ĆWICZENIE 1

Ekstrakcyjne wydzielenie syntetycznych barwników spożywczych z żywności i ich oznaczenie metoda spektrofotometrii UV-Vis.

Barwniki to substancje dodatkowe nadające lub przywracające barwę środkom spożywczym. Celem barwienia jest nadanie atrakcyjnego wyglądu zamaskowanie przebarwień, ograniczenie strat związków zapachowych i witamin wrażliwych na działanie światła. Barwienie nie jest konieczne z technologicznego punktu widzenia, budzi ono zastrzeżenia ze względu na możliwe szkodliwe działania.

Do barwienia stosuje się barwniki naturalne oraz syntetyczne: identyczne z naturalnymi oraz sztuczne.

Barwniki naturalne:

• Karotenoidy – otrzymywane z nasion drzewa Bixa orleana, suszonej marchwi lub skórki owoców cytrusowych.

• Flawonoidy – otrzymywane z wytłoków czerwonych winogron, czarnych porzeczek, żurawin, aronii.

• Betalainy – z soku buraka ćwikłowego.

• Porfiryny – chlorofile z zielonych części roślin.

Barwniki naturalne łatwo ulegają degradacji w czasie przetwarzania i przechowywania. Wrażliwe na działania światła, temperatury i pH środowiska.

Szkodliwość barwników syntetycznych: działanie szkodliwe mogą mieć same barwniki, ich metabolity, miedzy produkty, nieprzereagowane lub katalizatory.

Czerwień koszenilowa E124

Grupa azowa –N=N- odpowiada ona za barwę związku.

Barwnik mon oazowy, czerwony, db rozpuszczalna w wodzie, odporna na działanie temperatury, światłą, kwasów, zasad. W żołądku przekształca się w żółty metabolit.

Czynnik uwalniający histaminę; może nasilać objawy astmy, w połączeniu z benzoesanem wpływa na nadmierną aktywność dzieci (ADHD). W niektórych krajach uważana za potencjalnie kancerogenną i jej stosowanie jest zakazane (USA, Norwegia i Finlandia).

Parametry toksykologiczne:

ADI *dopuszczalne dzienne spożycie w mg/kg masy ciała) = 4 mg/kg masy ciała/dzień.

Dopuszczalny poziom w deserach = 50 mg/kg produktu.

Spektrofotometria UV-Vis

Metoda instrumentalna. Opiera się na zjawisku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletu (UV) i światła widzialnego (Vis) przez związki chemiczne.

Prawa absorpcji:

1. Prawo Lamberta – wiązka promieniowania elektromagnetycznego po przejściu przez jednorodny ośrodek absorbujący o grubości b ulega osłabieniu zgodnie z równaniem.

2. Prawo Lamberta-Beera – Absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu c i do grubości warstwy absorbującej b.

Jeżeli roztwór spełnia II prawo absorpcji wykres funkcji A=f(c) jest linia prosta.

Widmo – zależność absorbancji od długości fali.

Zasada komplementarności pochłaniania promieniowania: czerwień pochłania promieniowanie niebiesko-zielone z granicach 500 nm.

Aparatura UV-Vis

Źródła promieniowania:

• Lampy deuterowe 180 – 380 nm

• Lampa wolframowo-halogenowa UV-NIR

• Lampa ksenonowa UV-Vis

Kuwety pomiarowe:

• Kwarc, stopiona krzemionka, <380 nm

• Kwarc, szkło, tworzywo naturalne, >380 nm

Cechy kuwety:

• Zapewnienie dokładnej znanej grubości b

• Odporność na działanie substancji chemicznych

• Max przepuszczalność promieniowania.

Detektory – przetwarzają energie promieniowania elektromagnetycznego na energię elektryczna.

• Fotokomórki

• Fotodiody

• Fotopowielacze

Analiza ilościowa: oparta na pomiarze absorbancji A badanego roztworu przy określonej długości fali i wykorzystaniu prawa Lamberta-Beera.

Krzywa kalibracyjna – uniwersalna metoda ustalania stężenia analitu polegająca na pomiarze absorbancji roztworów wzorcowych w zakresie liniowości, wykreśleniu zależności A=f( c) i odczytaniu z niej stężenia oznaczania substancji.

ĆWICZENIE 3

Oznaczenie wybranych zanieczyszczeń spirytusu (metanol, octan etylu) metoda chromatografii gazowej (GC).

Spirytus – wodny roztwór etanolu.

Najdłużej na kolumnie pozostaje związek o wysokim powinowactwie do fazy stacjonarnej.

Detektor FID płomieniowo jonizujący – wykrywa związki organiczne; mierzy zmiany przewodności elektrycznej atmosfery płomienia w detektorze.

Zastosowanie GC:

• Identyfikacja lotnych związków;

• Ilościowa analiza wybranych mieszanin

• Wyznaczanie stałych fizykochemicznych;

• Badanie kinetyki procesów.

ĆWICZENIE 4.

Analiza mikologiczna powietrza.

METODY BADAWCZE:

1. Analiza chemiczna (ocena ilościowa drobnoustrojów w powietrzu)

   1. Ergosterol – składnik budulcowy komórek

   2. ATP – wskaźnik aktywności metabolicznej

   3. Związki lotne (MVOC) poziom skażenia środowiska.

2. Metody mikrobiologiczne

   1. Sedymentacja – grawitacyjne osiadanie mikroorganizmów pod wpływem siły ciężkości na powierzchnie szali z zestalona agarem pożywką. Przez 5 minut na płytkę 100 cm2 osiada tyle drobnoustrojów ile znajduje się w 10 l powietrza. Metoda łatwa, tania, nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Nie jest możliwa precyzyjna ocena objętościowa powietrza. Różna prędkość opadania drobnoustrojów. Prądy powietrza. Aglomeraty drobnoustrojów.

   2. Filtracyjna (aspirometryczna, syfonizacja). Aspirometr Diahanowa-Sszafira . Aparat Andersena 6 – STG Sampler. Powietrze zasysane jest do specjalnego urządzenia. W cieczy zostają zawieszone drobnoustroje z powietrza. Poprzez wytrząsanie możliwa jest homogenizacja drobnoustrojów. Z płynu wykonuje się rozcieńczenia i materiał posiewa na podłoże mikrobiologiczne, inkubacja w odpowiednich warunkach. Urządzenie zasysa powietrze i zawiesza wszystko, co się w nim znajduje. Drobnoustroje zawieszone SA na żelach.

   3. Metoda zderzeniowa – Caparat RCS Air Sampler ; aspirometr MAS 100. Powietrze zasysane jest przez urządzenie. Strumień powietrza z drobnoustrojami kierowany jest bezpośrednio na powierzchnie pożywki. Paski lub szalki z pożywką są inkubowane w odpowiednich warunkach.

Próbnik MAS 100 : prędkość stała 10 -100 l/minutę. Bakterie na agarze odżywczym.

Pleśnie – DG18 oraz YGC.

Wady:

Źle dobrana objętość poboru. Duże skażenie – przez 1 szczelinę wchodzi >niż 1 komórka.

ANALIZA PRODUKTÓW SPOŻYWCZYCH, PASZOWYCH ORAZ MATERIAŁÓW BUDOWLANYCH:

1. Metody bezpośredniego liczenia. Liczone są komórki, zarodniki, owocniki, strzępki. Preparaty mikroskopowe – ocena jakościowa. Komory zliczeniowe – np. Thoma – ilościowa i jakościowa. Filtry membranowe – wybarwianie odczynnikiem DAPI, oranżem akrydyny.

2. Metody pośredniego liczenia.

   1. Wskaźnikowe – metody instrumentalne; oparte na oznaczeniu metabolitu, którego poziom jest skorelowany z liczebności a drobnoustrojów. Należy wyznaczyć krzywa wzorcowa zależności poziomu metabolitu od liczebności drobnoustrojów. Rodzaje:

      1. Oznaczanie ergosterolu w materiałach budowlanych, wskaźnik porażenia pleśniami.

      2. Oznaczanie poziomu ATP za pomocą bioluminometru – czas pomiaru 5 minut.

BIOLUMINOMETR

1 komórka bakterii = 1 pentogram ATP

1 pentogram = 10^-15 g

1 komórka drożdży = 100 pentogramów ATP

Niszczenie komórki (lucyferaza). Uwolnienie ATP prowadzi do powstania kompleksu lucyferyna-lucyferaza-AMP. Emitowany jest 1 foton światła.

1 cząsteczka ATP = 1 foton światła.

Wykorzystanie bioluminometru:

• Monitorowanie ciągłe linii produkcyjnych w systemie HCCAP

• Nie służy do dokładnych badan

• Ocenia ogólne wymagania stanu higienicznego.

Metody radiometryczne – czas miedzy podaniem znakowanego substratu (C ) a wykryciem CO2 jest odwrotnie proporcjonalny do początkowej liczby drobnoustrojów.

Czułość: 10 -100 komórek w 1 ml

Metoda kolorymetryczna – wzrostowi drobnoustrojów towarzyszy aktywność enzymatyczna. Wytwarzanie dehydrogenazy przenoszącej jony wodorowe z substratu na wskaźnik barwny, np. błękit metylenowy, resazuryne, tetrazolinę.

Wzrost populacji – zmiana barwy – spektrofotometr

Metody impedymetryczne – parametrem jest zmiana przewodności elektrycznej układu pożywka i drobnoustroje. Aktywne metabolicznie drobnoustroje przekształcają związki wielkocząsteczkowe w zdysocjowane związki o malej masie. Maleje opór (impedancji) pożywki w czasie przepływu prądu.

Oznaczenie: 68 godzin

Zgodność z metodami hodowlanymi: 81%

Urządzenia: BraTrac, Bactometr.

METODY POŚREDNIEGO LICZENIA

Metody hodowlane – oznaczenie liczby drobnoustrojów, liczenie na podstawie kolonii.

Kolonia – twór klon, powstały w wyniku rozwoju mikroorganizmów z zarodnika, strzepa, komórki na powierzchni pożywki stałej. Wynik podawany, jako ilość jednostek tworzących kolonię (jtk) i wyrażone w jednostce wagi, objętości, powierzchni.

Artykuły stałej konsystencji – jtk/g

Płyny – jtk/ml

Powietrze – jtk/m3

Powierzchnie – jtk/100 cm2

PETRIFILMY 3M

Sterylne paski folii i papierowe. Nasycony liofilizat pożywki. Analiza ilościowa i jakościowa. Dodane stymulatory wzrostu umożliwiają wzrost form przetrwalnikowych, osłabionych działaniem czynników biobójczych detergentów.

HYGICULT/ENVIROCHECK – płytki odciskowe (contact slides)

Metoda półilościowa. Badanie stanu higienicznego. Eliminuje konieczność posiadania laboratorium. Wymazy: ręce, urządzenia, powierzchnie.

BADANIE MATERIAŁÓW BUDOWLANYCH

1. Metoda wymazu powierzchniowego – wymaz jałowy z gazikiem z określonej powierzchni 100 cm2 lub 4 x 25 cm2. 10 ruchów w pionie i 10 w poziomie. Zawiesina znajduje się w 100 ml. 100 cm2 – 100 ml.

2. Metoda zeskrobiu – bezpośredni posiew na pożywkę agarowa.

3. Metody odciskowe – niewielkie skażenie. Płytki odciskowe : petrifilmy, hygicult, rodack (szlaka petriego 5 cm), taśma klejąca.

ĆWICZENIE 5

Obliczanie LD50 na podstawie danych eksperymentalnych

Warunki przeprowadzania badania w klasycznej metodzie wyznaczania LD50:

• Badanie powojenno być wykonane przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt. Nie więcej niż 1 może być gryzoniem i nie więcej niż 1 – ptakiem (szczury, myszy, świnie, psy, kurczęta, przepiórki);

• Zwierzęta powinny być młode, ze znanej hodowli;

• Przynajmniej dla 1 gatunku należy wyznaczyć LD50 dla obu płci;

• Każdą dawkę substancji podaje się grupie zwierząt liczącej od 5-10 sztuk;

• Zwierzęta powinny być trzymane w warunkach optymalnych oraz karmione dieta hodowlaną odpowiednia dla danego gatunku z wolnym dostępem do wody;

• Podanie substancji powinno być poprzedzone przynajmniej 5-dniowym okresem adaptacyjnym, następnie nocnym głodzeniem;

• W badaniach dotyczących substancji trafiających do organizmu z pożywieniem podaje się je jednorazowo sonda do żołądka w objętości od 0,5 do 2 ml/100 g masy ciała. W tym samym czasie grupa kontrolna otrzymuje identyczna objętość rozpuszczalnika (woda, olej, glikol);

• Dawki substancji rosną w postępie geometrycznym;

• Zwierzęta obserwuje się przez 2 tygodnie kontrolując masę ciała, spożycie wody, paszy, stan ogólny, aktywność ruchową, zachowanie, stan skóry, sierści, oczu, błon śluzowych, moment wystąpienia, charakter i czas trwania objawów toksycznego działania (drżenie, konwulsje, ślinotok, biegunka, senność, śpiączka);

• Zwierzęta w stanie agonalnym wykazujące objawy bólu, cierpienia należy humanitarnie zabić, traktowane są one, jako zwierzęta, które padły.

• Sekcja zwłok padłych i uśpionych zwierząt po zakończeniu doświadczenia;

• Jeżeli substancje podane w dawkach większych od 2000 mg/kg masy ciała nie powodują śmierci, zwierzat to nie jest konieczne wyznaczanie dla nich LD50.

Kryteria klasyfikacji substancji chemicznej z punktu widzenia toksyczności ostrej:

Bardzo toksyczne ≤25 mg/kg masy ciała;

Toksyczne – 25 – 200

Szkodliwe – 200 – 2000

Nieklasyfikowane - >2000

OBLICZANIE LD50

METODA BEHRENSA

Łączne traktowanie zwierząt ze wszystkich grup mimo podawania im różnych dawek substancji.

Jeżeli zwierze przezywa wyższą dawkę to przeżyje niższe.

Jeżeli zwierze pada przy niskiej dawce to padnie przy wyższych.

METODA KRABERA

Doświadczenie analogiczne – wśród zastosowanych dawek powinna znaleźć się dawka powodującą śmierć wszystkich zwierząt oraz dawka niedziałająca.