Mikroskop elektronowy

1. Ogólne informacje

Naukowcy zajmujący się badaniem mikroświata konstruowali na początku naszego wieku coraz dokładniejsze mikroskopy optyczne. Niestety pojawił się niemożliwy do obejścia problem. Okazało się, że pomimo budowania coraz lepszych mikroskopów nie można było dokładnie zobaczyć obiektów o rozmiarach mniejszych niż kilka dziesiątych części mikrometra (mikrometr to 0,000001 metra). Jest to spowodowane jednym ze zjawisk związanych z falową naturą światła. Zjawiskiem tym jest dyfrakcja. W momencie, gdy odległości pomiędzy obserwowanymi obiektami stają się bliskie długości fali świetlnej obrazy tych obiektów zaczynają się ze sobą zlewać. Oczywiście zmniejszając długość fali padającej i odbijającej się od obserwowanych obiektów, możemy dostrzec więcej jego szczegółów. Niestety dysponując mikroskopem optycznym możemy zmniejszać długość fali tylko do pewnych granic (jak pewnie pamiętasz najkrótszym falami z przedziału widzialnego są fale związane ze światłem fioletowym). Ograniczenie to przez długi czas uniemożliwiało obserwacje bardzo małych obiektów. Było tak aż do lat 30-stych XX wieku, kiedy to skonstruowano pierwszy mikroskop elektronowy.

Mikroskop elektronowy - mikroskop wykorzystujący do obrazowania wiązkę elektronów, który pozwala na dostrzeganie obiektów nawet milion razy cieńszych niż ludzki włos (0,1 nm). Podstawowym parametrem mikroskopu jest zdolność rozdzielcza, która określa rozmiary najmniejszych szczegółów jakie da się dostrzec w badanej próbce. Zdolność rozdzielczą mikroskopu optycznego ogranicza dyfrakcja (zjawisko fizyczne zmiany kierunku rozchodzenia się fali) promieni tworzących obraz. Im mniejsza jest długość fali, tym mniejszy obiekt można obserwować. Granica rozdzielczości mikroskopu optycznego wynosi około 200 nm (z wyjątkiem SNOM). Mikroskop elektronowy pozwala badać strukturę materii na poziomie atomowym. Dzięki niemu możliwa jest obserwacja organelli komórkowych i wirusów. Próbka znajduje się w próżni i najczęściej jest pokrywana warstewką metalu. Wiązka elektronów przemiata badany obiekt i trafia do detektorów. Urządzenia elektroniczne odtwarzają na podstawie zmierzonych sygnałów obraz badanej próbki. Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruował w 1931 roku Ernst Ruska razem z Maksem Knollem w Berlinie.

Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruował w 1931 roku Ernst Ruska razem z Maksem Knollem w Berlinie. Na Uniwersytecie w Aberdeen George Paget Thomson przepuścił wiązkę elektronów przez cienką folię metalową i zaobserwował obrazy dyfrakcyjne fal materii. W Laboratoriach firmy Bell Clinton Joseph Davisson i Lester Halbert Germer prześwietli wiązką elektronów próbkę kryształu uzyskując obrazy dyfrakcyjne. W roku 1937 Thomson i Davisson wspólnie otrzymali za swoje prace Nagrodę Nobla z fizyki.

Za pomocą mikroskopów elektronowych uzyskuje się niezwykle efektowne obrazy praktycznie we wszystkich dziedzinach nauki. Ograniczeniem jest jednak konieczność wykonywania pomiaru w próżni (problem w przypadku próbek biologicznych) oraz przewodnictwo elektryczne próbki. W przypadku mikroskopii transmisyjnej wykonuje się tzw. repliki: próbkę badaną napyla się (w tzw. napylarce próżniowej) cienką warstwą metalu (najlepiej złotem) a następne usuwa oryginalną próbkę i wykonuje obraz repliki. W przypadku mikroskopii skaningowej próbkę również napyla się metalem, ale nie trzeba usuwać próbki właściwej. Zaletą tak uzyskanych zmodyfikowanych próbek jest ich trwałość i możliwość powtarzania obrazowania, co nie zawsze możliwe jest w innych metodach mikroskopowych.

1. Typy mikroskopów elektronowych

Elektronowy mikroskop transmisyjny

Elektronowy mikroskop transmisyjny rejestruje elektrony przechodzące przez próbkę. Próbka w takim mikroskopie musi być cienką płytką o grubości mniejszej od 0,1 mikrometra. Przygotowanie takiej próbki jest trudne i znacznie ogranicza zastosowania mikroskopu.

Najważniejszym elementem mikroskopu elektronowego jest kolumna mikroskopu, która zawiera działo elektronowe wytwarzające (np. w wyniku termoemisji) wiązkę elektronów. Wstępnie uformowana wiązka elektronów w obszarze pomiędzy katodą i anodą zostaje rozpędzona. Zwiększenie napięcia pozwala na zwiększenie pędu elektronów, co zmniejsza długości fali. Aby elektrony mogły przebyć drogę od działa elektronowego do ekranu konieczne jest utrzymywanie w kolumnie bardzo dobrej próżni. Soczewkom optycznym odpowiada odpowiednio ukształtowane pole magnetyczne zmieniające bieg elektronów w cewkach ogniskujących. Istotną zaletą soczewek magnetycznych jest możliwość płynnej zmiany ich ogniskowych poprzez regulację natężenia prądu przypływającego przez soczewkę.

Komórka Bacillus subtilis. Zdjęcie wykonano mikroskopem transmisyjnym.

Gdy rozpędzona wiązka elektronów pada na preparat zachodzi szereg efektów, które są wykorzystywane w różnych urządzeniach badawczych. W przypadku dostatecznie cienkich preparatów część elektronów przechodzi przez preparat i jest wykorzystywana w transmisyjnych mikroskopach elektronowych. Elektrony mogą być odbite od preparatu lub mogą wybijać z preparatu elektrony zwane wtórnymi. Te dwa rodzaje elektronów wykorzystuje się w mikroskopach odbiciowych. Elektrony padające na preparat mogą ponadto wzbudzać elektrony atomów badanej próbki, które następnie emitują rentgenowskie promieniowanie charakterystyczne dla atomów próbki. Wiele mikroskopów elektronowych, zarówno transmisyjnych jak i skaningowych, wyposażonych jest w spektrometr(y) EDS i/lub WDS, pozwalające na wykonanie analizy składu chemicznego próbki.

Wiązka elektronowa po przejściu przez preparat może być kształtowana podobnie jak promienie świetlne, z wykorzystaniem układu obiektyw - okular. W przypadku elektronów zamiast szklanych elementów optycznych wykorzystywane są cewki zmieniające bieg naładowanych cząstek. Mikroskop może pracować w trybie obrazu wówczas wiązka tworzy obraz preparatu na detektorze. Mikroskop pracujący w trybie dyfrakcji może nie mieć cewek obiektywu i okulary, obraz tworzą elektrony w wyniku zjawiska dyfrakcji na strukturze próbki. W pierwszych konstrukcjach detektor był ekranem elektronoluminescencyjny (obecnie też stosowane), w obecnych konstrukcjach detektor w postaci matrycy CCD, pobudzanej elektronami, umożliwia odczytanie obrazu jako sygnałów elektrycznych, a odpowiednia aparatura pomiarowa pozwala na zapisywanie informacji i tworzenie obrazu próbki. 

Elektronowy mikroskop skaningowy

Elektronowy mikroskop skaningowy (SEM - Scanning Electron Microscope) jest przyrządem, rodzajem mikroskopu elektronowego, w którym obraz uzyskiwany jest w wyniku "bombardowania" próbki wiązką elektronów, która skupiona jest na przedmiocie w postaci małej plamki. Wiązka omiata obserwowany obszar linia po linii. Układ rejestruje elektrony odbite, przechodzące przez próbkę lub elektrony wtórne emitowane przez próbkę w wyniku pobudzenia próbki przez elektrony wiązki.

Pierwsze konstrukcje mikroskopu były prostymi konstrukcjami elektronooptycznymi (patrz schemat), obecnie są rozwiniętymi systemami badawczymi, do analizowania własności elektronów oraz promieniowania elektromagnetycznego emitowanego w wyniku bombardowania próbki elektronami. Stosuję się w nich metody wypracowane przez tomografię komputerową do tworzenia obrazów, spektroskopię elektronową i fal elektromagnetycznych.

Zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego jest znacznie większa od mikroskopu optycznego zależy głównie od wielkości plamki wiązki elektronowej na próbce. Tak samo jak w mikroskopie optycznym również w mikroskopie elektronowym, poza ograniczeniem technicznym (dokładność wykonania układu) istnieje ograniczenie fizyczne ograniczające zdolność rozdzielczą wynikające z dyfrakcji fali fali de Broglie'a elektronów

Pyłek kwiatowy, ziarna pyłku - męskie elementy rozrodcze występujące u roślin nasiennych wytwarzane w komorach pyłkowych pylników z tkanki archesporialnej. Na zdjęciu widoczne ziarna pyłku różnych gatunków.

Płatek śniegu widoczny pod mikroskopem SEM

 

Skaningowy mikroskop tunelowy

Skaningowy mikroskop tunelowy (STM od ang. Scanning Tunneling Microscope) - rodzaj SPM, mikroskopu ze skanującą sondą (ang. Scannning Probe Microscope) - umożliwia uzyskanie obrazu powierzchni materiałów przewodzących ze zdolnością rozdzielczą rzędu pojedynczego atomu. Uzyskanie obrazu powierzchni jest możliwe dzięki wykorzystaniu zjawiska tunelowego, od którego przyrząd ten wziął swoją nazwę. Ten sam skrót używany jest do określenia gałęzi mikroskopii - STM (ang. Scanning Tunneling Microscopy).

Możliwości STM w zakresie obrazowania zapoczątkowały burzliwy rozwój nowej dziedziny zwanej mikroskopią sond skanujących (inna nazwa to - skaningowa mikroskopia bliskich oddziaływań). Skonstruowano różne odmiany mikroskopów STM i AFM spośród których najbardziej znane to: mikroskop sił tarcia (FFM od ang. Friction Force Microscope), mikroskop optyczny bliskiego pola (SNOM lub NSOM od ang. Scanning Near-field Optical Microscope), mikroskop sił magnetycznych (MFM od ang. Magnetic Force Microscope) i mikroskop sił elektrostatycznych (EFM od ang. Electrostatic Force Microscope).

1. Budowa

Schemat układu optycznego prostego mikroskopu elektronowego 

Na schemacie oznaczono literami: 

K1, K2 – soczewki kondensorowe, 

P – preparat, 

Ob – soczewka obiektywowa, 

P – soczewka pośrednia, 

Pr – soczewka projekcyjna, 

E – ekran pokryty luminoforem, 

F – kaseta z kliszami fotograficznymi, 

V – zawory próżniowe

 

Wszystkie cząsteczki cechują się dualną naturą. Dotyczy to oczywiście i elektronu. Z cząsteczką tą związana jest pewna fala. Jej długość zależy od prędkości elektronu - maleje wraz ze wzrostem prędkości. Możliwe jest uzyskanie elektronów, z którymi związana jest fala o kilka rzędów wielkości mniejsza od najkrótszych fal świetlnych. Wiązkę elektronów możemy wykorzystać podobnie jak wiązkę światła. Przyśpieszamy najpierw elektrony do dużych prędkości, a następnie kierujemy je na bardzo cienką próbkę badanego materiału, przez którą przechodzą. Teraz wiązka elektronów wpada w obszar pola elektromagnetycznego. Pole to spełnia taką samą rolę jak soczewki w mikroskopie optycznym. Za obszarem pola w pewnej od niego odległości znajduje się ekran fluorescencyjny, który świeci pod wpływem padający nań elektronów. Tworzony jest na nim powiększony obraz próbki, przez którą przeszła wiązka.

Oczywiście przytoczony powyżej opis mikroskopu elektronowego jest bardzo uproszczony. Jednak daje on pewne pojęcie o tym jak działa to urządzenie. Dzisiaj przy pomocy urządzenia tego typu udaje się uzyskać obraz powiększony nawet 1 000 000 razy.

Oprócz mikroskopu elektronowego naukowcy stworzyli wiele innych skomplikowanych przyrządów służących do "podglądania" świata w skali mikro. Powstały więc mikroskopy jonowe (dzięki nim właśnie po raz pierwszy uzyskano obraz, który odpowiadał pojedynczym atomom), elektronowy mikroskop skaningowy, mikroskop tunelowy (skonstruowany dopiero na początku lat osiemdziesiątych pozwala osiągnąć rozdzielczość rzędu 0,1 nanometra). Pozwalają one na coraz dokładniejsze obserwacje świata atomów i cząsteczek.

1. Działanie

Zasada działania mikroskopu elektronowego transmisyjnego.

Wykorzystywana jest tutaj wiązka elektronów, która przechodząc przez preparat tworzy obraz jego struktury wewnętrznej. Granica rozdzielczości wynosi w tym przypadku nawet 0,15 nm. Źródłem elektronów jest katoda wolframowa, natomiast cały system oświetlający składa się z trójelektrodowej wyrzutni elektronowej zawierającej katodę, cylinder Wehnelta oraz anodę. Katoda pozostaje pod wysokim ujemnym potencjałem w stosunku do uziemionej anody. Napięcie przyspieszające w TEM wynosi zwykle od 20 do 100 kV. Wyrzutnia elektronowa współpracuje z soczewką magnetyczną, zwaną kondensorem, przy czym może być to układ podwójny składający się z soczewki krótkoogniskowej i długoogniskowej. Zadaniem tego układu jest skupianie opuszczających działo elektronów. Powstaje więc wiązka elektronów, która prześwietla preparat, a następnie trafia w obręb działania pól soczewek elektronowych obiektywu i projektora. Powiększająca soczewka obiektywu wytwarza obraz pośredni w płaszczyźnie przedmiotowej drugiej soczewki (projektora), której zadaniem jest wytworzenie obrazu końcowego widocznego na ekranie pokrytym luminoforem. Obraz jest ostatecznie rejestrowany na płycie lub błonie fotograficznej. Mikroskop elektronowy pracuje w warunkach wysokiej próżni.

Zasada działania mikroskopu elektronowego skaningowego.

Źródłem elektronów jest tu także katoda wolframowa. Przyspieszone elektrony przechodzą przez otwór w anodzie, a następnie biegną przez pierwszą soczewkę redukcyjną, służącą do skupiania linii sił pola. W odróżnieniu od TEM pierwsza soczewka, zamiast tworzyć powiększony obraz redukuje wymiary źródła elektronów. Kolejne soczewki magnetyczne powodują jeszcze większą redukcję źródła (do 5000 razy). Dodatkowo biegnąca między soczewkami wiązka elektronowa poddawana jest działaniu pola magnetycznego, które powoduje jej odchylenie, w wyniku czego wiązka dokonuje analizy liniowej powierzchni badanego preparatu powodując wybicie elektronów wtórnych. Elektrony wtórne przyspieszane i wzmocnione przez kolektor są wykorzystywane jako sygnał dający informacje o danym punkcie preparatu. Sygnał ten trafia na siatkę sterującą lampy obrazowej monitora. SEM daje w porównaniu do TEM większą głębię ostrości, co pozwala na badanie preparatów o nierównej powierzchni. Jednak należy też zauważyć, iż mimo wszystko ma on gorsze zdolności rozdzielcze (około 10 nm).

Przygotowanie materiału biologicznego.

Materiał biologiczny przed analizą jego ultrastruktury w mikroskopie elektronowym wymaga odpowiedniej preparatyki. Małe obiekty, takie jak wirusy czy też cząsteczki chemiczne można badać po zastosowaniu cieniowania lub barwienia negatywowego, natomiast duże struktury wymagają zastosowania bardziej skomplikowanej techniki ultraskrawania, ewentualnie wykonania repliki powierzchniowej.

Przygotowanie małych obiektów biologicznych:

• Cieniowanie - technika wykorzystująca metal ciężki, który zazwyczaj wyparowuje z punktowego źródła i pada skośnie na powierzchnię pokrytą fragmentami badanej próby.

• Wybarwianie negatywne - polega na uwidacznianiu obrysów cząstek przez ich zatapianie w materiale gęstym elektronowo (np. kwas fosforowolframowy). Badane cząstki są wtedy widoczne jako obszary jasne na względnie ciemnym tle.

Przygotowanie dużych obiektów biologicznych:

• Replika powierzchni - wykonywana jest przez napylenie na powierzchnię obiektu w warunkach próżni cienkiej warstwy łatwo przylegającego materiału o niskiej masie cząsteczkowej, np. węgla. Powstały w ten sposób bardzo cienki odcisk zdejmuje się, a następnie nakłada na zwykłą siateczkę mikroskopową.

• Ultraskrawanie - jest to najbardziej użyteczna i najczęściej stosowana metoda. Polega ona na wykonaniu ultracienkich skrawków po uprzednim utrwaleniu materiału. Skrawki te poddaje się następnie kontrastowaniu.

W przypadku mikroskopu elektronowego skaningowego sposób przygotowywania preparatów jest różny w zależności od rodzaju badanego materiału. Wymagane jest aby powierzchnia preparatu przewodziła ładunek elektryczny, co uzyskuje się poprzez napylenie na nią cienkiej warstwy (ok. 20 nm) metalu ciężkiego (złota, palladu, srebra, chromu lub miedzi). Dodatkowo w przypadku materiału miękkiego należy go najpierw utrwalić i odwodnić, przy czym stosuje się tu te same techniki, co przy utrwalaniu preparatów do obserwacji w mikroskopie elektronowym transmisyjnym. Bardzo ważnym aspektem mikroskopii elektronowej skaningowej jest odporność materiału biologicznego na bombardowanie elektronami i warunki próżni, ponieważ dla prawidłowej obserwacji nie może ulec zniszczeniu struktura powierzchniowa obiektu.

1. Zastosowanie

Otóż mikroskopy elektronowe znajdują szerokie zastosowanie w wielu działach nauki. W biologii umożliwiają one zbadanie i poznanie wielu organizmów, wniknięcie do komórki i poznanie licznych jej funkcji. Umożliwiły dokładne badanie najmniejszych organizmów jakimi są bakterie i wirusy. Z takich mikroskopów korzysta też technika. Umożliwiają one badanie struktury krystalicznej i jej defektów. Dzięki mikroskopom elektronowym poznajemy budowę różnych materiałów, co pozwala nam wpływać na ich własności. Współczesna elektronika opiera się w znacznej części właśnie na badaniach, przy których wykorzystuje się mikroskopy elektronowe. Używa się ich powszechnie w przemyśle elektronicznym i w innych gałęziach przemysłu nowoczesnego. Znajdują swoje zastosowanie w archeologii i badaniach historycznych. Korzysta się z nich w laboratoriach fizycznych i chemicznych. Używane są w kryminalistyce i przemyśle, w którym wymagana jest wysoka precyzja i dokładne sprawdzanie wytworzonych materiałów. Mikroskopy elektronowe zapewniają rozwój wielu dziedzin nauki, techniki i przemysłu.

1. Ważne

• Mikroskop optyczny nie pozwala dostrzec obiektów mniejszych niż użyta do ich oświetlenia długość fali świetlnej.

• W mikroskopie elektronowym zamiast światła używa się wiązki elektronów.

• Mikroskopy elektronowe stosowane dzisiaj dają powiększenie do 1 000 000 razy.

• Istnieją również mikroskopy jonowe, elektronowe skaningowe, tunelowe.

• Przy użyciu skaningowego mikroskopu tunelowego można manipulować pojedynczymi atomami.