AMINOKWASY, BIAŁKA ENZYMY

1. Aminokwasy, peptydy i białka

• Budowa (wzory chemiczne aminokwasów), wiązanie peptydowe, struktury I-, II-, III- i IV- rzędowe, motywy i domeny funkcjonalne

• właściwości chemiczne: właściwości kwasowo-zasadowe, punkt izoelektryczny, techniki rozdziału

-aminokwasy uczestniczą w: przewodzeniu impulsów nerwowych, biosyntezie porfiryn, puryn, pirymidyn, mocznika

- polipeptydy: są hormonami, czynnikami uwalniającymii hormony, neuroprzekaźnikami

- człowiek jest w stanie syntetyzować 10 z 20 L-alfa-aminokwasów

- selenocysteina – powszechnie nazywany 21. aminokwas – NIE JEST określona przez trzyliterowy kodon

- w fizjologicznym pH (ok. 7,4), aa. występują w formie jonów obojnaczych

Wiązanie peptydowe

Wiązanie peptydowe wykazuje charakter częściowo podwójnego wiązania, powodujące koplanarność czterech atomów wiązania peptydowego (Harper s.24, ryc 3-4)

Struktura pierwszorzędowa – liczba i kolejność wszystkich reszt aminokwasowych w peptydzie
Inaczej – sekwencja aminokwasowa rozpoczynająca się od N-końcowej reszty aminokwasowej

np. Lys-Leu-Tyr-Gln ---> lizylo-leucylo-tyrozylo-glutamina

Końcówka –ina wskazuje, że grupa α-karboksylowa tego aminokwasu nie jest zaangażowana w tworzenie wiązania peptydowego

Rysowanie:
gr. aminowa umownie po lewej

Struktura drugorzędowa – wynika z pofałdowania polipeptydu w motywy strukturalne utrzymywane wiązaniami wodorowymi, takie jak helisa α, struktura β, skręty β i pętle

α-helisa
- prawoskrętna
- na jeden skręt przypada średnio 3,6 reszty aa.
- grupy R każdej reszty aminokwasowej wystają na zewnątrz
- stabilność zapewniona dzięki wiązaniom wodorowym utworzonym z O grupy karbonylowej i H grupy N-H wiązania peptydowego, czwartej z kolei reszty aminokwasowej

β-harmonijka
- struktura harmonijki
- stabilizowana wiązaniami wodorowymi podobnie jak w strukturze alfa, lecz tutaj wiązania tworzą się między sąsiednimi fragmentami struktury
- możliwe struktury równoległa (mostki rozmieszczone równolegle lecz skośnie, w różnych kierunkach) i antyrównoległa (mostki raz blisko, raz daleko od siebie, w przybliżeniu prostopadłe do szkieletu polipeptydowego), ryc. 5-5, s.42 Harper

Pętle i zgięcia

W przybliżeniu połowa reszt aminokwasowych w „typowym” białku globularnym występuje w helisach alfa i strukturach beta, a połowa w pętlach, zwrotach, skrętach, zgięciach itp.

Skręt β obejmuje cztery reszty aminokwasowe, z których pierwsza jest połączona wiązaniem wodorowym z czwartąz kolei, co skutkuje ostrym zwrotem o 180*.
W skrętach β występują często glicyna i prolina

Struktura trzeciorzędowa – określa związki między domenami struktury drugorzędowej. Określa jak drugorzędowe elementy struktury – helisy, pofałdowane kartki, zagięcia, skręty i pętle – układają się w przestrzeni trójwymiarowej tworząc domeny i jak te domeny są ułożone względem siebie.

Domena – fragment struktury białka wystarczający do pełnienia określonej funkcji chemicznej lub fizycznej, takiej jak wiązanie substratu lub innego ligandu.

Struktura czwartorzędowa – białek składających się z dwóch lub większej liczby łańcuchów polipeptydowych dotyczy relacji między tymi łańcuchami

Struktury wyższych rzędów (3- i 4-rzędowe) są stabilizowane przez:
- oddziaływania hydrofobowe; kierujące łańcuchy boczne hydrofobowych aminokwasów do wnętrza białka, osłaniając je od środowiska wodnego
- wiązania wodorowe
- mostki solne, między grupami karboksylowymi kw. asparaginowego i glutaminowego, a przeciwnie naładowanymi łańcuchami bocznymi uprotonowanych reszt lizyny, argininy i histydyny
- niektóre białka zawierają również wiązania dwusiarczkowe (S-S), łączące grupy tiolowe (sulfhydrylowe) reszt cysteinowych

Właściwości kwasowo-zasadowe

Aa. w środowisku wodnym są amfoteryczne.
- grupa aminowa nadaje aminokwasowi charakter zasadowy, ponieważ wiąże proton przechodząc w kation –NH₃
- grupa karboksylowa nadaje charakter kwasowy, dysocjuje bowiem uwalniając proton i przechodząc w anion –COO^-

Aa. mają właściwości buforujące – stabilizują pH:
- wprowadzone do roztworu jony H⁺ będą wiązane przez grupy –NH₂.
- dodanie zasady (OH^-) powoduje odłączenie protonów z grup –COOH. Odłączony H⁺ reaguje z OH^-. Powstaje H₂O. Wynika stąd, że aminokwas zobojętnia zarówno jony H⁺ i OH^-

Punkt izoelektryczny

pH, w którym aminokwas staje się jonem obojnaczym, wypadkowy ładunek elektrostatyczny = 0, a. nie porusza się w polu elektrycznym.
w pH=pI białka wykazują najmniejszą rozpuszczalność

pI dla aminokwasów niepolarnych wynosi ok. 6
pI dla aminokwasów polarnych z łańcuchem kwasowym wynosi ok. 3
pi dla aminokwasów polarnych łańcuchem zasadowym wynosi ok. 10

W roztworze kwaśnym (np. w pH 1) grupa aminowa jest protonowana (-NH³⁺) a grupa karboksylowa jest niezjonizowana (-COOH).

różowy - niskie pH
niebieski – obojętne pH
zielony – wysokie pH

Elektroforeza w pH 7,0 pozwala rozdzielić dwie cząsteczki o pI 6,0 i 8,0, ponieważ w pH 7,0 cząsteczka z pI=6,0 będzie mieć ładunek ujemny, a ta z pI=8,0 – ładunek dodatni.

Techniki rozdziału

elulat – wypłukiwana faza ciekła

chromatografia kolumnowa – upakowane w kolumnę małe kuliste ziarnka celulozy, akrylamidu lub krzemionki, której pow. została pokryta chemicznymi grupami funkcyjnymi.

chromatografia metodą filtracji żelowej - pozwala na rozdział cząsteczek na podstawie ich rozmiaru. Złożem są kuliste porowate ziarna, których pory stanowią analogię do zatoczek wzdłuż brzegu rzeki. Białka o promieniach Stokesa zbyt dużych, aby wejść w pory, pozostają w głównym strumieniu fazy ciekłej i są wypłukiwane wcześniej niż białka, które mogą się zatrzymać w porach. W ten sposób białka są wypłukiwane podczas filtracji żelowej w kolejności malejących promieni Stokesa.

2. Funkcje biologiczne aminokwasów, peptydów i białek:

• podział aminokwasów na egzogenne i endogenne, hydrofobowe i hydrofilowe, pochodne aminokwasów jako neurotransmitery i hormony

• peptydy biologicznie czynne (glutation, hormony, antybiotyki)

•  białka: strukturalne, enzymatyczne, transportowe,odpornościowe, hormony,  toksyny

• zależność między budową a funkcją białek na przykładzie

           białek fibrylarnych: kolagen, keratyna, elastyna, miozyna, oraz   

           białek globularnych: mioglobina i hemoglobina (allosteryczność, 

           efekt Bohra, regulatory allosteryczne, hemoglobiny patologiczne),

• białka osocza krwi i ich funkcje.

ENDOGENNE: Gly, Ala, Ser, Tyr, Cys, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro
EGZOGENNE: Val, Leu, Ile, Thr, Met, Arg, Lys, His, Phe, Trp,

Niepolarne: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro
(aa. tej grupy zawierają łańcuchy boczne bez grup funkcyjnych, nie oddają ani nie przyłączają protonów, nie uczestniczą w tworzeniu wiązań jonowych ani wodorowych. Są hydrofobowe; nie wiążą wody, mogą natomiast uczestniczyć w tworzeniu wiązań hydrofobowych).

Aminokwasy niebiałkowe obecne w organiźmie:

- β-alanina (składnik koenzymu A, produkt rozpadu pirymidyn)
- ornityna i cytrulina (metabolity cyklu mocznikowego)
- kwas γ-aminomasłowy (przekaźnik sygnałów w układzie nerwowym)
- tyroksyna i trijodotyronina (h. tarczycy)

Białka globularne – stosunek między najdłuższym a najkrótszym wymiarem nie przekracza 3

Mioglobina – magazynowanie tlenu jako rezerwy wykorzystywanej w warunkach jego niedoboru

- składa się w 75% z ośmiu prawoskrętnych helis α, oznaczonych literami A-H
- typowo dla białek globularnych powierzchnia mioglobiny jest polarna, natomiast wnętrze cząsteczki, zawiera, oprócz dwóch reszt, reszty niepolarne, jak Leu, Val, Phe i Met. Tymi dwoma hydrofilowymi resztami wewnętrznymi są His E7 i His F8, czyli siódma i ósma reszta aminokwasowa w helisach E i F, które znajdują się w pobliżu żelaza hemowego i biorą udział w wiązaniu tlenu
- w mioglobinie grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między helisami E i F
- atom żelaza (II) piątym wiązaniem koordynacyjnym wiąże się z atomem azotu pierścienia imidazolowego His F8, określanej mianem histydyny proksymalnej. Po drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje się His E7, określana jako histydyna dystalna
- mioglobina magazynuje, ale raczej nie transportuje tlenu, ponieważ szybko się tlenem wysyca. Przy pO₂ charakterystycznym dla pracujących mięśni, nie może służyć jako efektywny przenośnik.

Hemoglobina – białko erytrocytów przenoszące O₂ do tkanek i CO₂ oraz protony do płuc . Jest blokowana przez tlenek węgla

- h. ma nowe w stosunku do mioglobiny właściwości, które warunkują funkcję biologiczną – właściwości allosteryczne (Allosteria - (allos - inny; steros - przestrzeń) - zmiana powinowactwa chemicznego białka do cząsteczek (np. enzymów do substratów lub białek przenośnikowych do ich ładunku), przez zmianę struktury przestrzennej. Efekty allosteryczne odgrywają istotna rolę w regulacji aktywności enzymatycznej.)

- h. jest tetramerem

HbA α₂β₂ – podstawowa prawidłowa człowieka dorosłego
HbF α₂γ₂ – płodowa
HbA₂ α₂δ₂ – prawidłowa człowieka dorosłego, stanowiąca niewielki odsetek h. całkowitej
HbS α₂S₂ – sierpowatych krwinek czerwonych
- h. wiąże cztery cząsteczki O₂, po jednej na jeden hem
- przyłączenie O₂ przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych cząsteczek O₂ przez pozostałe grupy hemowe ---> połączenie łańcuchów polpeptydowych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina) pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedynczymi łańcuchami, wydajności dostarczania tlenu
(ryc 6-8 – s.58, harper)

- hemoglobina wiąże ok. 15% CO₂ transportowanego przez krew. Większość pozostałego CO₂ jest przenoszona w formie wodorowęglanu, powstającego w erytrocytach w wyniku uwodnienia CO₂ do kwasu węglowego (H₂CO₂) w reakcji katalizowanej przez anhydrazę węglanową. Przy pH charakterystycznym dla krwi żylnej H₂CO₃ dysocjuje do jonu wodorowęglanowego i protonu

- mioglobina i podjednostki β HbA mają praktycznie taką samą strukturę drugo- i trzeciorzędowe (mioglobina – monomer, hemoglobina – tetramer)

Przyłączenie O₂ przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych cząsteczek O₂ przez pozostałe grupy hemowe. Podczas utleniania kolejnych grup hemowych, dochodzi do rozrywania mostków solnych między podjednostkami hemoglobiny, a w konsekwencji do przejścia z formy T (taut- naprężona – o małym powinowactwie do tlenu) w formę R (relaxed – rozluźniona , o dużym powinowactwie do tlenu).

Prawdopodobieństwo przejścia struktury T w R zwiększa się wraz z utlenowaniem każdego hemu tetreamerycznej hemoglobiny. Przekształcenie to nie następuje z chwilą przyłączenia określonej liczby cząsteczek tlenu, lecz dokonuje się wraz z utlenowaniem kolejnych grup hemowych. Stopniowe przyłączanie tlenu powoduje pękanie i osłabianie mostków solnych łączących podjednostki w formie T.

Przejście między tymi formami pozostaje pod wpływem różnych czynników, takich jak: protony, ditlenek węgla, BPG (2,3-bisfosfoglicerynian); im większe stężenie tych czynników, tymwięcej tlenu musi zostać związane, aby zapoczątkować przekształcenie

RYC. 6-8, s.58 Harper

EFEKT BOHRA – jest to proces regulacji wiązania tlenu przez protony i dwutlenek węgla. Hemoglobina, w odpowiedzi na obecność CO₂ zmniejsza powinowactwo względem tlenu, co ułatwia uwalnianie O₂ w tkankach od dużym stężeniu CO₂.

BPG
- w warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwiększa się synteza BPG w erytrocytach
- łączy się z hemoglobiną (tylko w formie T) w stosunku 1 cz. BPG – 1 tetramer hemoglobiny
- przyłącza się za pośrednictwem mostków solnych, stabiliuje formę T
- BPG gorzej wiąże się z HbF, niż z HbA, dzięki czemu HbF ma większe powinowactwo do tlenu

Hemoglobiny patologiczne

Methemoglobina – zawiera Fe (III), co uniemożliwia wiązanie i transport O₂. W warunkach prawidłowych za redukcję Fe(III) do Fe(II) odpowiada reduktaza methemoglobinowa

Hemoglobina S – w łańcuchu beta, Glu zostaje zastąpiona przez Val. Zastąpienie polarnej reszty kw. glutaminowego niepolarną resztą waliny powoduje powstawanie lepkich miejsc . Łączą się one z deoksy Hb. Przy niskim pO₂, deoksy HbS polimeryzuje, tworząc włókna, które deformują erytrocyty do kształtu sierpowatego. Takie erytrocyty są bardziej podobne na lizę w zatokach śledzionowych. Leczenie – indukcja ekspresji HbF, prowadząca do zahamowania polimeryzacji HbS, transplantacja kom. macierzystych.

Talasemie – to niedokrwistości, których przyczyną jest upośledzenie syntezy łańcuchów alfa lub beta HbA

Białka fibrylarne (włókienkowe) – bardzo rozciągłe konformacje – stosunek osiowy ok. 10 lub większy. Np keratyna, elastyna, miozyna

- kolagen stanowi ponad 25% masy białek w organizmie ludzkim
- skóra zawdzięcza swoją wytrzymałość i elastyczność przeplatającej się sieci kolagenu i włókien keratynowych
- struktura kości i zębów jest podtrzymywana przez sieć włókien kolagenowych, położonych podobnie jak pręty stalowe w zbrojonym betonie.

Tropokolagen/Kolagen
- Tropokolagen składa się z trzech lewoskrętnych helis polipeptydowych, owijających się wzajemnie w prawą stronę, aby utworzyć potrójną helisę kolagenu.
- przeciwne skręcenia całej superhelisy i jej składników popileptydowych, powodują, że jest ona bardzo odporna na rozwijanie – podobnie jak liny stalowe stosowane w wiszących mostach
- glicyna jest co trzecią resztą aminokwasową występującą w helisie.
- kolagen obfituje też w prolinę lub hydroksyprolinę
- sekwencja kolagenu wygląda następująco: Gly-X-Y, gdzie Y to reszta proliny lub hydroksyproliny
- helisa kolagenowa utrzymywana jest przez wiązania wodorowe oraz kowalencyjne wiązania formowane między zmodyfikowanymi resztami lizyny, zarówno w obrębie jednego łańcucha, jak i między różnymi łańcuchami polipeptydowymi

GLUTATION (γ-glutamylocysteinyloglicyna)

Wyjątkowo Glu i Cys łączy nie- α-peptydowe wiązanie

3.

3. Potranslacyjne modyfikacje białek – glikacje, fosforylacje, acylacje;  

    białka złożone

- modyfikacje te poszerzają biologiczną różnorodność białek, zmieniając ich rozpuszczalność, stabilność i oddziaływania z innymi białkami

- w wyniku modyfikacji potranslacyjnych, wprowadzane są nowe grupy chemiczne lub są też usuwane zbyteczne elementy peptydowe

Glikacja – proces nieenzymatycznego przyłączenia węglowodanów do białek
Glikozylacja - proces enzymatycznego przyłączenia węglowodanów do białek
Fosforylacja – proces przeniesienia końcowej grupy fosforanowejz ATP na atom tlenu grupy hydroksylowej specyficznej reszty aminokwasowej,
Acylacja - chemiczna modyfikacja białek, w wyniku której rozpuszczalne białko cytoplazmatyczne uzyskuje hydrofobową kotwicę (acyl), która umożliwia zaczepienie białka w błonie. Przykładami acylacji mogą być reakcje mirystylacji i palmitylacji.

Białka złożone (proteidy) - związki białkowe zawierające w swojej strukturze oprócz podstawowego łańcucha białkowego (białko proste) także inne grupy, tzw. grupy prostetyczne.

Wyróżniamy:

• fosfoproteiny - zawierające w swojej strukturze resztę kwasu fosforowego, np. kazeina (białko występujące w mleku)

• glikoproteidy - zawierają cukrowce (tkanka okrywająca i płyny ustrojowe)

• chromoproteiny - zawierają część barwnikową (np. chlorofil albo hemoglobina)

• lipoproteiny - zawierające tłuszczowiec (błona komórkowa, osocze krwi)

• nukleoproteiny - związane z kwasem nukleinowym (podstawowa jednostka budująca DNA)

• metaloproteiny - związane z atomem/kationem metalu

4. Klasyfikacja enzymów – typy reakcji katalizowanych przez

    poszczególne klasy enzymów.

1. oksydoreduktazy (katalizują reakcje utleniania i redukcji)

2. transferazy (katalizują przenoszenie takich jednostek jak reszty glikozylowe, grupy fosforanowe, czy metylowe)

3. hydrolazy (katalizują hydrolityczne rozszczepienie wiązań C-C, C-O, C-N i innych)

4. liazy (katalizują rozszczepienie wiązań C-C, C-O, C-N i innych przez eliminację atomu i pozostawienie podwójnego wiązania)

5. izomerazy (katalizują geometryczne lub strukturalne zmiany w obrębie cząsteczki)

6. ligazy (katalizują wiązanie się dwóch cząsteczek połączone z hydrolizą ATP)

5. Budowa enzymów – zależność między budową i funkcją:

·         budowa części białkowej, centrum katalityczne,

·         kofaktory oraz witaminy będące ich prekursorami

·         swoistość działania enzymów,

·         aktywność całkowita i specyficzna, jednostki aktywności.

Wiele enzymów zawiera małe niebiałkowe cząsteczki i jony metali, które bezpośrednio uczestniczą w przyłączaniu substratu lub katalizie. Należą do nich grupy prostetyczne, kofaktory i koenzymy

Kofaktor – część niebiałkowa enzymy

Koenzym – to kofaktor słabo połączony z białkiem

Grupy prostetyczne są trwałym elementem struktury enzymu (w przeciwieństwie do koenzymów)

np. Hem, FMN, FAD, fosforan pirydoksalu, difosforan tiaminy, biotyna, jony metali Co, Cu, Mg, Mn i Zn

Enzym bez kofaktora to apoenzym, zaś katalitycznie aktywny enzym – holoenzym.

WITAMINY będące prekursorami kofaktorów:

wit	inne nazwy	jakiego kofaktora jest prekursorem
B1	tiamina	DPT(difosfotiamina)
B2	ryboflawina	FMN, FAD
B3	nikotynamid, witamina PP, niacyna	NAD^+, NADP^+
B9	kwas foliowy	koenzymy w metabolizmie ugrupowan jednoweglowych
X	kobamid
X	kwas pantotenowy	koenzym-A

Centrum aktywne enzymu – układ przestrzenny, złożonym z grup chemicznych aminokwasowych, w którym substrat wiąże się z enzymem

Model Koshlanda – zbliżenie substratów do enzymu indukuje zmianę konformacyjną, co można porównać do umieszczenia ręki w rękawiczce (ryc 7-5, s.67)

Aktywność enzymu - ilość substratu przemienionego w produkt w jednostce czasu przez określoną ilość enzymu [1 katal = il. enzymu w optymalnych warunkach przemieniająca 1 mol substratu w ciągu jednej sekundy]

Aktywność specyficzna enzymu – uwzględnia ilość białka w oznaczonej próbie. Jest miarą czystości enzymu. katal/kg, katal/mg

Specyficzność enzymu
I) grupowa – substratem są substancje o podobnej do siebie budowie
II) stereochemiczna – substratem jest substancja o ściśle określonej budowie przestrzennej

III) absolutna - substratem dla konkretnego enzymu jest jeden ściśle określony związek

 6. Mechanizmy działania enzymów:

·         mechanizmy działania chymotrypsyny i transaminaz,

·         typy katalizy enzymatycznej przy dwóch substratach.

- enzymy zwiększają szybkość reakcji co najmniej 10⁶ razy !!!
- enzymy nie zużywają się ani trwale nie zmieniają w wyniku udziału w reakcji

- enzymy są bardzo specyficzne w stosunku do katalizowanej reakcji, do substratów

mechanizm działania chymotrypsyny

Asp 102 - His 57 – Ser 195 <---> stanowią sieć przekazu ładunku – triadę katalityczną

W przypadku chmotrypsyny mamy do czynienia z katalizą kowalencyjną – czyli taką, w której zachodzi wiązanie kowalencyjne między enzymem i co najmniej jedynym substratem. Zmodyfikowany enzym staje się wtedy reaktantem, czyli substratem reakcji. Chemiczna modyfikacja jest przejściowa i po zakończeniu reakcji powraca do swojego oryginalnego stanu.

Etapy:

I - ???????????????????????????????????????????????????!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
II – grupa karboksylowa substratu białkowego tworzy wiązanie estrowe z grupą –OH seryny 195 białka enzymatycznego, histydyna 57 przejmuje proton z grupy –OH seryny
III – uprotonowana reszta histydyny 57 przekazuje proton na atom azotu wiązania peptydowego, prowadząc do jego rozpadu. Substrat rozpada się na dwa produkty
IV – Uwolniona grupa aminowa powstałego produktu łączy się wiązaniem wodorowym z histydyną 57 białka enzymatycznego, a grupa karboksylowa wiązaniem estrowym z grupą –OH seryny 195 tego samego enzymu
V- następuje acylacja białka enzymatycznego (reszty kwasowej przez białko)
VI – deacylacja enzymu – substrat zostaje skrócony o fragment peptydowy z grupą karboksylową uwolnioną z wiązania peptydowego

TYPY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ PRZY DWÓCH SUBSTRATACH

I. mechanizm sekwencyjny uporządkowany
Kolejność przyłączania dwóch substratów jest ściśle określona: najpierw przyłącza się substrat I, dopiero zmiany konformacyjne wywołane faktem umożliwiają dołączenie substratu II. Odłączenie produktów zachodzi również według określonej kolejności. Kolejność ta jest logiczną konsekwencją reakcji jakie miały miejsce. Np. dehydrogenaza mleczanowa

II. mechanizm sekwencyjny nieuporządkowany
Charakteryzuje go dowolność w uporządkowaniu substratów i odłączaniu produktów reakcji. Np. fosforylacja kreatyny

III mechanizm katalizy ping-pong
Najpierw łączy sę z enzymem substrat I, odłącza produkt I. Potem przyłącza substrat II, odłącza produkt II. Np. reakcja transaminacji

7. Kinetyka reakcji enzymatycznych – model Michaelisa – Menten:

·         szybkość reakcji (równanie kinetyczne; wartości V_max i K_M),

·         czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej,

·         rodzaje inhibicji odwracalnej (konkurencyjna, niekonkurencyjna), stała inhibitorowa (K_i), hamowanie nieodwracalne.

V_(i) – szybkość początkowa reakcji

jeżeli stężenie substratu dla typowego enzymu wzrasta, to V_i wzrasta dopóty, dopóki nie osiągnie maksymalnej wartości V_MAX. Dalsze zw. stężenia nie powoduje wzrostu V_i – enzym jest nasycony substratem. Krzywa obrazująca to hiperbola (ryc. 8-3). W warunkach nasycenia, V_i zależy jedynie od szybkości – i w ten sposób jest przez nią limitowana – z jaką produkt oddysocjowuje od enzymu, aby enzym mógł się łączyć z nadmiarem substratu

Równanie Michaelisa-Menten

/\v=v_i

v_i – początkowa szybkość reakcji
V_max – maksymalna szybkość reakcji
[S] – stężenia substratu
K_m – stała Michaelisa – odpowiada stężeniu substratu w którym V_i stanowi połowę szybkości maksymalnej (Vmax/2) osiągalnej przy danym stężeniu substratu

INHIBICJA

Kompetycyjna - inhibitory kompetycyjne są zwykle podobne do substratów. Efekty ich działania można osłabić podwyższając stężenie substratu. Najczęściej taki inhibitor przyłącza się do części miejsca aktywnego, blokując dostęp dla substratu. Np. malonian (analog strukturalny bursztynianu), hamuje działanie enzymu dehydrogenazy bursztynianowej (przekształcającej bursztynian w fumaran – ryc. 8-8, s86 harper). Inhibitor kompetycyjny nie ma wpływu na V_MAX ale zwiększa K_M

Niekompetycyjna – inhibitory niekompetycyjne, są zasadniczo różne od substratów, przyłączają się do enzymu w miejscu innym niż m. aktywne. Możliwe są zatem połączenia EI oraz EIS. Zwiększenie st. substratu nie zmi

Inhibicja nieodwracalna – W przytoczonych inhibicjach/\ enzymmoże być łatwo odzyskany przez usunięcie inhibitora z otaczającego środowiska. Wiele innych inhibitorów działa nieodwracalnie, chemicznie modyfikując enzym – np. metale ciężkie

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych:

Temperatura – jej podwyższenie zwiększa energię kinetyczną cząsteczek, przyspieszenie ich ruchu i w ten sposób częstości zderzeń. Energia cieplna może doprowadzić jednak do stanu, w którym struktura enzymu będzie zdenaturowana, czemu towarzyszyć będzie utrata aktywności katalitycznej.

Stężenie substratu – powoduje zwiększenie częstości zderzeń substratów

8. Enzymy allosteryczne:

·         kinetyka (wykres zależności V od [S] ),

·         zjawisko kooperatywności, efektory

·         mechanizm działania ( sekwencyjny i jednoprzejściowy).

Regulacja allosteryczna – polega na zmianie aktywności enzymatycznej poprzez oddziaływanie przez substancje na strukturę białka enzymatycznego.

Na przykładzie karbamoilotranserazy asparaginianowej ( katalizującej I etap syntezy pirymidyn)

Enzym ten katalizuje wiązanie karbamoilofosforanu z asparaginianem.

W wielu etapach pośrednich powstaje produkt końcowy – cytydynotrifosforan – CTP, który jest ujemnym efektorem allosterycznym enzymu.

CTP zmniejsza powinowactwo obu substratów do enzymu.

Krzywa zależności V do [S] z hiperbolicznego przekształca się w sigmoidalny.

ATP wywiera efekt odwrotny – jest dodatnim efektorem allosterycznym – zwiększa to powinowactwo.

ATP i CTP konkurują o wiązanie z miejscem regulacyjnym enzymu.

Karbamoilotransferaza asparaginianowa ma 6 podjednostek – 3 katalityczne i 3 regulacyjne.

Cząsteczka może występować w postaci zwartej (napiętej) T -mało aktywnej lub rozluźnionej R – bardziej aktywnej.

Efektory allosteryczne oddziaływują wyłącznie na podjednostki regulacyjne.

Aktywator allosteryczny przesuwa równowagę z formy T do R, a inhibitor allosteryczny z formy R do T

9. Regulacja metabolizmu poprzez kontrolę aktywności enzymów:

·         regulacja przez sprzężenie zwrotne

·         regulacja kowalencyjna

·         aktywacja proteolityczna na przykładzie proteaz trzustkowych

·          izoenzymy –  przykłady izoenzymów tkankowych i rozwojowych, znaczenie fizjologiczne zjawiska izoenzymii.

Regulacja przez sprzężenie zwrotne

Regulacja przez sprzężenie zwrotne nie jest synonimem hamowania przez sprzężenie zwrotne.

Np. cholesterol zawarty w diecie ogranicza syntezę cholesterolu w wątrobie. Ta regulacja na zasadzie sprzężenia zwrotnego nie polega jednak na hamowaniu przez sprzężenie zwrotne. Enzymem podlegającym regulacji w cholesterogenezie jest reduktaza HMG-CoA. Nie jest ona hamowana przez cholesterol, lecz cholesterol lub jego metabolit hamują ekspresję genu kodującego reduktazę HMG-CoA.

A—(enzym a)--> B –(enzym b)—> C –(enzym c)—> D

Enzym katalizujący pierwszy etap biosyntezy jest hamowany przez produkt końcowy (D blokuje „enzym a”) Mechanizm ten działa np w biosyntezie cholesterolu i nukleotydów pirymidynowych.

Regulacja kowalencyjna

Podstawowymi modyfikacjami kowalencyjnymi są swoista , organiczna proteoliza i fosforylacja. Pierwsza modyfikacja jest uznawana za nieodwracalną, ponieważ komórki nie mają możliwości odtwarzania zhydrolizowanego wiązania peptydowego i powtórnej syntezy białka ulegającego hydrolizie.

Łatwość z jaką komótki mogą przekształcać enzymy z formy defosforylowanej w fosforylowaną i odwrotnie sprawia, że fosforylacja-defosforylacja jest najczęstszym mechanizmem regulacji.

Fosforylacja może zwiększać lub zmniejszać aktywność enzymu. Niektóre białka enzymatyczne są aktywowane z udziałem kinaz białkowych. Źródłem reszt fosforanowych jest ATP, a miejscem ich wiązania są grupy –OH seryny, treoniny lub tyrozyny – wskutek czego tworzą się O-fosfoseryny,

O-fosfotreoniny i O-fosfotyrozyny.

Defosforylacja przez fosfatazę białkową inaktywuje enzym.

Np. aktywacja i inaktywacja fosforylazy glikogenowej

Fosforylacja i defosforylacja mogą wywierać skutki odwrotne do wyżej opisanych.
Np. kompleks dehydrogenazy pirogronianowej występuje w dwu postaciach: aktywnej (niefosforylowanej) i aktywnej (fosforylowanej)

Hamowanie przez sprzężenie zwrotne dotyczy pojedynczego białka i nie podlega regulacji hormonalnej ani nerwowej. Regulacja aktywności enzymów ssaków w wyniku fosforylacji i defosforylacji obejmuje wiele białek oraz ATP, a ponadto jest bezpośrednio kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy

Aktywacja proteolityczna

Proteazy - dokonują hydrolizy wiązania peptydowego. Syntetyzowane w postaci nieaktywnych prekursorów (proenzymów = zymogenów).

Przejście enzymu w aktywny enzym, wymaga odłączenia fragmentu cząsteczki, który hamuje powstawanie lub funkcjonowanie miejsca aktywnego.
W niektórych przypadkach zymogen staje się substratem dla powstałego z niego enzymu. Enzym powstały z zymogenu, staje się jego aktywatorem proteolitycznym.

Zjawisko aktywacji zymogenu przez aktywną postać enzymu nosi nazwę autoaktywacji lub autokatalizy.

Pepsyna – nie jest co prawda enzymem trzustkowym, bo żołądkowym – ale wartym uwagi. Zymogen pepsyny nazywa się pepsynogenem. Pepsynogen zawiera odcinek prekursorowy , usuwany spontanicznie w wyniku hydrolizy pod wpływem żołądkowego pH<5. Ujemnie naładowane grupy karboksylowe łańcuchów bocznych glutaminianu i asparaginianiu, zawarte w odcinku prekursorowym, tworzą wiazanie z dodatnio naładowanymi grupami aminowymi reszt lizyny i argininy nieaktywnej pepsyny. Kwaśne środowisko sprzyja protonacji grup karboksylowych. Grupy COO^- wiążą protony przechodząc w nie zdysocjowane grupy –COOH. Znikają ładunki ujemne w grupach bocznych glutaminianu i asparaginanu. Zostaje odsłonięte centrum aktywne enzymu, które hydrolizuje wiązanie peptydowe miedzy pepsyną a odcinkiem prekursorowym. Powstaje aktywna pepsyna.

Trypsyna – powstaje z trypsynogenu. Jest enzymem soku trzustkowego. Aktywowana przez enterokinazę (enzym wydzielany przez błonę dwunastnicy). Enterokinaza odłącza od trypsynogenu odcinek prekursorowy, powodując jego zmiany konformacyjne. Powstająca trypsyna staje się aktywatorem kolejnych cząsteczek trypsynogenu (autokataliza).

Chymotrypsyna - enzym trzustkowy. Syntetyzowana w postaci zymogenu – chymotrypsynogenu.

I] etap aktywacji zachodzi pod działaniem trypsyny i polega na hydrolizie wiązania peptydowego między aa. 15 i 16 – powstaje dwułańcuchowa chymotrypsyna π zespolona mostkami dwusiarczkowymi. Jest to enzym w pełni aktywny, lecz mało stabilny.

II] W wyniku autokatalizy, pod wpływem chymotrypsyny, następuje odcięcie wycięcie dwu peptydów:
a) dipeptyd Ser-Arg 14-15, powstaje chymotrypsyna δ (dwułańcuchowa)
b)następnie odłączenie Thr-Asn 127-148, powstaje trójłańcuchowa chymotrypsyna α

Swoista, ograniczona proteoliza chymotrypsyny umożliwia utworzenie centrum katalitycznego, którego trzy reszty aminokwasowe, tzw. triada katalityczna Ser-His-Asp, uczestniczą w przekazywaniu protonu. Mimo, że His 57 i Asp 102 są w łańcuchu B, a Ser 195 w łańcuchu C, to jednak w wyniku ich zbliżenia tworzy się miejsce katalityczne zdolne do oddziaływania z substratem.

Synteza i wydzielanie enzymów hydrolitycznych w postaci zymogenów, ma głęboki sens biologiczny. Dzięki temu enzym nie pełni swoich funkcji katalitycznych w komórce syntetyzującej. Chroni to komórkę i cały narząd (żołądek, trzustkę) przed samouszkodzeniem.

Wydzielanie enzymów działających okresowo w formie nieaktywnej gwarantuje ich szybkie uruchomienie w chwili zapotrzebowania na nie

Izoenzymy stanowią odmienne formy enzymu, które katalizują tę samą reakcję chemiczną. Mogą wykazywać subtelne różnice we właściwościach, takich jak wrażliwość na poszczególne czynniki regulatorowe lub powinowactwo do substratów, co adaptuje je do specyficznych tkanek lub warunków.

Pewne izoenzymy mogą ułatwiać przeżycie organizmu, dostarczając rezerwowych kopii podstawowego genu.

Izoenzymy – inaczej - to enzymy katalizujące te same reakcje, ale różniące się nieznacznie budową pierwszorzedową, co ma podłoże genetyczne. Izoenzymy różnią się właściwościami, takimi jak optimum pH, optimum temperaturowe, reaktywność immunologiczna, K_M,V_MAX. Izoformy jednego enzymu umożliwiają przeprowadzenie tej samej reakcji biochemicznej w odmiennych warunkach środowiska panujących w różnych tkankach i różnych okresach rozwoju danego organizmu.

Izoenzymy mogą różnić się między sobą ze względu na:
a) ruchliwość elektroforetyczną,

b) powinowactwo do substratu i koaktorów

c) lokalizację w organizmie

d) właściwości immunologiczne

e) odpowiedź na czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, pH, działanie hormonów, pożywienia i inne

Izoenzymy dzieli się pod kątem lokalizacji, a także okresu życia w którym występują. Wyróżnia się:

1/ izoenzymy tkankowe (narządowe) – w różnych narządach pojawia się enzym o tej samej specyficzności, ale różniący się wyżej wymienionymi cechami.

Np. dehydrogenaza mleczanowa katalizująca odwracalnie redukcję pirogronianu do mleczanu/ obecna w mięśniach określono M₄ a w sercu H₄.

M₄ ma większe powinowactwo do pirogronianu w porównaniu z mleczanem. Preferowanym kierunkiem reakcji katalizowanej jest więc redukcja pirogronianu do mleczanu.

H₄ ma niskie powinowactwo do pirogronianu, a wysokie do mleczanu. Kierunkiem reakcji katalizowanym przez ten izoenzym jest utlenianie mleczanu. Gdy przeanalizuje się funkcję i warunki w jakich pracują mięśnie szkieletowe i mięsień sercowy, można stwierdzić, że nastąpiło przystosowanie do warunków: mięsień sercowy jest w warunkach fizjologicznych prawidłowo zaopatrzony w tlen, a więc najefektywniejszym działaniem jest wykorzystanie mleczanu przez jego utlenienie. Natomiast w mięśniach szkieletowych – często niewystarczająco zaopatrzonych w tlen, okolicznością dzięki której mięsień może jeszcze funkcjonować jest powstawanie mleczanu i przez to regeneracja zredukowanego NAD⁺/NADH/

2/ izoenzymy komórkowe – w mitochondriach i cytoplazmie wykrywa się enzym o jednakowej specyficzności, ale różnych właściwościach

3/ izoenzymy rozwojowe – enzym wydzielony z płodu, różni się od enzymu katalizujący identyczny proces metaboliczny, ale wydzielonego z materiału pochodzącego z materiału pochodzacego od osobnika dojrzałego

10. Znaczenie diagnostyczne pomiarów aktywności enzymów     (LDH, fosfatazy kwaśne i zasadowe, transaminazy).

 

Analiza pewnych enzymów pomaga w diagnozowaniu. Obecność enzymów wskaźnikowych we krwi jest wskaźnikiem uszkodzenia komórek, w których zostały zsyntetyzowane.

Enzymy osocza wykorzystywane w diagnostyce klinicznej:
- AspAT (aminotransferaza asparaginianowa) ---> zawał serca
- AlAT (aminotransferaza alaninowa) ---> wirusowe zapalenie wątroby
- LDH (dehydrogenaza mleczanowa) ---> zawał serca
- CK (kinaza kreatynowa) ---> choroby mięśni i zawał serca
- fosfatazy kwaśne ---> rak gruczołu krokowego z przerzutami
- fosfatazy zasadowe ---> różne choroby kości, choroby wątroby z utrudnionym odpływem żółci

Określone szlaki kataboliczne i anaboliczne zachodzą w określonych przedziałach (kompartmentach) komórkowych.

Enzymy degradujące białka i polisacharydy znajdują się w lizosomach.

Biosynteza kwasów tłuszczowych zachodzi w cytozolu.

Utlenianie kwasów tłuszczowych odbywa się w mitochondriach.

Przekaźnikiem pierwotnym (pierwszego rzędu) jest hormon lub impuls nerwowy.

UBIKWITYNA s.94