszkodzenie (wprowadzenie fragmentu DNA) powoduje uniemożliwienie replikacji

-posiadają tzw. silne promotory (wstawianie w ich sąsiedztwo obcego DNA umożliwia jego efektywną ekspresję)

-nie są zdolne do życia poza komórką gospodarza

-nie posiadają genów, które są szkodliwe

Rodzaje wektorów:

*wektory komórek prokariotycznych:

-plazmidy

-bakteriofagi

-kosmidy

-sztuczne chromosomy bakteryjne

*Wektory komórek eukariotycznych:

-sztuczne chromosomy drożdżowe

-sztuczne chromosomy ludzkie

Plazmidy - naturalne wektory komórek prokariotycznych.

Plazmid pUC19 jest powszechnie wykorzystywany do klonowania molekularnego.

Kosmidy – wektory utworzone na bazie plazmidów i bakteriofagów:

-sztuczny wektor zbudowany z połączenia sekwencji cos faga z sekwencja plazmidu

-sekwencja cos odpowiada za „zapakowanie” cząsteczki DNA do płaszcza białkowego

-po wprowadzeniu obcego DNA do kosmidu i w odpowiednich warunkach następuje wstawienie zrekombinowanego DNA do płaszcza białkowego.

BAC:

-wektor zbudowany na bazie plazmidu F występującego w komórkach E.coli

-plazmid F jest dużym plazmidem, który umożliwia włączenie dużych fragmentów DNA.

YAC:

-wektor zdolny do replikacji w komórkach drożdży (organizm eukariotyczny)

-składa się z sekwencji tworzących: centromer; telomery; miejsca inicjacji replikacji

HAC:

-zbudowane z sekwencji:

*centromerowej

*sekwencji telomerowej

*z sekwencji, w które można włączyć DNA

Pojemność wektorowa:

-plazmidy – do 10 kpz

-fagi – do 20 kpz

-kosmidy – do 45 kpz

-BAC – do 300 kpz

-YAC – do 5 Mpz

Rekombinacja molekularna:

-utworzenie przy pomocy narzędzi genetyki molekularnej cząsteczki DNA (lub RNA) składającej się z dwóch fragmentów pochodzących z różnych źródeł

*zrekombinowany wektor, to wektor do sekwencji którego włączono przy pomocy enzymów restrykcyjnych (oraz liagzy) obcą sekwencję DNA.

Klonowanie molekularne:

-technika, której celem jest produkcja dużej liczby kopii fragmentu DNA, w celu jego dalszego badania

-klonowanie molekularne prowadzi się w komórkach pro- lub eukariotycznych przy wykorzystaniu wektorów, w strukturę których wbudowano określony fragment DNA.

Uzyskanie wielu kopii określonego fragmentu DNA poprzez:

-jego wbudowanie w sekwencję DNA wektora (rekombinacja molekularnego)

-WPROAWADZENIE ZREKOMBINWOANEGO WEKTORA DO KOMÓRKI BIORCY

-namnożenie transformatorowej bakterii

-wyizolowanie zrekombinowanego plazmidu z hodowli transformowanych bakterii

-wycięcie klonowanego fragmentu z plazmidu przy pomocy enzymu restrykcyjnego

Geny selekcji i reporterowe:

Geny selekcyjne:

-kodują białka oporności na antybiotyki

-są wykonywane do identyfikacji klonów bakteryjnych, które zawierają zrekombinowany wektor

Gany selekcyjne:

-plazmid z genem oporności na antybiotyk i przez to bakterie stają się oporne na dany antybiotyk

-w obrębie genu oporności miejsce restrykcyjne, umożliwiające wbudowanie obcego DNA:

*plazmidy nie zrekombinowane – bakterie oporne na antybiotyk

*plazmid zrekombinowany – bakterie nie są oporne na antybiotyk

-fenotyp kolonii bakteryjnych umożliwia wskazanie klonów zrekombinowanych.

Fenotyp bakterii (wrażliwość na ampicylinę i tetracyklinę) w czterech możliwych sytuacjach:

-ani obce DNA, ani plazmid nie wniknęły do bakterii

-do bakterii wniknęło tylko obce DNA

-do bakterii wniknął nie zrekombinowany plazmid

-do bakterii wniknął zrekombinowany plazmid

Podwójna oporność na antybiotyki – metody replikacji:

-plazmid z genami oporności na amp. I tetr.

-dodanie wstawki

-powstają dwa rodzaje wektorów

Geny reporterowe:

-kodują białka, które mogą być łatwo zidentyfikowane

Np.:

-gen LacZ, wywodzący się od E.coli. którego produktem jest beta- galaktoza

-w normalnych warunkach enzym ten rozkłada laktozę

-jeśli w podłożu jest analog laktozy: