Wykład 1

Zadania analizy żywności:

• Określenie zawartości składników pokarmowych w surowcach, półproduktach, wyrobach gotowych

• Kontrola, jakości produkcji i przetwórstwa żywności

Działy analizy żywności:

• Analiza sensoryczna – za pomocą zmysłów, organoleptyczna

• Analiza składu chemicznego – metody chemiczne, enzymatyczne, instrumentalne

• Analiza mikrobiologiczna – liczba i rodzaj drobnoustrojów występujących w żywności

Akty prawne regulujące

Ustawa z dnia 25 sierpnia 2006 o bezpieczeństwie żywności i żywienia (Dz. U. Nr171, poz. 1225 z 2006r.)

Ustawa określa:

• Wymagania zdrowotne żywności

• Wymagania dotyczące przestrzegania higieny: żywności, materiałów i wyrobów przeznaczonych do kontaktu z żywnością

• Właściwości organów w zakresie przeprowadzania urzędowych kontroli żywności

• Wymagania dotyczące przeprowadzania urzędowej kontroli żywności

Normy:

• Wydaje Polski Komitet Normalizacyjny

• Komórki podwykonawcze – Normalizacyjne Komisje Problemowe

• Normami krajowymi są PN ustanawiane przez PKN, powstające na forum, NKP, które odpowiadają za ich treść merytoryczną

Podział norm (pod względem treści merytorycznej)

• Jakościowe

  • Precyzujące wymagania jakościowe dla danego produktu

• Metodyczne

  • Szczegółowe procedury wykonywania oznaczeń zawartości składników

  • Ocena cech badanych produktów

  • Sposób pobierania próbek

Za normy międzynarodowe odpowiada

• Międzynarodowa Organizacja Standaryzacyjna (International Organisation for Standarisation – ISO)

• Komisja Kodeksu Żywnościowego FAO/WHO (Codex Alimentarius Commision - CAC)

• Stowarzyszenie Urzędowych Chemików Analityków

Nadzór nad żywnością

• Zajmuje się Państwowa Inspekcja Sanitarna

• Organem wykonawczym są:

  • Państwowy Zakład Higieny (PZH)

  • Stacje sanitarno – epidemiologiczne (wojewódzki lub miejski)

Stacje sanitarno – epidemiologiczne zależne od PZH posiadające działy higieny żywienia i żywności

BŁĘDY

Błąd – rozbieżność między uzyskanym wynikiem oznaczenia, a rzeczywistą zawartością oznaczanego składnika w badanym materiale. Wynik niedoskonałości metod analitycznych, stosowanych przyrządów pomiarowych i osób wykonujących oznaczenie

Błąd bezwzględny – równy wartości bezwzględnej różnicy dokładnej wartości x i otrzymanej y

X-Y = +/- Z

X- zawartość teoretyczna

Y – zawartość składnika otrzymana w produkcie

Błąd względny – miernik dokładności oznaczania w procentach

Z/X *100%

BŁĘDY ANALITYCZNE

Błędy systematyczne – najczęściej spowodowane czynnikiem działającym w jednakowy sposób w czasie wielokrotnego powtarzania tego samego pomiaru

• Na ogół tego samego znaku, tzn. dodatnie lub ujemne

• Przyczyny: np. niewłaściwe wyskalowanie przyrządów pomiarowych, przygotowanie próbek, sączenie, ważenie, przygotowywanie roztworów wzorcowych itp.

Błędy przypadkowe – dodatnie lub ujemne, których przyczynę trudno ustalić i eliminować

• Rozrzucone po obu stronach wartości prawdziwej

• Częściowo wzajemnie znoszące się i działające w sposób przypadkowy

• Mierzy się odchyleniem standardowym SD i współczynnikiem zmienności V

Błędy grube (pomyłki) – wynik niedostatecznej uwagi analityka przy wykonywaniu analizy, zapisywaniu i obliczaniu wyników

Mierzona wartość = wartość prawdziwa + błąd systematyczny + błąd przypadkowy

ZASADY POBIERANIA I PRZYGOTOWYWANIA PRÓBEK DO BADAŃ LABORATORYJNYCH

Warunkiem dokładności analizy jest prawidłowe pobranie i przygotowywanie próbki produktu

• Reprezentatywnej pod względem chemicznym i fizycznym

• Odpowiednio jednorodnej (rozdrobnionej, rozmieszczonej bądź zhomogenizowanej)

Przygotowanie próbki laboratoryjnej poprzedza przygotowanie próbek

• Pierwotnej pobranej jednorazowo, z 1 miejsca produktu opakowanego lub nieopakowanego

• Jednostkowej – powstałej z połączenia próbek pierwotnych pobranych z jednego opakowania jednostkowego

• Ogólnej – otrzymanej z połączenia próbek jednostkowych

• Laboratoryjnej – powstałej przez dokładne wymieszanie próbek ogólnych i ich zmniejszenie (metoda koperty – dzielenie na przekątne, odrzucanie 2 skrajnych części, z pozostałych 2 formowanie i ponowne dzielenie aż do uzyskania odpowiedniej ilości)

Liczba próbek jednostkowych zależy od:

• Wielkości partii towaru

• Stopnia jednorodności produktu; należy przestrzegać proporcjonalnego udziału w próbce wszystkich części danego produktu

• Złożonej precyzji badań

Pobieranie próbek pierwotnych z partii produktów w małych opakowaniach (zawartych w opakowaniach zbiorowych):

• Dla produktów zawartych w opakowaniach jednostkowych do lub 100 cm3(a nawet do 1kg) próbkę pierwotną może stanowić 1 opakowanie

• Losowe pobieranie próbek pierwotnych można przeprowadzić za pomocą liczb przypadkowych, bądź za pomocą losowania

Z produktów sypkich przesyłanych luzem lub w jednostkowych opakowaniach przeładowywanych za pomocą urządzeń o działaniu ciągłym, próbki pierwotne pobiera się z całego strumienia produktu, w jednakowych odstępach czasu lub z jednostek ruchu.

Z produktów ciekłych pobiera się za pomocą szklanych lub metalowych rurek zwężonych u dołu i zamykanych u góry, podczas ciągłego przepływu cieczy, jednakowe jej objętości w określonych odstępach czasu.

Z produktów półstałych, gęstych, lepkich (np. masło, miód) pobiera się próbki ze zbiornika, po dokładnym wymieszaniu, za pomocą świdra rynienkowego lub odpowiednich miarek.

Przy pobieraniu i przygotowywaniu próbek do oznaczania zawartości wody i składników odżywczych:

• Należy skrócić czas mieszania i rozdrabniania produktów

• Unikać przegrzania homogenizatorów

• Przechowywać próbki w czystych, szczelnie zamkniętych naczyniach w odpowiednich temperaturach

Witamin:

• Należy zabezpieczyć próbki przed ogrzewaniem, światłem, tlenem

• W przypadku próbek przeznaczonych do oznaczania witaminy C dodać kwasu szczawiowego (kwas askorbinowy trwały w środowisku kwaśnym)

Składników mineralnych:

• Należy zwrócić uwagę na stosowanie odpowiednich młynków, noży, homogenizatorów ze względu na możliwość zanieczyszczeń

Uwagi ogólne:

• Próbki produktów należy pobierać szybko i tak, aby jakość i skład produktów nie zmieniły się

• Próbki z produktów ziarnistych poddaje się sproszkowaniu przez mielenie w młynkach lub rozcieranie w moździerzu

• Produkty zawierające większe ilości wody rozdrabnia się w szarpakach nazywanych „wilkami” lub ściera na tarkach

• Produkty płynne przed odmierzeniem powinny być dokładnie wymieszane przez wstrząsanie, natomiast substancje o konsystencji mazistej mogą być pobierane bezpośrednio lub rozcierane w moździerzu

• Opakowania bezpośrednie próbek powinny być czyste, a próbka natychmiast szczelnie zamknięta

• Do próby należy brać ½ ilości substancji, a ½ zostawić na wypadek błędów czy niedokładności pomiarów (zrobić kolejne 3 próby)

Opisanie próbek

• Data i miejsce pobrania próbki

• Nazwiska i podpisy osób pobierających

• Nazwa produktu i klasa, jakości

• Wielkość partii

• Nazwa producenta, data produkcji, numer partii

• Określenie przewidywanego badania, laboratoryjnego

• Numer probówki

• Nr. opakowania, z którego próbka pochodzi

• Nr. specyfikacji, listu przewozowego lub innego dokumentu określającego dostawcę

Wykład 2

Produkt :

- woda

- sucha masa

Oznaczanie zawartości wody i suchej masy- zawartość wody w % ( to co w skrypcie)

- oleje i tłuszcze jadalne od kilku do kilkunastu %

- produkty zbożowe , mąki 10-20 % - pieczywo 30-50 % - mięso, produkty mięsne 60-70 %

- ryby 70-80 % - warzywa, owoce, mleko 89-90 - soki owocowe, grzyby 90-95

Z analitycznego punktu widzenia zawartość wody w produkcie spożywczym jest to taka ilość wody jaką można w nim oznaczyć każdą z dostępnych i dla danego produktu właściwych metod.

Sucha masa – pozostałość po usunięciu wody z produktu spożywczego

Procesowi temu towarzyszy utlenianie się niektórych substancji np. olejków eterycznych, alkoholi, lotnych kwasów.

Zawartość s.m. w % = 100 – zawartość wody w %

Zawartość wody w % = 100 – zawartość s.m. w %

Ilość wody wywiera wpływ na :

- jakość produktu

- wartość odżywczą

- trwałość przechowalniczą żywności

W produktach spożywczych woda występuje jako woda wolna i woda związana.

Woda wolna:

- stanowi rozpuszczalnik substancji organicznych i mineralnych

- wypełnia wolne przestrzenie i nie podlega zjawiskom kapilarnym

- bierze bezpośrednio udział w przemianach fizyko chemicznych

Woda związana:

- higroskopijna (zaadsorbowana) – powlekająca bardzo cienką warstwą powierzchnie produktów

- kapilarna – występująca w naczyniach kapilarnych

- krystaliczna

- konstytucyjna – związana chemicznie

Można wydzielić wodę wolna i higroskopijną. Woda zwiąż nie bierze udziału w ciśnieniu osmotycznym.

W analityce rozróżnia się pojęcia suchej masy:

- sucha masa całkowita – otrzymana przez suszenie produktu w określonych warunkach

- sucha masa rozpuszczalna w wodzie - czyli ekstrakt (syrop)

Metody oznaczania zawartości wody lub suchej masy:

- suszenie termiczne w różnych warunkach temperatury i ciśnienia

- metoda destylacji azeotropowej

- pomiar stałej dielektrycznej

- metody densymetryczne

- metody refraktometryczne

- pomiar rezonansu jądrowo – magnetycznego

- metody chemiczne

Metody termicznego suszenia – polegają na wydzieleniu wody z próbki.

Prawidłowość wyników zależy od :

- składu chemicznego i właściwości badanego produktu

- temperatury procesu suszenia

- czasu suszenia

- ciśnienia

- sposobu przygotowania próbki

Oznaczenie zawartości suchej masy : SKRYPT!!!

- w produktach nie zawierających związków wrażliwych na wysokie temperatury lub zawierających je w niewielkiej ilości ( zwłaszcza cukrów prostych) – produkty zbożowe – suszenie bezpośrednie próbek w temp 130^o C do uzyskania stałej masy.

(stała masa – po jakimś czasie suszenia wyciąga się produkt, studzi w eksykatorze – pojemnik pochłaniający wilgoć np. z krzemionką – ważyć, jeszcze raz suszarka, eksykator, waga , jeśli nie ma różnicy na 3 miejscu po przecinku to już jest masa stała. Jeśli nie to dalej suszymy)

( jeśli są cukry proste to temp max 105^oC!!! Bo przyłączają cząsteczkę wody i rozpadają się)

- w produktach zawierających duże ilość cukrów prostych lub innych termolabilnych związków – suszenie próbek w warunkach obniżonego ciśnienia (woda wtedy wrze w niższej temp. Np. w 50st) w temperaturze odpowiednio niższej przy jednoczesnym zastosowaniu związków pochłaniających wodę jak np. chlorek wapnia.

- w produktach ciekłych zawierających duże ilości cukrów prostych , białek, dekstryn (tworzących w czasie susz błonkę na powierzchni) – SKRYPT

- w prod na wpol ciekłych … SKRYPT

- w sokach, przecierach owocowych i warzywnych…. SKRYPT

• Próbki odważa się na wadze analitycznej do naczynek wysuszonych i zważonych z dokładnością do 0.0001 grama

• Produkty spożywcze o dużej zawartości wody powinny być poddawane wstępnemu suszeniu w temp 50-60 a następnie suszeniu właściwemu

- próbki do czasu wystudzenia przed każdym ważeniem przechowuje się w eksykatorach wraz z czynnikiem pochłaniającym wilgoć

- suszenie uważa się za zakończone gdy różnica dwóch następujących po sobie wyników nie przekracza 0.002 grama

Aparat do destylacji azeotropowej - schemat (jak w skrypcie)

( generalnie trzeba znać 3 zestawy/aparaty przez całe ćw.: ten, aparat soxleta i parnasa)

Rozpuszczalnik – nie może się mieszać z woda, musi być lżejszy od wody, mieć temp wrzenia powyżej 100stopnie. Np. ksylen, toluen

Mieszanina azeotropowa

- metoda destylacji azeotropowej – ten sam opis co w skrypcie

- pomiar stałej dielektrycznej – opis skrypt

- metody densymetryczne – skrypt

Pomiar gęstości:

- areometr

- piknometr

- metody refraktometryczne – skrypt

- pomiar rezonansu …

- met chemiczne: (nie używa się ich)

* metoda fischera

* metoda z karbidem

Umożliwiają oznaczenie zarówno wody wolnej jak i związanej

Metoda fischera:

- polega na bezpośrednim miareczkowaniu w specjalnym zestawie , metanolowego roztworu probki badanego produktu odczynnikiem fischera (metanolowy roztwór jodu, dwutlenek siarki, pirydyna ) do zaniku barwy jodu.

- procentowa zawartość wody obliczana na podstawie objętości odczynnika fischera zużytej do miareczkowania (należy znać miano czyli wiedzieć ile gram wody odpowiada 1cm3 odczynnika)

H20 + i2 + so2 +3 c5h5n + ch3OH -> 2 c5h5NHI + c5h5nso4hch3

Metoda z karbidem:

- Polega na pomiarze ilości wydzielonego acetylenu i w reakcji z węglikiem wapnia z woda

- Cac2+2h20_> ca(oh)2 +c2h2

- - pomiaru dokonuje się w biurecie gazometrycznej

- - zmierzona objętość acetylenu sprowadza się do warunków normalnych po czym oblicza zawartość wody

- - metoda daje dokładne wyniki w przypadku probek o dużej zawartosci wody

Zawartość białka w prod. Spoż. W g/100g

Nasiona i rośliny strączkowe suche 21-34

Sery twarogowe i podpuszczkowe 10-29

Mięso i jego przetwory 7-28

Ryby i przetwory 10-27

Mleko w proszku pełne 27

Jaja kurze cale 12

Maki i kasze 6-16

Pieczywo 4-9

Owoce i warzywa świeże 0,4-7

Mleko krowie 3-4

Oznaczanie zawartości azotu białkowego i niebiałkowego

- azot ogólny to azot białkowy – białek oraz produktów rozkładu białek (polipeptydy, peptony) i azot niebiałkowy – substancje azotowe niebiałkowe należących do różnych grup chemicznych związków organicznych

- jony amonowe, amidowe, aminowe bądź iminowe, azotany, azotyny, azot aromatyczny pierścieni heterocyklicznych

Metody stosowane do rozdziału tych frakcji opierają się na :

• Wytracaniu białek z roztworu :

- jonami metali ciężkim ( miedzi II, żelaza III, cynku II, kadmu II

- kwasami (fosforoV – wolframowymi, trichlorooctowym, metafosforowym V

- kwasami garbnikowymi – taniną

- alkoholem etylowym 70%

- wysoką temp 80st przez 10 min

* oddzieleniu osadu

* określeniu ilości azotu w osadzie (azot białkowy) i przesączu (azot niebiałkowy)

Ilościowe oznaczanie zawartości białka przeprowadza się metodami:

- bezpośrednimi – polegającym na wytraceniu białka z roztworu i wagowym oznaczeniu wytraconego osadu lub oznaczeniu np. refraktometrycznym…?

- pośrednimi – opierającymi się na ilościowym oznaczeniu zawartości azotu i przeliczeniu go na białko

Wykład3

BIAŁKA

Ilościowe oznaczanie zawartości białka przeprowadza się metodami:

- bezpośrednimi – polewającymi na wytraceniu białka z roztworu i wagowym …

- pośrednimi

Metody bezpośrednie:

- met biuretowa (kolorymetryczna)

- metoda Lovry’ego (kolorymetryczna)

- metody oparte na wbudowywaniu barwników (kolorymetryczne)

- metody immunoenzymatyczne (ELISA)

Metoda biuretowa:

- polega na oznaczaniu białek i peptydów zawierających co najmniej dwa wiązania peptydowe, które tworzą w środowisku alkalicznym barwne kompleksy z jonami miedzi

- intensywność powstałego fiołkowego zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia białka

Metoda Lovry’ego

- polega na pomiarze absorbancji będącej wynikiem dwóch reakcji:

1) biuretowej polegającej na przyłączeniu jonów miedzi do wiązań peptydowych

2) redukcji odczynnika fosforomolibdeno-fosforowolframowego (odczynnik Folina – Ciocalteu’a) przez obecne w białku aminokwasy tyrozynę i tryptofan

- metoda ok 100 razy czulsza od metody biuretowej

Metody oparte na wbudowywaniu barwników:

- niektóre organiczne barwniki (oranż G, czerń amidowa 10B) mogą być ilościowo wbudowywane do białek

- białko i barwnik, zwykle poniżej punktu izoelektrycznego białka, reagują ilościowo tworząc nierozpuszczalne kompleksy, które są oddzielane przez wirowanie lub sączenie od reszty roztworu

- natężenie barwy roztworu zależy od ilości barwnika niezwiązanego z białkiem (barwnik dodany w nadmiarze)

- zasada metody z wbudowaniem czerni amidowej 10B została wykorzystana w konstrukcji aparatu Pro-Milk, stosowanego do szybkiego oznaczania białek mleka w przemyśle

Metoda immunoenzymatyczna ELISA

- polega na utworzeniu połączeń specyficznych przeciwciał analizowanego białka z odpowiednim enzymem

- enzym ten reagując z bezbarwnym substratem, przeprowadza go w barwny związek, którego stężenie można oznaczyć spektrofotometrycznie przez porównanie z roztworem wzorcowym

- metoda ELISA pozwala na oznaczenie poszczególnych grup białek w badanym roztworze

Metody pośrednie

Metoda Kjeldahla

- jest najczęściej stosowaną metodą oznaczania azotu ogólnego

- polega na mineralizacji badanego produktu spożywczego, a następnie oddestylowaniu i zmiareczkowaniu amoniaku powstałego z połączeń azotowych zawartych w białku

- analiza składa się z trzech etapów: (znać reakcję i wiedzieć dlaczego takich odczynników się używa)

1) mineralizacji próbki: (utlenianie=mineralizacja)

2h2so4 -> temp 2so2 + 2 h20 + o2

Cooh-r-nh2 + no2 -> kat xco2 + yH2O + z NH3

2nh3 + h2so4 -> (nh4)2SO4

2) destylacji z parą wodną (aparat Parnasa-Wagnera do destylacji amoniaku – schemat)

(NH4)2SO4 + 2 NaOH -> temp 2NH3 + Na2SO4 + 2 H20

Nh3 + H3BO3 -> (NH4)H2BO3

3) miareczkowania

(NH4)H2BO3 + HCl -> NH4Cl + h3BO3

Lub

2 (NH4)H2BO3 + h2so4 -> (NH4)2SO4 + 2 H3BO3

Zasada metody Kjeldahla została wykorzystana w nowoczesnych urządzeniach analitycznych:

- szwedzkiej firmy Tecator (o nazwie Kjeltec)

- firmy Foss Electric (system Kjel Foss)

Obejmujących aparat do mineralizacji, jednostkę do destylacji i automatycznego miareczkowania

Białka zawierające prawie stałą ilość azotu, która wynosi przeciętnie około 16%, co stanowi 6,25 części wszystkich pierwiastków zawartych w białku (100:16 = 6,25)

Zawartość białka obliczana jako iloczyn masy azotu ogólnego i przeciętnej zawartości azotu w białkach nosi nazwę białka surowego.

Współczynniki przeliczania azotu na białko dla: (skrypt)

- żółtka jaja kurzego 6,67

-….

Metodą tą oprócz połączeń azotowych zawartych w białku mogą być również oznaczone jony amonowe oraz inne związki zawierające grupy amidowe, aminowe bądź iminowe

Natomiast nie są oznaczane azotany, azotyny, azot aromatyczny pierścieni heterocyklicznych

Metoda Kofranyi

- substancja białkowa, ogrzewana w środowisku zasadowym, wydziela określona ilość azotu w postaci amoniaku, który może być oddestylowany i związany z kwasem, podobnie jak w metodzie Kjeldalha w zestawie destylacyjnym Parnsa – Wagnera

- amoniak powstaje przeważnie z glutaminy i asparginy oraz rozkładu niektórych aminokwasów podczas gotowania substancji w środowisku zasadowym

- metoda ta wykonywana jest bez uprzedniej mineralizacji próbki jak w metodzie Kjeldalha

- metoda wymaga obliczenia empirycznego współczynników korelacji poprzez porównanie wyników otrzymanych metodą Kofranyi i metodą Kjeldalha

Oznaczanie składu aminokwasowego – oznaczanie aminokwasów w produktach spożywczych można przeprowadzić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowe HPLC

TŁUSZCZE

Metody ilościowego oznaczania zawartości tłuszczów

Zawartość tłuszczów w wybranych produktach spożywczych w g/100g

- tłuszcze jadalne (masło, margaryny, słonina, smalec, oleje roślinne, oliwa): 75-100

- tłuszcze stołowe o obniżonej kaloryczności (margaryny niskokaloryczne): 45—55

- produkty o bardzo wysokiej zawartości tłuszczu (śmietana kremowa, sery żółte, węgorz, metka, parówki, wafle nadziewane: 25-30

- produkty o wysokiej zawartości tłuszczu (wieprzowina, baranina, gęś, kaczka, kiełbasy, śledź, makrela, jaja, sery tłuste, śmietana, twarogi tłuste, pieczywo cukiernicze): 10-25

- produkty i niskiej zawartości tłuszczu ( polędwica, cielęcina, wołowina, kurczak, indyk, dorsz, ryby słodkowodne, podroby, produkty zbożowe, mleko pełne, lody, jogurty, twarożki): 3-10

- produkty o bardzo niskiej zawartości tłuszczu (mleko chude, twaróg chudy, kefir, pieczywo, polędwica, warzywa, owoce, grzyby): 0-3

Tłuszcz surowy – suma naturalnych związków organicznych takich jak glicerydy, wolne kwasy tłuszczowe, sterydy, witaminy i barwniki rozpuszczalne w tłuszczu, fosfataty, woski,

nierozpuszczalnych w wodzie , której dają się wyekstrahować w z produktu rozpuszczalnikami organicznymi (eter etylowy, eter naftowy, chloroform, benzen, aceton i inne) i nie są lotne w temperaturze 105st C

Tłuszcze dzieli się na trzy zasadnicze grupy :

Tłuszcze proste – estry kwasów tłuszczowych i alkoholi (glicerolu) – lipidy właściwe, woski.

Tłuszcze złożone – związki zawierające obok kwasów tłuszczowych i alkoholi również inne składniki – fosfolipidy, glikolipidy, inne.

Pochodne tłuszczowe – pochodne tłuszczów prostych i złożonych powstałe przede wszystkim w wyniku hydrolizy, zachowujące ogólne właściwości lipidów – kwasy tłuszczowe, alkohole, węglowodory.

Wykład 4

Metody oznaczania zawartości tłuszczu można podzielić na:

- ekstrakcyjne (wagowe np. Soxhleta, Weibulla-Stoldta, refraktometryczne, densymetryczne)

- objętościowe (kwasowe np. gerbera, bezkwasowe)

- instrumentalne (np. NIR, NMR)

Metody ekstrakcyjno-wagowe polegają na:

- wysuszenie próbki do stałej masy bądź ewentualnym przeprowadzeniu hydrolizy produktu ułatwiającej wyodrębnienie frakcji tłuszczowej

- wydzieleniu z badanej próbki tłuszczu poprzez ekstrakcję za pomocą rozpuszczalnika (eteru, heksanu, chloroformu lub innego rozpuszczalnika tłuszczowego)

- oznaczeniu wolnej frakcji tłuszczowej wagowo

Metody ekstrakcyjno-wagowe mogą polegać na:

- ekstrakcji rozpuszczalnikiem w nieokreślonej ściśle ilości

- ekstrakcji określona ilością rozpuszczalnika (np. metoda Grossfelda)

- stosowaniu wielokrotnej ekstrakcji ciągłej (np. metoda Soxhleta, metoda Weilbulla-Stoldta, metoda Puzanowa)

Metody polegające na ekstrakcji rozpuszczalnikiem w nieokreślonej ściśle ilości dzielą się na:

- metody bezpośredniego traktowania rozpuszczalnikiem (np. metoda Kohmana)

- metody wstępnego traktowania zasadami i następnie rozpuszczalnikiem

- metody wstępnego traktowania kwasami, następnie rozpuszczalnikiem

Metoda Soxhleta:

Oznaczenie polega na wielokrotnej ciągłej ekstrakcji eterem dietylowym (MY KORZYSTAMY Z NAFTOWEGO, DIETYLOWY JEST WYCOFANY) związków tłuszczowych z rozdrobnionego i wysuszonego w 105 st. C produktu. Masę wyizolowanego tłuszczu surowego oznacza się wagowo po odparowaniu eteru z odbieralnika i wysuszeniu frakcji tłuszczowej w temp 105 st C przez 1h lub z różnicy mas gilzy z badanym produktem przed i po ekstrakcji.

Eter dietylowy wolny ma być od nadtlenków oraz pozbawiony śladów wody gdyż:

- woda może rozpuszczać niektóre składniki badanego produktu, które po przejściu do wyciągu eterowego i odparowaniu eteru zwiększają masę suchej pozostałości przyjmowanej jako tłuszczu surowy

- obecności nadtlenków może być powodem silnych eksplozji przy odparowaniu eteru; jak też nadtlenki są przyczyną utlenienia nienasyconych kwasów tłuszczowych

Źródła błędów w met. Soxhleta:

- niedostateczne wysuszenie próbki

- stosowanie rozpuszczalników nie uwolnionych od wody, a w przypadku stosowania eteru dietylowego również nadtlenków

- woda zawarta w próbce lub rozpuszczalniku rozpuszcza sole mineralne i inne substancje rozpuszczalne w wodze zawarte w produkcie, które przechodzą do ekstraktu

0 nadtlenki powodują wysycenie tlenem NKT

Metoda Weilbulla-Stoldta

Metoda polega na przeprowadzeniu hydrolizy za pomocą kwasu solnego w celu zniszczenia połączeń związków frakcji tłuszczowej z innymi substancjami – przeważnie białkowymi, oddzieleniu frakcji tłuszczowej od hydrolizatu, wysuszeniu na sączku, wyekstrahowaniu rozpuszczalnikiem a paracie Soxhleta i oznaczeniu wagowym.

- rozkład związków tłuszczowo-białkowych może następować pod wpływem hydrolizy próbki w roztworach mocnych kwasów lub słabej zasady amonowej (jeżeli w badanym produkcie występują wolne kwasy tłuszczowe, to zastosowanie nawet słabej zasady amonowej prowadzi do błędów 0 powstanie mydeł amonowych)

- przeprowadzenie wstępnej hydrolizy badanych produktów jest zabiegiem nieodwracalnym także gdy tłuszcz występuje w postaci emulgowanej (mleko, sery, pieczywo, odżywki dla dzieci)

- metoda ta jest modyfikacją metody Soxhleta

Źródła błędów:

- niedostateczne rozpuszczenie substancji białkowej

- użycie nieodpowiednich sączków

- niedostateczne wysuszenie sączków

- niedostateczne wyekstrahowanie tłuszczu

- stosowanie rozpuszczalnika nieodpowiedniego do wymogów podanych w metodzie Soxhleta

Metody ekstrakcyjno-refraktometryczne – to co w skrypcie str. 52 +:

- jako rozpuszczalniki stosuje się benzynę, chloroform, octan amylu, octan butylu, jednochlorobenzen, nitrobenzen, anilinę

Metody ekstrakcyjno-densytometryczne

- polegają na zmianie gęstości rozpuszczalnika w zależności od ilości rozpuszczonego w nim tłuszczu

- tłuszcz ekstrahuje się i oznacza gęstość wyciągu tłuszczowego

- zawartość tłuszczu odczytuje się z krzywych

- jako rozpuszczalnik stosuje się czterochlorek węgla… ….

Metody objętościowe (butyrometryczne)

Polegają na rozpuszczeniu znajdującego się w próbce białka i substancji towarzyszących najczęściej za pomocą kwasu siarkowego (rzadziej za pomocą odczynników zasadowych) , wydzieleniu frakcji tłuszczowej ( po uprzednim odwirowaniu) w specjalnym przyrządzie zwanym tłuszczomierzem lub butyrometrem i odczytaniu procentowej zawartości tłuszczu na skali tłuszczomierza.

Do wydzielenia tłuszczu niezbędne jest jego uwolnienie z otoczek białkowych poprzez potraktowanie badanej próbki kwasem siarkowym oraz alkoholem izoamylowym, który zmniejsza przyczepność do szkła i ułatwia zgromadzenie się wydzielonego tłuszczu, jak też zapobiega tworzeniu się emulsji.

Przy oznaczaniu tłuszczu w produktach mlecznych słodzonych metoda ta nie daje zadowalających wyników z powodu przechodzenia do tłuszczu produktów zwęglania sacharozy, co powoduje silne zabarwienie słupka tłuszczu, utrudniające odczytanie wyników.

Źródła błędów:

- złe wycechowanie tłuszczomierze

- niedostatecznie odtłuszczone tłuszczomierze i korki

- stosowanie nieodpowiedniej temp odczytu

- stosowanie nieodpowiedniego wirowania

- zanieczyszczenia alkoholu izoamulowego

Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych

- oznaczenie kwasów tłuszczowych w produktach spożywczych można przeprowadzić za pomocą chromatografii gazowej

- wyekstrahowany tłuszcz poddaje się hydrolizie zasadowej, a następnie uwolnione kwasy tłuszczowe przeprowadza się w ich lotne pochodne – estry metylowe, otrzymane estry rozdziela się metodą chromatografii gazowej

METODY ILOŚCIOWE OZNACZANIA ZAWARTOŚCI CUKRÓW

Zawartość cukrowców w produktach spożywczych w g/100g

Mąki i kasze 70-79

Pieczywo 50-79

Nasiona roślin strączkowych suche 33-62

Mleko w proszku pełne 40

Owoce i warzywa świeże 3-23

Mleko krowie 5

Sery twarogowe 4

Jaja kurze całe 1

Sery podpuszczkowe 0,1

Mięso, ryby 0,0

Ze względu na budowę chemiczną cukrowce można podzielić na :

- monosacharydy np. glukoza, fruktoza

- oligosacharydy – złożone z 2 do 10 jednostek monosacharydowych (np. sacharoza, maltoza, laktoza, rafinoza, stachioza)

- polisacharydy – złożone z więcej niż 10 jednostek monosacharydowych (np. skrobia, celuloza)

Ze względu na zróżnicowanie fizykochemiczne cukrowce ogółem są składnikiem pokarmowym żywności którego nie oznacza się analitycznie lecz oblicza z tzw. Różnicy

Cukrowce ogółem = masa próbki – (białko + tłuszcze + popiół + woda)

Biorąc pod uwagę rozpuszczalność cukrowców można je podzielić na:

- rozpuszczalne w wodzie (mono i oligo)

- rozpuszczalne na gorąco w 2 % roztworze kwasu mineralnego – skrobia

- rozpuszczalne w stężonych roztworach kwasów mineralnych – celuloza i jej pochodne

WYKŁAD 5

Cukry

Identyfikacja cukrowców reakcje grupowe:

• Próba Molischa z α-naftolem

- do 1 cm3 roztworu dodać 1-2 krople 15% alkoholowego roztworu α-naftolu, 1cm3 stężonego kwasu siarkowego

- na obecność cukrowców wskazuje czerwony pierścień pojawiający się na granicy barw

• Próba z antronem i stężonym kwasem siarkowym

• Wykrywanie pentoz – reakcja Taubera

• Odróżnienie fruktozy od glukozy i dwucukrów

Metody oznaczania cukrowców

Metody oznaczania węglowodanów można podzielić na :

- fizyczne - chemiczne - biologiczne

Istnieje wiele metod kombinowanych tj. fizykochemicznych lub biochemicznych.

Metody fizyczne:

• Metody densymetryczne – oparte na pomiarze gęstości wodnych roztworów cukrów za pomocą areometru lub piknometru. Gęstość przelicza się przy pomocy tabel na zawartość ekstraktu – metody orientacyjne lub półilościowe.

• Metody refraktometryczne – oparte na pomiarze współczynnika załamania światła (refrakcji) przez cząsteczki cukru rozpuszczonego w wodzie. W produktach spożywczych, w których cukry stanowią główny składnik, stawia się często znak równości między oznaczoną zawartością cukru, a zawartością suchej masy.

• Metody polarymetryczne – wykorzystują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego tj, takiego, którego drgania zachodzą tylko w jednej płaszczyźnie, przez cząsteczki cukrów w roztworze wodnym, w których obecne są asymetryczne atomy węgla.

Metody enzymatyczne:

- Wykorzystywane do oznaczania glukozy i fruktozy względnie oligosacharydów po hydrolizie

- W pierwszym etapie oznaczenia w wyniku fosforylacji otrzymywany jest glukozo-6-fosforan, który w reakcji z NADP+ w obecności dehydrogenazy fosfoglukonianowej jest utleniany z utworzeniem NADPH

- Ilość powstającego NADPH oznaczonego spektrofotometrycznie w zakresie nadfioletu, jest proporcjonalna do ilości glukozy

Metody chemiczne:

• Metody absorpcyjne (kolorymetryczne) – oparte na pomiarze absorbancji związków barwnych powstających w wyniku reakcji chemicznej cukrów (najczęściej monosacharydów) z różnymi odczynnikami chemicznymi. Do najczęściej stosowanych zalicza się metody: antronowa, rezorcynowa, żelazicyjankową

Metoda antronowa:

- polega na odwodnieniu cukrów przez ogrzewanie ze stężonymi kwasami i reakcji z antronem

- pomiar natężenia barwy wykonywany jest przy długości fali 620 nm

- metoda pozwala na łączne oznaczenie większości cukrów występujących w badanym produkcie

- metoda jest dokładna przy zachowaniu identycznych warunków pomiaru analizowanych roztworów

Metoda rezorcynowa:

- służy do oznaczania ketocukrów, które ogrzewane z kwasem solnym ulegają odwodnieniu

- produkty odwodnienia tworzą z rezorcyną barwne kompleksy

- ketoheksozy dają kompleksy barwy o maksimum absorpcji przy długości fali 520nm, ketopentozy przy długości fali 620nm

Metoda żelazicyjankowa:

- służy do oznaczania aldocukrów, które w środowisku zasadowym redukują żelazicyjanek do żelazocyjanku, który z jonami Fe3+ tworzy błękit pruski

- pomiar intensywności zabarwienia wykonywany przy długości fali świetlnej 690nm

Metody chemiczne

Metody miareczkowe (objętościowe):

- Lane-Eynona

- Metoda Bertranda

- metoda Luffa-Schoorla

- wykorzystują właściwości redukujące cukrów w stosunku do soli miedzi, wynikające z obecności w ich cząsteczkach wolnych grup karbonylowych (ketonowej lub aldehydowej)

- bezpośrednio redukujące właściwości posiadają : wszystkie monosacharydy oraz niektóre oligosacharydy np. maltoza i laktoza, gdzie jedna z grup aldehydowych pozostaje wolna

- właściwości redukujące mogą również posiadać inne sacharydy po przeprowadzonej hydrolizie do monosacharydów, o pierwotnie zablokowanych grupach karbonylowych

- sacharoza nie ma bezpośrednich właściwości redukujących gdyż aldehydowa grupa glukozy oraz ketonowa fruktozy uczestniczą w tworzeniu wiązania glikozydowego

- Sacharydy zawierające wolne grupy karbonylowe określa się jako cukry bezpośrednio redukujące

Metody miareczkowe nie są metodami specyficznymi dla cukrów ponieważ właściwości redukujące w warunkach oznaczania cukrów wykazują:

- aminokwasy (cysteina, kwas asparginowy)

- białka

- niektóre kwasy organiczne

- niektóre aldehydy

- zasady purynowe itp.

Które winny być wstępnie usunięte poprzez odbiałczenie i klarowanie próby

Usuwanie substancji interferujących metodą Cerreza:

- w metodzie stosuje się roztwory : heksacyjanożelazian potasu oraz siarczan cynku w równej objętości

r-cja: (skrypt)

powstający koloidalny heksacyjanożelazian cynku opadając w formie osady porywa ze sobą związki wielkocząsteczkowe (głównie białka i pektyny).

Do klarowania stosuje się też w zależności od produktu:

Wodorotlenek miedzi

Kwas fosforo-wolframowy, kwas triochlorooctowy, etanol 70%, aceton

Do usunięcie barwników używa się węgla aktywowanego.

Hydroliza (inwersja) oligosacharydów metodą Clerget-Herzfelda

- metoda polega na dodaniu do rztworu cukru kwasu solnego , a następnie podgrzaniu mieszaniny i utrzymaniu w temp 68-70oCprzez 5 minut.

Po schłodzeniu rztworu należy zobojetnic 30% NaOH wobec wskaźnika fenoloftaleiny i dplenic woda w kolbie miarowej tak, aby w kolbie otrzymać stężenie banadych cukrow w przediale 0,1-0,4% dla metod Lane-Eynona i Bertranda oraz w przediale 0,1-0,25 % dla metody Luffa-Schoorla

- zmiana stężenia kwasy w hydrolizowanym roztworze może stać się powodem bledow…?

- roznice pomiędzy zawartością cukrow ogółem i bezpośrednio redukujacyhc przelica się na asacharoze mnożąc prezz wspolczynnik przeliczeniowy 0,95 (342/360)

Hydrolizę skrobi do glukozy przeprowadza się stosując różne stężenia kwasu i różny czas ogrzewania

Np. w metodzie Lintnera próbkę skrobi hydrolizuje się w srodowisku 2% HCl ogrzewając w 100oC przez 3 h

Metoda Bertranda

- w metodzie Bertranda stosuje się trzy płyny Bertranda:

I – CuSO4

II – winian sodowo-potasowy – sół Seignettea , zapobiega wytrącaniu się Cu(OH)2 – kompleksuje miedź,

III – Fe2(SO)4 + h2SO4 st.

• Oznaczenie polega na ilościowym redukowaniu przez cukry redukujace (w steżeniu 0,1-0,4%) jonów miedzu Cu2+ do miedzi Cu+ w srodowisku zasadowym ph = 12 I temperaturze wrzenia

• (gotowanie przez 3 minuty mieszaniny płynów Bertranda 1 i 2 z badanym roztworem cukrow po uprzednim sklarowanii proby i ewentualnie przeprowadzonej hydrolizie)

Rekacje (jak w skrypcie)

Wytworzony tlenek miedziawy… blablabla strona 36 skrypt

Metoda Lane-Eynona

- w metodzie stosuje się dwa plyny Fehlinga (to samo co w bertrandzie tylko inna nazwa)

Metoda Luffa-Schoorla przebiega w dwóch etapach

1. (próba ślepa) w I etapie ustala się zużycie mianowanego rztworu tiosiarczanu sodu do zmiareczkowania jofdu wydzielonego przez calkowita ilość miedzi zawarta w określonej obkjetosci plynu Luffa

2. 2CuSO4 + 4 KI -> śr. Kw 2K2SO4 + Cu2Ii + i2

3. I2 + 2 na2s2o3 -> 2NaI + na2s4o6

4. W II etapie (próba właściwa) prowadzi się redukcje części miedzi zawartej w tej samej objetosci plynu Luffa badanym roztworem cukru, a następnie dodaje jodej potasu, z którego niezredukowana miedz wydziela jod.

R-CHO + 2 CuO -> śr alkaliczne Cu2O + R-COOH

Cukier cu(II) Cu(I) kwas glukonowy

1. 2CuSO4 + 4 KI -> śr. Kw 2K2SO4 + Cu2Ii + i2

2. I2 + 2 na2s2o3 -> 2NaI + na2s4o6

WYKŁAD 6 12/11/2013

CUKRY CD

Metody chromatograficzne

- stosuje się chromatografię gazowa GC, w której sacharydy jako związki nielotne musza być przeprowadzone w lotne pochodne

- lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową HPLC, używając detektora refraktometrycznego RI, w którym wykorzystano pomiar współczynnika załamania światła

Oznaczanie skrobi :

- metody wagowe

-metody chemiczne

- metody polarymetryczne

Włókno

Zawartość włókna pokarmowego w produktach spożywczych w g/100g

Produkty zbożowe

- otręby pszenne 42,5

- płatki śniadaniowe 7-11,5

- kasze 2,5-9

- pieczywo 2-6,5

- mąka pszenna typ 500, makaron 2,6

Strączkowe

- suche nasiona 15-15,7

Włókno surowe (crude fiber) część włókna roślinnego, która nie rozpuszcza się we wrzącym 0,25 mol/dm³ kwasie siarkowym, następnie 0,31mol / dm³ ługu sodowym, w wodzie, alkoholu i eterze

Do oznaczenia nie strawionej części pożywienia roślinnego pomiar włókna surowego jest nieadekwatny, ponieważ ponad 80% hemiceluloz jest usuwana wraz z białkami, cukrami i innymi składnikami poprzez działanie kwasem, ponad 50-90% lignin jest tracona przy traktowaniu próby zasadą, odzysk celulozy wynosi 50-80%.

Włókno pokarmowe (dietary fiber) - część pożywienia odporna na działanie enzymów zawartych w przewodzie pokarmowym człowieka, obejmująca celulozę, hemicelulozy, ligniny, pektyny, wewnątrzkomórkowe polisacharydy takie jak gumy i śluzy roślinne oraz woski i kutyny, a więc wszystkie substancje występujące razem z ligninami i polisacharydami ścian komórkowych roślin. (Trowell 1976)

Biorąc pod uwagę rozpuszczalność frakcje włókna pokarmowego można podzielić na:

- rozpuszczalne w wodzie (pektyny, gumy, śluzy, polisacharydy glonów)

- nierozpuszczalne w wodzie ( celuloza, hemicelulozy, ligniny, skrobia oporna)

Metoda AOAC polega na trawieniu (ewentualnie odtłuszczonej) próbki kolejno termooporną
alfa-amylazą (termamylem), proteazą i amyloglukozydazą, a następnie po wytrąceniu włókna rozpuszczalnego na wagowym oznaczeniu części niestrawionych z rozdziałem na rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie.

Próbka -> przemywanie eterem naftowym jeżeli produkt zawiera więcej niż 10% tłuszczu -> trawienie termamylem pH=6 / 15 minut / 90^oC -> trawienie proteazą pH=7,5 / 30 minut / 60^oC -> trawienie amyloglukozydazą pH=4,5 / 30minut / 60^oC -> filtracja

Filtracja -> osad – przemycie alkoholem, acetonem -> włókno nierozpuszczalne w wodzie

Filtracja -> przesącz – wytrącanie włókna rozpuszczalnego w wodzie (etanol / 60min / 60oC) -> filtracja -> osad – przemycie alkoholem, acetonem -> włókno rozpuszczalne w wodzie

WITAMINY

Metody ilościowe oznaczania zawartości witamin

Na stopień dokładności w oznaczaniu mają wpływ:

• Rodzaj badanego produktu

• Sposób przygotowania i przechowywania próbki

• Wybór właściwej metody oznaczenia

• Stopień czystości odczynników

• Odstępy czasowe między etapami analizy

• Doświadczenie analityczne badającego

• Wyposażenie laboratorium

W procedurach oznaczania witamin w celu uniknięcia błędów stosuje się:

- standard wewnętrzny

- standard zewnętrzny

- test odzyskania

Standard wewnętrzny polega na równoczesnym przeprowadzeniu przez wszystkie etapy analizy próbki badanej oraz próbki badanej ze ściśle określonym dodatkiem wzorca badanej witaminy (ilość dodanej witaminy powinna być bliska spodziewanej wartości w próbce).

Standard zewnętrzny – roztwór standardowy zawierający znane stężenie witaminy, pozbawiony substancji interferujących znajdujących się w próbce, zostaje poddany identycznemu traktowaniu jak próbka.

Testy odzyskania

Próba A Próba B

Standard Standard

Pomiar Procedura oznaczenia

(aparat) Pomiar

(aparat)

TEST ODZYSKU = B/A * 100%

Witamina A

- pod pojęciem witaminy A rozumiemy wszystkie pochodne β-jononu, wykazujące aktywność biologiczną i podobieństwo strukturalne do all-trans-retinolu (forma alkoholowa witaminy A). Zaliczamy do nich: retinal, estry retinylu (octowy i palmitynowy), kwas retinowy i jego sole, pochodne retinolu i retinalu.

Zawartość witaminy A (retinolu) w wybranych produktach w µg/100g

Mięso:

- wątroba wołowa 14 200

- wątroba wieprzowa 13 000

- wątróbki drobiowe 9 300

- mięso 0-50

Tłuszcze:

- olej z wątroby halibuta 900 000

- olej z wątroby dorsza 18 000

- masło, margaryny 600 - 900

Produkty mleczne:

- sery podpuszczkowe 160-450

- mleko w proszku pełne 175

- śmietany 60-220

- sery twarogowe 10-100

- mleko krowie 15-25

- jogurty, kefiry 10-15

Jaja:

- jaja kurze całe 300

Ryby:

- ryby i przetwory rybne 0-175

Wykorzystanie witaminy A z diety:

Zwiększa:

+ odpowiednia ilość i jakość białka

+ rodzaj, ilość i świeżość tłuszczu

+ obecność środków emulgujących

+ obecność pro i przeciwutleniaczy

Zmniejsza:

- obecność błonnika

- niedobór cynku

- obecność azotanów i azotynów

- alkohol

- wolne rodniki

Wykorzystanie witaminy A z dziennej racji pokarmowej wynosi około 80%.

Zawartość witaminy A w produktach podaje się w następujących jednostkach:

- j.m. (jednostki międzynarodowe)

- µg (mikrogramy 10^-6g)

- mg (miligramy 10^-3g)

- równoważnikach (ekwiwalentach) retinolu

1 j.m. witaminy A = 0,3 µg retinolu

0,344 µg octanu retinylu

0,55 mikrograma retinylu

1 równoważnik (ekwiwalent) retinolu = 1 µg retinolu

Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach są wrażliwe na działania:

• Tlenu

• Promieni słonecznych

• Są łatwo utleniane przez nadtlenki kwasów tłuszczowych

• Obecność katalizatorów (np. śladów miedzi) w wysokich temperaturach wpływa na ich niszczenie)

Do oznaczania witaminy A zaleca się metody:

- spektrofotometrii w zakresie nadfioletu

- kolorymetryczne (z trójchlorkiem antymonu, kwasem trójfluorooctowym lub trójchlorooctowym)

- fluorymetryczną

- wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC

Metoda pomiaru spektrofotometrycznego w zakresie nadfioletu:

- metoda polega na pomiarze absorbancji all-trans-alkoholowej postaci witaminy A w roztworze alkoholu izopropylenowego przy długości fali 325nm

- absorbancji przy tej długości fali jest wprost proporcjonalna do stężenia witaminy A

- metoda ta odnosi się jednak do wolnej, alkoholowej postaci witaminy A

- nie nadaje się do oznaczania witaminy A w produktach spożywczych

Metody kolorymetryczne opierają się na reakcji barwnej jaką daje witamina A z takimi związkami jak:

- trójchlorek antymonu

- kwas trójfluorooctowy

- kwas trójchlorooctowy

W roztworach chloroformu, chlorku metylenu, chlorku etylenu.

Ilość substancji interferujących ogranicza się głównie do karotenoidów oraz produktów rozpadu i pochodnych witaminy A. Dają one podobne zabarwienie ze stosowanymi odczynnikami.

Nadają się do produktów spożywczych.

Metoda kolorymetryczna z reakcją Carr-Price’a polega na pomiarze absorbancji powstałego zabarwienia jakie daje witamina A z trójchlorkiem antymonu (SbCl3) przy długości fali 620nm.

Metoda oznacza zarówno izomery trans jak i cis, których aktywność biologiczna jest różna.

WYKŁAD 7 (19/11/2013)

Metoda kolorymetryczna z reakcją Carr-Price’a polega na pomiarze absorbancji powstałego zabarwienia jakie daje witamina A z trójchlorkiem antymonu (SbCl₃) przy długości fali 620nm.

Metoda oznacza zarówno izomery trans jak i cis, których aktywności biologiczna jest różna.

(Witamina A, karotenoidy – forma naturalna trans, a cis jest niewiele. Cis powstają z trans podczas podgrzewania, procesów technologicznych)

W przypadku produktów wzbogacanych w syntetyczną witaminę A, zawierających izomery cis, wskazane jest oznaczenie obu form, poprzez zastosowanie bezwodnika maleinowego, który reagując z izomerami cis zapobiega ich reakcji z SbCl₃.

Niedogodnością w tej metodzie jest:

- krótkotrwałe zabarwienie z SbCl3 (5-10s)

- właściwości korozyjne trójchlorku antymonu

- wpływ temperatury

- ślady wody lub alkoholu uniemożliwiają pomiar.

Wykonanie oznaczenia

Wielkość naważki:

- wielkość naważki badanej próbki zależy od spodziewanej ilości witaminy A

- roztwór chloroformowy powinien zawierać 5-15 j.m. witaminy w 1cm3

- wielkość naważek:

W tłuszczach i olejach -> 2-10g

W innych produktach -> 5-20g

W produktach ubogich w witaminę -> 20-40g.

Postępowanie analityczne obejmuje etapy:

1. Zmydlanie

2. Ekstrakcję

3. Ewentualne oczyszczenie za pomocą chromatografii

4. Pomiar zawartości witaminy A

ZMYDLANIE próbki – proces ten ma na celu:

- rozłożenie glicerydów do związków rozpuszczalnych w wodzie tj., glicerolu i soli potasowych kwasów tłuszczowych (mydeł)

- rozkład połączeń białkowo-witaminowych.

- za pomocą silnej zasady np. KOH

50% roztwór wodorotlenku potasowego (KOH)

- 0,5cm3 KOCH na 1g próbki

- w tłuszczach 1cm3/1g

- do produktów mieszanych (np. racji pokarmowych) roztwór ługu powinien być bardziej stężony

Ilość dodawanego do zmydlania alkoholu absolutnego powinna wynosić 2 razy więcej niż masa próbki a przy tłuszczach kilkakrotnie więcej. Stosunek alkoholu do KOCH w wielu analizach wynosi 1:10.

Witamina A, karotenoidy i sterole zachowują swoje pierwotne właściwości fizykochemiczne tworząc tzw. frakcję związków niezmydlających się którą można następnie wyekstrahować rozpuszczalnikami organicznymi. Czasami zaleca się uprzednie wyekstrahowanie tłuszczu z suchego materiału (np. w aparacie Soxhleta), a następnie przeprowadzenie hydrolizy (zmydlania).

Czas zmydlania od 10 do 60 minut zależnie od produktu.

Dodatek przeciwutleniacza – np. hydrochinon, pirogallol, BHT.

Proces zmydlania należy prowadzić w następujący sposób:

- odważoną w kolbie stożkowej próbkę zalać alkoholem

- dodać określoną ilość ługu

- całość wymieszać i umieścić na łaźni wodnej pod chłodnicą powietrzną

- ogrzewać do wrzenia, aż do całkowitego sklarowania próby

EKSTRAKCJA

Hydrolizat ekstrahować kilkakrotnie (3-5razy) mieszaniną eteru dietylowego i naftowego uniemożliwiając rozdzielenie się warstw: górnej(eterowej) i dolnej(wodnej).

OCZYSZCZANIE ZA POMOCĄ CHROMATOGRAFII KOLUMNOWEJ

Chromatografia na tlenku glinu – eliminuje przeszkadzające w oznaczeniu witaminy A karotenoidy

Chromatografia na tlenku magnezu – eliminuje kryptoksantynę oraz jednohydroksypochodne karotenoidów.

POMIAR ZAWARTOŚCI WITAMINY A

-zagęścić ekstrakt eterowy na łaźni wodnej lub w wyparce próżniowej rotacyjnej w atmosferze azotu

- wykonać reakcję Carr-Price’a (w kuwecie kolorymetrycznej)

0,1cm3 roztworu chloroformowego witaminy A

+2-3 krople bezwodnika kwasu octowego

+ 1cm3 25% chloroformowego roztworu SbCl3

- zmierzyć absorbancji w czasie 5-10s przy długości fali 620nm wobec próby ślepej (chloroform i bezwodnik kwasu octowego).

METODA FLUOROMETRYCZNA

-metoda bardziej czuła i dokładniejsza od metod kolorymetrycznych

- próbka wymaga uprzedniego zmydlenia i ekstrakcji

- w metodzie tej wykorzystuje się zjawisko emisji żółto-zielonej fluorescencji przez witaminę A pod wpływem wzbudzenia promieniowaniem UV (330-340nm); światło emitowane 480nm.

- metoda wymaga przygotowania krzywych standardowych i ustalenia poprawki na fluorescencję fytofluenu.

Znajduje szczególne zastosowanie do oznaczeń witaminy A w mleku i produktach mlecznych, ponieważ te produkty nie zawierają fytofluenu.

METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

- będzie omawiana dokładnie na innym wykładzie

- próbka jest zmydlana , a następnie ekstrahowana kilkakrotnie mieszaniną eterów etylowego i naftowego

- zawartość witaminy A jest oznaczana przy pomocy HPLC w układzie faz odwróconych z detektorem UV/VIS : długość fali 326nm, eluent – 98% etanolu + 2 % wody

- analizę ilościową należy przeprowadzić na podstawie powierzchni piku

- możliwe jest również przeprowadzenie analizy przy użyciu detektora fluorymetrycznego

- umożliwia rozdział różnych form witamin i każdą ilościowo oznaczyć, można rozdzielić również izomery

β-KAROTEN

Karotenoidy o właściwościach prowitaminy A są nazwą opisową dla wszystkich karotenoidów wykazujących aktywność biologiczną β-karotenu.

Zawartość b-karotenu w wybranych produktach spożywczych w µg/100g

• Warzywa i owoce:

- marchew, dynia, botwina, papryka czerwona, szczaw, szczypiorek, szpinak, natka pietruszki pow. 3000

- agrest, arbuz, brzoskwinia, morele, pomarańcza, śliwki, wiśnie pow. 100

• Produkty mleczne:

- Sery podpuszczkowe 100-400

- Mleko w proszku pełne 150

- Śmietany ` 50-190

- Sery twarogowe 3-60

Zwierzęta nie mają zdolności syntetyzowania karotenoidów, ale mogą wchłaniać i gromadzić barwniki dostarczane z paszą. Stąd niektóre produkty pochodzenia zwierzęcego np. mleko, masło, jaja zawierają karotenoidy.

Marchew-betakaroten

Pomidory-likopen

Owoce palmy – kryptoksantyna

Wykorzystanie b-karotenu z diety:

Zwiększa:

+ odpowiednia ilość i jakość białka

+ rodzaj, ilość i świeżość tłuszczu

+ obecność środków emulgujących

+ obecność pro i przeciwutleniaczy

Zmniejsza:

- obecność błonnika

- zbyt duża ilość żelaza

- obecność azotanów i azotynów

- alkohol

-wolne rodniki

Wykorzystanie beta karotenu z dziennej racji pokarmowej wynosi około 30%.

1 j.m. = 0,6 µg βkarotenu

1,2 µg innych karotenoidów o aktywności biologicznej prowitaminy A

1 równoważnik (ekwiwalent) retinolu = 6µg βkarotenu

12 µg pozostałych prowitamin A

Karotenoidy wykazują następujące właściwości fizyczne i chemiczne:

- rozpuszczalne w tłuszczach

- łatwo rozpuszczalne w chloroformie, benzenie, eterze naftowym, trudno rozpuszczalne w alkoholu

- są wrażliwe na utlenianie, autooksydacje, światło

- są oporne na działanie podwyższonej temperatury w atmosferze beztlenowej z wyjątkiem zmian stereoizomerycznych

- maja charakterystyczne widmo absorbancji z rożnym maksimum zależnie od stosowanego rozpuszczalnika.

Do oznaczania karotenoidów zaleca się metody:

Najczęściej stosowaną metodą oddzielenia i oznaczania różnych karotenoidów jest chromatografia kolumnowa.

Różnice w budowie poszczególnych barwników pozwalają na rozwiniecie na kolumnie chromatograficznej wyraźnych stref adsorpcji przy zastosowaniu odpowiedniego adsorbentu i mieszanin eluujących.

Z różnych stosowanych adsorbentów do rozdziału karotenoidów najlepszy jest tlenek magnezu i celit zamieszane w stosunku 1:3 z zastosowaniem do wymywania 2-5% acetonu w eterze naftowym (umożliwia rozdział karotenoidów).

METODA OZNACZANIA BETAKAROTENU Z ZASTOSOWANIEM CHROMATOGRAFII KOLUMNOWEJ

Metoda polega na pomiarze przy długości fali świetlnej 450nm absorbancji eterowych roztworów ….

Wykonanie oznaczeniu b-karotenu

Postępowanie analityczne obejmuje etapy:

1)

2)

3)

4)

Ekstrakcja karotenoidów

- odważyć 5-10g zhomogenizowanej próbki zawierającej 10-500 µg karotenoidów

- wykonać ekstrakcję karotenoidów po uprzednim zmydleniu próby eterem naftowym (zmydlanie próbki zalecane jest przede wszystkim do produktów pochodzenia zwierzęcego raz mieszanych i zawierających tłuszcz)

- lub po roztarciu próby z bezwodnym siarczanem sodu, do uzyskania jednorodnej, suchej masy

- uzyskany ekstrakt eterowy odparować do sucha w atmosferze azotu na łaźni wodnej lub w wyparce próżniowej rotacyjnej

- suchą pozostałość rozpuścić w 1-2cm3 eteru naftowego.

WITAMINA E

Jest to grupa związków obejmująca wszystkie pochodne tokoli i tokotrienoli wykazujących aktywność biologiczną alfa-tokoferolu zawierająca 4 tokoferole i 4 tokotrienole.

Tokole położenie grupy metylowej

Alfa-tokotrienol 5,7,8

Beta 5,8

Gamma 7,8

Zawartość witaminy E w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

Kasza jęczmienna 0,5

Płatki owsiane 0,8

Kiełki pszenicy 10-26

Warzywa 0,1-2,5

Owoce ,02-1,3

Ryż 0,2

Margaryny 5-37

Olej słonecznikowy 48-52

Sojowy 4-14

Rzepakowy 15-22

Wykorzystanie wit E z dziennej racji pokarmowej wynosi od 20 do 80% - średnio 40%.

Wit E jest wrażliwa na działanie:

- tlenu

- ogrzewania powyżej 200stC

- obecność katalizatorów (np. śladów miedzi, żelaza) w wysokich temp wpływa na jej niszczenie

- środowiska kwaśnego i zasadowego

Na wykorzystanie z diety wit E wpływa:

- obecność wielonienasyconych kwasów tłuszczowych

[Alfa-tokoferol (mg) ?NNKT (g) = 0.6]

- selen, cynk, żelazo, miedź

- witamina A

- witamina C

- metale ciężkie

- nitrozoaminy

- dwutlenek azotu

Wykład 8

Do oznaczania witaminy E zaleca się metody

• Kolorymetryczną z reakcją Emmerie-Engla

• Fluorymetryczną

• Wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC)

• Chromatografię gazową (GC)

Oraz metody biologiczne

Etapy poprzedzające oznaczanie właściwe metodami chemicznymi

1. Przygotowywanie próbki

Wielkość naważki – w zależności od rodzaju produktu 2- (ilość tokoferoli do oznaczenia 4-60 mikrogram)

Zalecane sposoby przygotowania próbki

• Tłuszcze i oleje – lekko ogrzać do stopienia, dobrze wymieszać, wykonać naważkę i zmydlać bezpośrednio

• Mleko płynne, w proszku, odżywki mleczne – wyekstrahować tłuszcz poprzez wytrząsanie kolejno próby z alkoholem etylowym, eterem etylowym, eterem naftowym, zebrane frakcje eterowe połączyć i odparować do sucha otrzymując tłuszcz

• Produkty zawierające większą ilość wody – utrzeć z bezwodnym siarczanem sodu aż do otrzymania suchej mieszaniny. Przenieść ilościowo do gilzy aparatu Soxhleta i prowadzić ekstrakcję tłuszczu alkoholem etylowym absolutnym w ciągu 10-16 godzin

• Produkty suche – zemleć, umieścić w gilzie aparatu Soxhleta, prowadzić ekstrakcję alkoholem etylowym absolutnym w ciągu 10-16 godzin. Otrzymany ekstrakt wytrząsać z eterem naftowym, zebraną frakcję eterową odparować do sucha otrzymując tłuszcz

2. Zmydlanie próby (hydroliza zasadowa)

• Prowadzić na wrzącej łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną w atmosferze azotu przy użyciu stężonego (50-60%) wodorotlenku potasu (0,5-1 cm3/1 g próbki) i małej ilości alkoholu w obecności przeciwutleniaczy (pirogallolu, kwasu askorbinowego lub hydrochinonu)

• Nadmiar pirogallolu może utrudniać późniejszą chromatografię, ponieważ produkty jego utleniania są rozpuszczalne w eterze i heksanie

• Ograniczyć czas zmydlania do minimum

• Dodatkowym środkiem ostrożności przy zmydlaniu jest zastosowanie czynnika chelatującego (EDTA-Na – wersenianu dwusodowego) w ilości 0,1- dla związania śladów metalu

• Zmydlanie jest etapem, podczas którego mogą zachodzić znaczne straty tokoferoli, dlatego należy przeprowadzić odzysk dodawanego alfa-tokoferolu

3. Ekstrakcja witaminy

• Po zmydleniu przeprowadzić 3-krotną ekstrakcję porcjami mieszaniny eterów dietylowego (wolnego od nadtlenków) i naftowego (1:2)

• Połączone ekstrakty przemyć kilkakrotnie wodą do odczynu obojętnego (wobec fenoloftaleiny), a następnie przesączyć w celu osuszenia przez warstwę bezwodnego siarczanu sodu

• Odparować rozpuszczalnik do sucha w atmosferze azotu

• Stosować np. benzen, heksan, lub bezwodny etanol jako rozpuszczalniki suchej pozostałości

4. Rozdział chromatograficzny (niezbędny przy wykonywaniu oznaczenia metodą kolorymetryczną lub fluorymetryczną)

• Nanieść za pomocą mikropipety lub mikrostrzykawki benzenowy roztwór na płytkę chromatograficzną pokrytą żelem krzemionkowym z dodatkiem 0,004% soli sodowej fluoresceiny (uraniny)

• Naniesione krople suszyć strumieniem azotu

• Natychmiast po zakończeniu nakładania próbek i standardu umieścić płytkę w komorze chromatograficznej zawierającej rozpuszczalnik (np. benzen:alkohol etylowy 99:1 lub chloroform lub benzen:alkohol metylowy 98:2); komorę przykryć

• Gdy czoło rozpuszczalnika dojdzie do szczytu płytki, wyjąć ją z komory, osuszyć w strumieniu azotu i w świetle UV (366 nm lub 254 nm) obrysować identyfikując poszczególne zgaszone plamy tokoferoli (standardu i próby badanej)

• Można również dodatkowo spryskać płytki odczynnikiem wywołującym zabarwienie (np. stosując mieszaninę 0,1% chlorku żelazowego i alfa-alfa’-dwupirydylu (1:1) lub 0,2% roztwór 4,7-dwufenylo-1,10-fenantroliny w alkoholu etylowym lub kwas fosforomolibdenowy

5. Eluowanie

• Zakreślone na płytce obszary żelu zeskrobać za pomocą szpatułki, przenieść do poszczególnych próbówek wirówkowych

• Dodać alkohol etylowy, energicznie wytrząsać, a następnie całość odwirować

• Po odwirowaniu część płynu znad osadu pobrać do oznaczeń kolorymetrycznych lub fluorymetrycznych

Oznaczanie kolorymetryczne z reakcją Emmerie-Engla

• Pobrać uprzednio przygotowane po rozdziale chromatograficznym poszczególne roztwory otrzymanych tokoferoli do próbówek kolorymetrycznych dodając 0,5% roztwór α-α’-dwupirydylu i 0,2% roztwór chlorku żelazowego

• Powstałe zabarwienie mierzyć w ciągu 1-2 minut przy długości fali 520 nm, wobec próby odczynnikowej

• W reakcji tej wykorzystuje się właściwości redukcyjne tokoferoli w stosunku do jonów żelazowych (Fe3+ Fe2+)

• Powstałe jony żelazawe łącząc się z α-α’-dwupirydylem dają barwny czerwony kompleks

• Przez zastąpienie α-α’-dwupirydylu 4,7-dwufenylo-1,10-fenantroliną do redukcji żelaza zwiększa się około 3-krotnie czułość metody, a czas reakcji ulega skróceniu do 10-30 sekund; pomiar natężenia barwy 534 nm

METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

• Wykonaną naważkę badanego produktu zmydlić, a zmydlony hydrolizat ekstrahować mieszaniną eterów etylowego i naftowego (1:2); osuszone połączone ekstrakty odparować w atmosferze azotu, a suchą pozostałość rozpuścić w bezwodnym etanolu

• Nanieść roztwór badanej próbki na aparat

• Jako fazę ruchomą stosować roztwór metanolu i wody (98:2), długość fali 285 nm; szybkość przepływu 1,2 ml/min

• Analizę ilościową przeprowadzić na podstawie powierzchni pików próby badanej i standardów witaminy E

WITAMINA C

Właściwości witaminy C wykazuje

• Kwas L-askorbinowy

• Jego forma utleniona – kwas L-dehydroaskorbinowy (wzory)

Zawartość witaminy C w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

Warzywa

• Brukselka, brokuły, chrzan, kalafior, kalarepa, kapusta włoska, papryka, natka, szpinak pow 60

• Ziemniaki 11-16

Owoce

• Cytryna, grejpfrut, kiwi, pomarańcza, porzeczki, poziomki, truskawki, dzika róża pow. 40

Produkty zwierzęce

• Wątroby 20-30

• Mleko i produkty mleczne 0-3

Witamina C jest

• Wrażliwa na utlenianie, zwłaszcza w obecności katalizatorów (szczególnie Cu²⁺ i Fe³⁺)

• Wrażliwa na aktywność enzymów utleniających (oksydazy askorbinowej, peroksydazy, polifenolooksydazy)

• Najbardziej stabilna w środowisku kwaśnym (dodanie do próby 2-3% kwasu szczawiowego w celu stabilizacji lub 3% kwasu metafosforowego (HPO3) lub 8% kwasu octowego czy 2% kwasu solnego)

• Nietrwała w środowisku zasadowym i obojętnym

• W roztworach wrażliwa na ogrzewanie

• Wrażliwa na naświetlanie promieniami UV

Do oznaczania witaminy C zaleca się metody:

• Metodę Tillmansa (do oznaczania kwasu askorbinowego)

• Metodę Tillmansa w modyfikacji Pijanowskiego (do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego)

• Metodę fluorymetryczną (do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego)

• Metodę z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (do oznaczania kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego jako oddzielnych związków)

METODA TILLMANSA W MODYFIKACJI PIJANOWSKIEGO

- Metoda Tillmansa polega na redukcji 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu o barwie niebieskiej przez kwas askorbinowy w środowisku kwaśnym do bezbarwnego związku

- W punkcie równoważnikowym nadmiar wprowadzonego indofenolu wywołuje pojawienie się różowego zabarwienia roztworu

- Modyfikacja Pijanowskiego dotyczy wstępnego zredukowania siarkowodorem (H2SO4 + Na2S) kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego i usunięciu nadmiaru siarkowodoru za pomocą chlorku rtęci (HgCl2)

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Przygotowanie próby i jej stabilizacja przy użyciu 3% kwasu szczawiowego

2. Redukcja kwasu L-dehydroaskorbinowego do kwasu L-askorbinowego przy użyciu siarkowodoru (H2S)

3. Miareczkowanie mianowanym roztworem 2,6-dwuchlorofenoloindofenolu kwasu L-askorbinowego do momentu pojawienia się różowego zabarwienia

Niedogodności metody:

I. Redukcja indofenolu może zachodzić również pod wpływem innych reduktonów, o mniejszym powinowactwie do indofenolu, np.

• SO2 (dodawany do produktów w celu ich utrwalenia – pulpy, przeciery, moszcze). Przepuszczenie przez próbkę strumienia dwutlenku węgla powoduje ulatnianie się dwutlenku siarki

• Jonów Fe²⁺; kwas octowy eliminuje wpływ dwuwartościowego żelaza na wynik miareczkowania

• Reduktonów cukrowych (triozoreduktonów) powstających podczas ogrzewania, szczególnie w środowisku alkalicznym; Zawartość reduktonów cukrowych ustala się w oddzielnej próbce tego samego materiału, po uprzednim związaniu reduktonów białkowych i kwasu L-askorbinowego za pomocą 8% formaldehydu, przy pH = 3,5 w czasie 8 minut. Wynik miareczkowania odpowiada zawartości reduktonów cukrowych

• Reduktonów białkowych zawierających grupy sulfhydrylowe (-SH), które w reakcji z 2,6 – dichloroindofenolem są utleniane do grup dwusiarczkowych; zawartość reduktonów białkowych ustala się po ich związaniu 4% formaldehydem, przy pH = 0,6 w czasie 8 minut. Wynik miareczkowania odpowiada zawartości reduktonów cukrowych i kwasu L-askorbinowego

• Barwników antocyjanowych podlegających utlenieniu odczynnikiem Tillmansa

II. Uchwycenie punktu równoważnikowego przy analizowaniu produktów zawierających znaczne ilości barwników wodorozpuszczalnych o barwie zbliżonej do odczynnika Tillmansa (np. antocyjanów o barwie amarantowej) jest utrudnione i wymaga zastosowania rozpuszczalników organicznych (np. ksylenu, benzenu, chloroformu), w których rozpuszcza się nadmiar indofenolu

III. Metody tej nie należy stosować do produktów zawierających znaczne ilości substancji zasadowych

METODA FLUORYMETRYCZNA

Metoda polega na utlenieniu kwasu L-askorbinowego do L-dehydroaskorbinowego i przeprowadzeniu reakcji z o-fenylenodiaminą, w wyniku której powstaje fluoryzujący kompleks. Jego stężenie określa się na podstawie pomiaru fluorymetrycznego przy długości fali światła wzbudzającego 365 nm i w obecności filtru wtórnego o przepuszczalności światła 430 nm. Natężenie fluorescencji jest wprost proporcjonalne do stężenia witaminy C w badanym roztworze

Metoda fuorymetryczna eliminuje negatywny wpływ

• Barwników antocyjanowych

• Reduktonów w żywności

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1. Ekstrakcja witaminy z próbki produktu i jej stabilizacja przy użyciu mieszaniny kwasów metafosforowego i octowego. Mieszanina ta zapobiega utlenianiu witaminy przez jony miedzi i żelaza oraz inaktywuje enzymy poprzez denaturację białka

2. Utlenienie kwasu L-askorbinowego do formy dehydro przez zastosowanie wytrzasamoa z węglem aktywowanym

3. Pomiar fluorescencji kompleksu kwasu dehydroaskorbinowego z o-fenylenodiaminą

Wykład 9

Oznaczanie witaminy C:

- metoda Tillmansa (oznaczanie kwasu askorbinowego)

- metoda Tillmansa z modyfikacją Pijanowskiego (oznaczanie sumy kwasów askorbinowego i dehydroaskorbinowego)

- metody fluorymetryczna (do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego)

- metoda z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC (do oznaczania kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego jako oddzielnych związków)

Metoda fluorymetryczna:

- polega na utlenieniu kwasu L-askorbinowego do L-dehydroaskorbinowego i przeprowadzeniu reakcji z 0-fenylenodiaminą, w wyniku której powstaje fluoryzujący kompleks, jego stężenie określa się na podstawie pomiaru fluorymetrycznego przy długości fali światła wzbudzającego 365nm i w obecności filtru wtórnego o przepuszczalności światła 430nm.

- eliminuje negatywny wpływ barwników antocyjanowych i reduktonów w żywności.

- etapy – skrypt

(mieszanina kwasów metafosforowego i octowego – zapobiega utlenianiu witaminy przez jony miedzi i żelaza oraz inaktywuje enzymy poprzez denaturację białka)

TIAMINA – WITAMINA B1

- występuje w produktach w postaci:

Niezestryfikowanej tzw wolna tiamina

Fosforanów (mono, di i trifosforanów)

Zawartość tiaminy w wybranych produktach spożywczych w mg/100g:

- jaja kurze całe 0,065

- mięso wieprzowe 0,4-1

- pozostałe mięsa 0,04-0,18

- wędliny 0,04-0,9

- ryby i przetwory rybne 0,02-0,25

- mleko i produkty mleczne 0,02-0,05

- nasiona strączkowe suche 0,7-0,8

- produkty zbożowe 0,1-0,7

- warzywa i owoce świeże 0,02-0,1

Wrażliwa na działanie:

- temp. Powyżej 100 st. C (odporna na ogrzewanie jedynie w środowisku kwaśnym)

- tlenu i promieni jonizujących

- niskich temp. ( w środowisku obojętnym lub alkalicznym)

- dwutlenku siarki

- tiaminazy (obecnej np. w surowych rybach i mięczakach)

- katalizatorów Cu2+ i Fe3+

Oznaczanie – metody:

- tiochromowa

- za pomocą techniki HPLC

- mikrobiologiczne, w których jako organizm testowy używane są różne drobnoustroje, do których wzrostu niezbędna jest tiamina np. Lactobacillus fermenti i viridescens, Kloeckera brevis, Ochromonas danica i inne.

Metoda tiochromowa:

• Polega na utlenianiu tiaminy przy użyciu K3Fe(CN)6 w środowisku zasadowym do tiochromu który oznacza się intensywną niebieską fluorescencją (435nm) po naświetleniu światłem o długości fali 365nm.

• Utlenianie chlorowodorek tiaminy -> chlorek (pod wpływ NaOH)

Chlorek -> hydroksyd

Hydroksyd -> tiochrom

Przed przeprowadzeniem reakcji utleniania konieczne jest:

- uwolnienie tiaminy z połączeń białkowo-fosforanowych w jakich występuje naturalnie w produktach za pomocą hydrolizy kwasowej i enzymatycznej

- oddzielenie jej od innych substancji fluoryzujących i interferujących poprzez oczyszczenie roztworu na kolumnie jonowymiennej wypełnionej amberlitem

WITAMINA B2:

Zawartość ryboflawiny w prod. Spoż w µg/100g:

- produkty o zawartości powyżej 1000mikrog : drożdże, mleko w proszku

- produkty o zawartości 400-1000 makrela, grzyby, dery, jajko

- 100-400 strączkowe suche, mięso, ryby, mleko, kasza gryczana, płatki owsiane, kukurydza, brokuły

- poniżej 100 większość owoców i warzyw, zbożowe

- wrażliwa na działanie:

- temp w środowisku obojętnym lub alkalicznym (odporna na ogrzewanie w środowisku kwaśnym)

- światła i promieni UV

- katalizatorów cu2+ i fe3+

Oznaczanie – metody:

- fluorymetryczna

- lumiflawinowa

- za pomocą techniki HPLC

- mikrobiologiczne

Metoda fluorymetryczna:

- polega na pomiarze charakterystycznej dla ryboflawiny zielonożółtej fluorescencji o maksymalnej intensywności przy ph 7, długości fali światła wzbudzającego 450nm, i światła emitowanego 524nm.

- pomiary wykonywane są jednakże przy pH około 4,5 ( w granicach 3-5) ponieważ przy takim pH intensywność fluorescencji jest stosunkowo stała i niezależna od szeregu czynników interferujących (tj. stężenia soli czy cukrów, obecności jonów żelaza itp.)

- etapy:

a) ekstrakcja witaminy – ma na celu uwolnienie witaminy z połączeń białkowo-fosforanowych przez zastosowanie hydrolizy kwasowej i enzymatycznej

b) utlenienie substancji interferujących – stosowane w celu usunięcia innych substancji fluoryzujących i interferujących

c) pomiar fluorymetryczny – wykonywany jest przed i po chemicznej redukcji ryboflawiny tak, aby z różnicy tych wartości określić faktyczne stężenie witaminy w roztworze

metoda lumiflawinowa:

- polega na przeprowadzeniu nierozpuszczalnej w chloroformie ryboflawiny pod pływem naświetlania w środowisku zasadowym…. Skrypt

Przygotowanie próbki do oznaczania składników mineralnych

Jednym z etapów oznaczania składników mineralnych jest zmineralizowanie próbki produktu w celu przeprowadzenia składników mineralnych do roztworu. (utlenienie substancji organicznych tj białek, tłuszczów, węglowodanów do co2 , h2o i amoniaku)

Metody rozkładania substancji organicznych (utleniania) można podzielić na trzy grupy metod:

1. Mineralizacja na sucho – spopielanie w wysokiej temperaturze

2. Mineralizacja na mokro – utlenianie za pomocą kwasów mineralnych

3. Mineralizacja poprzez stapianie próbki produktu z substancjami utleniającymi

W analizie produktów spożywczych powszechnie stosowane są dwie pierwsze metody.

Zawartość [g/100g]:

- otręby pszenne 6

- mleko w proszku pełne 6

- wędliny 2-5

- jaja kurze całe 1

- ryby i przetwory rybne 1-2

- tłuszcze 0,2

…. SKRYPT

Popiół – pozostałość po całkowitym spaleniu (mineralizacji) substancji organicznych produktu

- poziom popiołu w żywności jest miarą zawartości oszacowaniem – w niej zawartych składników mineralnych

- termin ten nie odpowiada dokładnie pojęciu „składniki mineralne” ponieważ w czasie spalania mogą ulegać utlenianiu lub innym stratom (np. chlorki)

- popiół może zawierać w swoim składzie także zanieczyszczenia (np. piasek)

Główne składniki popiołu: K, Na, Ca, Mg, Fe, Cl, P, S

Inne metale i metaloidy występują w popiele w mniejszych ilościach.

Odczyn popiołu może być:

-zasadowy (przewaga K, Na, Ca, Mg – warzywa, owoce, mleko)

- kwaśny (więcej Cl, P, S – zbożowe, jaja, mięso, ryby).

Popiół oprócz natywnych składników mineralnych może zawierać pozostałości substancji obcych dodawanych celowo (np. sól kuchenna) lub środków chemicznych

Badania zawartości popiołu w prod. Spoż przeprowadza się w celu:

- określenia wartości odżywczej produktów

- oznaczenia zawartości metali ciężkich (np. kadmu, ołowiu)

- oceny jakości badanych prod. Spoż.

- określenia poziomu zanieczyszczeń mineralnych żywności (np. piasku, kurzu)

Charakterystykę popiołu przeprowadza się przez oznaczenie:

- zawartości popiołu całkowitego (surowego)

- zawartości popiołu nierozpuszczalnego w kwasie solnym 10%

……………………….

Zawartość popiołu całkowitego - masa popiołu oznaczonego bezpośrednio po mineralizacji

Mineralizacja na sucho – spopielanie:

- metoda polega na określeniu masy zmineralizowanej próbki

Próbka popiołu musi być wolna od śladów węgla

- spopielanie polega na ogrzewaniu próbki w tyglach lub parowniczkach porcelanowych, kwarcowych bądź platynowych, w dostępie powietrza, zazwyczaj w piecach muflowych

- podczas spalania istnieje możliwość strat składników mineralnych związanych z lotnością w wyższych temperaturach (np. siarki i chlorowców) dlatego proces ten musi być prowadzony w znormalizowanych warunkach.

Czynnikami wymagającymi kontroli są:

- temperatura, czas spalania, uzyte naczynia

Dla większości produktów zalecana jest temp. 550-600 st C

Dla zbóż i produktów zbożowych 900 st C ( nie zawierają chlorków)

Czas spalania wynosi 16-18h, krótszy czas procesu stosowany jest zwykle do materiału roślinnego lub w przypadku małych naważek

Szybkość spalania zależy od składu badanego materiału; trudniej spalają się substancje kwaśne od zasadowych (zawierające sole łatwo topliwe – chlorki i fosforany, lub zawierające dużo białka i cukrów).

Wykład 10

Fosfor

Zawartość fosforu w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

> 250mg : sery podpuszczkowe, konserwy rybne spożywane z ościami

100-250mg: kasze, ryby, pieczywo ciemne, mięso, sery twarogowe

50-100mg: mleko, jasne pieczywo

poniżej 50mg: większość warzyw, owoce

Wykorzystanie z diety:

Zmniejszają fityniany, szczawiany, błonnik, alkohol.

Wykorzystanie z dziennej racji pokarmowej 60-70%

Oznaczanie:

- metody kolorymetryczna

- metoda fotometrii płomieniowej

Metoda kolorymetryczna:

Polega na przeprowadzeniu fosforanów w fosforomolbideniany, następnie zredukowanie ich w pomiar powstałego błękitu fosforomolbidenowego przy długości fali 700nm.

Do redukcji stosuje się najczęściej metol (siarczan N-metylo-p-aminofenolu) jak też hydrazynę lub siarczan sodu. W metodzie należy ściśle przestrzegać temperatury i czasu pomiaru.

Metoda fotometrii płomieniowej:

Oznaczenie polega na pomiarze w roztworach zmineralizowanej próby natężenia promieniowania emitowanego przez wzbudzone atomy wapnia w płomieniu palnika przed i po usunięciu fosforanów z próby na odpowiednio przygotowanych jonitach.

W metodzie tej wykorzystano obniżenie emisji wapnia przez fosforany, co w pewnym zakresie stężeń jest zależnością liniową. Metoda ta pozwala na równoczesne oznaczenie wapna i fosforu w badanej próbie.

MAGNEZ

Zawartość magnezu w wybranych produktach spożywczych w mg/100g

Powyżej 200mg: kasze gryczane, otręby pszenne, kakao proszek, migdały

100-200mg: strączkowe, orzechy, czekolady

25-100mg : sery podpuszczkowe, ryby, kasze jęczmienne, maki wysokiego wymiału, ciemne pieczywo, niektóre warzywa (groszek, szpinak), niektóre owoce (banany, jeżyny)

25mg: mleko, jaja, mięso, podroby, ryby, jasne mąki i pieczywo, ryż, większość warzyw i owoców

Wykorzystanie z diety magnezu:

Zwiększenie: obecność laktozy, witamina D3, białko

Zmniejszenie: fityniany, szczawiany, błonnik, taniny, tłuszcze, zwiększona zawartość fosforu i wapnia

Magnez z dziennej racji pokarmowej jest absorbowany w 30-40%.

Oznaczanie – metody:

-wagowa

-kompleksometryczna

-kolorymetryczna

-fotometrii płomieniowej

-atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej ASA

Metoda wagowa:

Wyjątkowo pracochłonna, jest obecnie rzadko stosowana

Wady metod kompleksometryczna:

Wada: konieczność usuwania substancji interferujących (głównie anionów fosforanowych i kationów wapnia) oraz zachowanie odpowiedniego stężenia jonów wodorowych, a także słabo widoczna i powolna zmiana barwy w punkcie równoważnikowym pomimo stosowania różnych wskaźników takich jak mureksyd czy czerń eriochromowa.

Metody kolorymetryczne:

Należą do metod słabo specyficznych i wymagają wybiórczego oddzielenia magnezu od innych pierwiastków.

W tym celu stosuje się usuwanie fosforanów na jonitach, związki chelatujące magnez czy roztwory kompensacyjne zawierające interferujące jony.

Metody te stosowane są z uwagi na różne wyposażenie aparaturowe laboratoriów o brak posiadania kosztowej aparatury.

Metoda kolorymetryczna z żółcienią tiazolową

Polega na wykonaniu pomiaru absorbancji barwnego związku powstałego na skutek reakcji wodorotlenku magnezu z żółcienia tiazolową.

Trwałość i intensywność połączenia zależna jest od sposoby alkalizowania próby, obecności innych jonów w roztworze, temperatury roztworu, czasu pomiaru.

W celu zwiększenia trwałości zabarwienia dodaje się hydroksyloaminę

Skrobia – koloid ochronny, zapobiega zmętnianiu roztworu

Roztwory kompensacyjne – w celu wyeliminowania interferencji jonów

Metoda fotometrii płomieniowej

Oznaczenie polega na pomiarze w roztworach zmineralizowanej próby natężenia promieniowania emitowanego przez wzbudzone atomy magnezu w płomieniu palnika.

Zastosowanie tej metody wymaga pozbawienia badanego roztworu jonów interferujących, a szczególnie fosforanów poprzez dodatek roztworu kompleksującego lub usunięcia wyżej wymienionych związków na jonitach.

Metoda ASA

Metoda polega na pomiarze absorpcji promieniowania lampy katodowej przy długości fali 285,2nm przez wolne atomy Mg znajdujące się w roztworze próbki wprowadzonej do płomienia palnika acetyleno-powietrznego w formie rozpylonej i obliczeniu zawartości tego pierwiastka na podstawie krzywej standardowej. Interferencja anionów fosforanowych, kationów wapniowych czy szczawianów usuwana jest przez sole strontu czy lantanu.

CHLOR

Zawartość w mg/100g:

1200-3500mg: ryby wędzone, sery podpuszczkowe, ogórki kiszone, kapusta kiszona, wędliny, przetwory mięsne, mleko w proszku

1000-1200mg: pieczywo

300-600mg: sok pomidorowy, koncentraty pomidorowe

Poniżej 300mg: mleko i napoje mleczne, jaja, mięso, podroby, ryby świeże, strączkowe, warzywa i owoce

W produktach spożywczych sól występuje jako:

- naturalny składnik

- dodatek do żywności dozowany podczas przemysłowego jej przetwarzania ze względu na poprawę cech organoleptycznych produktu jak i na udowodnione właściwości konserwujące i funkcjonalne.

Pierwiastki te wchłaniane są prawie całkowicie w jelicie cienkim.

Chlor i chlorki w produktach spożywczych oznacza się metoda objętościowymi:

Metoda Volharda

Metoda polega na dodaniu w nadmiarze azotanu srebra do zakwaszonego kwasem azotowym roztworu chlorków. Nadmiar azotanu srebra odmiareczkowuje się rodankiem sodu lub potasu w obecności siarczany żelazowo-amonowego jako wskaźnika. Nadmiar rodanku potasu reaguje z Fe(III) powodując w punkcie równoważnikowym powstawanie jasno ceglastego kompleksu. Zaleta: możliwość miareczkowania chlorków w środowisku kwaśnym.

Metoda Mohra:

Oparta jest na argentometrycznym miareczkowaniu chlorków w środowisku obojętnym azotanem srebra w obecności chromianu potasowego jako wskaźnika.

Po wytrąceniu się chlorku srebra nadmiar azotanu srebra reaguje z chromianem dając brunatnoczerwone zabarwienie.

Ważne jest, aby odczyn roztworu podczas przebiegu reakcji był obojętny. W środowisku kwaśnym jony wodorowe reagują z jonami CrO₄^2- w wyniku czego powstają jony HCrO^4- i Cr₂O₇^2- co powoduje zmniejszenie stężenia jonów CrO₄^2-a przy niższych ph może w ogóle nie powstać osad dobrze rozpuszczalnego w środowisku kwaśnym Ag₂CrO₄ co wpływa na błędny wynik analiz.

W roztworach silnie alkalicznych następuje wytrącanie osadu Ag₂O wcześniej niż Ag₂CrO_4.

SÓD i POTAS

Zawartość sodu w mg/100g

Powyżej 120mg: produkty przetwarzane z dodatkiem soli kuchennej, podroby

40-120mg: mleko, mięso, wątroba, ryby, drób, niektóre warzywa (szpinak)

Poniżej 40mg: strączkowe, warzywa i owoce, mąki, kasze, orzechy

Zawartość potasu w mg/100g

Powyżej 600mg: strączkowe, niektóre grzyby, orzechy, drożdże

300-600mg L ziemniaki, mięso, drób, szpinak

300mg: pieczywo, mleko, owoce, większość warzyw, ryb

Sód i potas są pierwiastkami prawie całkowicie wchłanianymi w jelicie cienkim.

Oznaczenie:

- fotometria płomieniowa

- ASA

Fotometria płomieniowa:

Oznaczenie polega na pomiarze w roztworach zmineralizowanej próbki natężenia promieniowania emitowanego przez wzbudzone atomu sodu lib potasu w płomieniu palnika i określeniu zawartości tych pierwiastków na podstawie krzywej standardowej.

Przy oznaczaniu sodu i potasu należy zwrócić uwagę na możliwość interferencji jonów zarówno kationów jak i anionów.

Metoda ASA:

Metoda polega na pomiarze absorpcji promieniowania lampy katodowej przy długości fali 589nm przez wolne atomy sodu lub 766,5nm przez wolne atomy potasu znajdujące się w roztworze próbki wprowadzonej do płomienia palnika acetyleno-powietrznego w formie rozpylonej i obliczeniu zawartości tego pierwiastka na podstawie krzywej wzorcowej.

ŻELAZO

Zawartość w mg/100g

9mg: wątroba, otręby pszenne

4-9mg: strączkowe, pietruszka natka, żółtko jaja kurzego

1-4mg mąką, pieczywo, kasze, jaja kurze całe, mięso i wędliny, warzywa

1mg: mleko i przetwory, ryby, owoce świeże, ziemniaki, ryż

Wykorzystanie żelaza z diety:

Zwiększenie: meat factor, obecność kwasu askorbinowego, obecność kwasu foliowego, niektóre aminokwasy (histydyna, l-cysteina), obecność miedzi

Zmniejszenie: fityniany, szczawiany, błonnik, wyższe ph zasadowe, garbniki (taniny), obecność fosforanów, niektóre białka roślinne, obecność wapnia, cynku, kadmu, manganu, wysoki poziom tłuszczu

Wykorzystanie z diety ok 10%.

Oznaczanie:

- metody kolorymetryczne

- metoda ASA

Wśród metod kolorymetrycznych wyróżnia się:

- meto.kolor. oparte na oznaczaniu jonow żelazowych Fe 3+

Metoda rodankowa, metoda z kwasem sulfosalicylowym

- metody kolor. Oparte na oznaczaniu jonów żelazawych Fe 2+

Częściej do oznaczeń żelaza stosowane są metody oparte na oznaczeniu jonów żelazawych Fe2+ ponieważ:

-

-

-

-

(skrypt)

Metoda z o-fenantroliną – skrypt

Metoda ASA

Skrypt

MIEDŹ

Zawartość w produktach spożywczych w mg/100mg

1,0mg : orzechy laskowe

0,5-1,0mg: strączkowe, podroby, otręby pszenne, czekolady

0,1-0,5mg: sery podpuszczkowe, drób, ryby, podroby, kasze, pieczywo ciemne, warzywa zielone, niektóre owoce

0,1mg: mleko i przetwory mleczne, mięso, pieczywo jasne, warzywa niezielone i niektóre owoce

Wykorzystanie:

Zwiększenie: połączenie miedzi z niskocząsteczkowymi związkami organicznymi np. z niektórymi aminokwasami

Zmniejszenie: obecność fitynianów, błonnika, fruktozy i kwasu askorbinowego, zwiększona ilość siarczków, molbidenu, kadmu, zwiększona podaż żelaza lub cynku

Wykorzystanie z diety 50% zależy od składu diety oraz od postaci chemicznej w jakiej miedź występuje.

Metody oznaczania:

- kolorymetryczne

- polarograficzna

- ASA

Metody kolorymetryczne:

Skrypt str 77

Metoda kolorymetryczna dwutiokarbaminianowa – skrypt str 79

Metoda polarograficzna – skrypt strona 77

Metoda Asa – skrypt

CYNK

Zawartość w mg/100g

2-5mg : sery podpuszczkowe, mięso, wątroba, strączkowe

1-2mg: kasze pieczywo ciemne, ryby

Poniżej 1mg: mleko, pieczywo jasne, warzywa i owoce

Wykorzystanie z diety : 10-40%

Zwiększenie: białko zwierzęce, aminokwasy niektóre (cysteina, cystydyna), kwas cytrynowy, askorbinowy,

Zmniejszenie: fityniany, szczawiany, błonnik pokarmowy, garbniki, kwas szczawiowy, zwiększona podaż żelaza niehemowego, miedzi i wapnia

Metody:

-kolorymetryczne

-polarograficzna

- asa

Kolorymetryczna:

Najczęściej stosowana jest metodą ditizonowa, odznaczająca się dużą czułością

Metoda polega na utworzeniu barwnego połączenia cynku z ditizonem a następnie ekstrakcji ditizonianu cynku czterochlorkiem węgla i zoanczeniu absorbancji

Jako środki maskujące wpływ inny pierwiastków, głównie miedzy i ołowiu stosotwany jest zwykle dwuetylodwutiokarbaminian sodowy lub…………

Metoda polarogragicznaL

Rejestruje fale polarograficzną cynku w roztworze zmineraloziwanej próbki

ASA
polega na pomiarze absorpcji promieniowania lampy katodowej przy dlug flai 213,9nm przez wolne…

WYKŁAD 11…… 07.01.14

JOD

Zawartość w produktach spożywczych [µg/100g]:

Powyżej 50µg: dorsz, krewetki, karmazyn, halibut

20-50 µg: flądra, łosoś, makrela, śledź, marchew

5-20 µg: mleko i przetwory, jaja, strączkowe, wątroba, szpinak, seler, ziemniaki, sałata, kapusta

Poniżej 5 µg: mięso, masło, ryż, pstrąg, karp, węgorz, większość warzyw i owoców

Wykorzystanie jodu z diety jest blisko całkowite.

Oznaczanie:

- metody miareczkowe

- metody kolorymetryczne

Metody miareczkowe – polegające na wyekstrahowaniu alkoholem absolutnym jodu w postaci jodku potasowego z popiołu spalonej próbki i miareczkowaniu mianowanym roztworem tiosiarczanu sodowego wobec skrobi jako wskaźnika.

Metody kolorymetryczne

1. I grupa metod, wykorzystująca zdolności tworzenia intensywnego zabarwienia pomiędzy jodem a skrobią.

Metody te w pierwszej części wykonania są identyczne w swoim założeniu z metodą miareczkową a jedynie końcowy fragment polega na spektrofotometrycznym oznaczeniu absorbancji kompleksu jodoskrobiowego przy długości fali 590nm.

1. II grupa - metody polegające na utlenieniu odczynnika organicznego DHPF jodem w kwaśnym środowisku do związku barwnego i pomiarze absorbancji przy 525nm. Metoda stosowana do oznaczenia jodu w rybach i mleku w proszku.

2. III grupa metod – jon jodkowy zawarty w próbce katalizuje przebieg pewnych reakcji, przy czym szybkość reakcji i ilość utworzonych produktów w pewnych przedziałach stężeń są liniowo zależne od zawartości jodku.

ASA – atomowa spektrofotometria absorpcyjna

Wzbudzenie atomów:

Pierwszym etapem w metodach emisyjnych jest wzbudzenie.

- w normalnych warunkach temperatury i ciśnienia atomy znajdują się w stanie podstawowym, zwanym również stanem normalnym lub niewzbudzonym. Stanowi temu odpowiada minimum energii układu.

- elektrony znajdujące się na poziomie podstawowym nie mogą emitować promieniowania ponieważ nie mają możliwości przejścia na zapełnione całkowicie niższe poziomy energetyczne.

- aby zachodziła emisja, należy dostarczyć atomowi kwantu energii, który spowoduje przeniesienie elektronu na wyższy poziom energetyczny.

- atom znajduje się wtedy w stanie wzbudzonym, o większej energii niż energia stanu podstawowego.

Drugim etapem w metodach emisyjnych jest przejście elektronu z wyższego poziomu energetycznego na niższy. Przy przejściu temu towarzyszy wydzielenie energii w postaci promieniowania elektromagnetycznego.

Wzbudzenie optyczne atomów przez dostarczenie energii elektromagnetycznej, wykorzystywane w technice ASA, zachodzi najczęściej po absorpcji promieniowania z zakresie nadfioletu (UV) lub światła widzialnego (VIS), rzadziej promieniowania rentgenowskiego.

Czas trwania atomu w stanie wzbudzonym jest na ogół bardzo krótki i wynosi 10^-8 sekundy.

Wobec krótkiego czasu trwania wzbudzonych atomów, w ciągu jednej sekundy, te same atomy są wielokrotnie wzbudzane i wielokrotnie emitują promieniowanie, co pozwala na ustalenie się równowagi dynamicznej w danych warunkach wzbudzenia, w wyniku czego natężenie emitowanego promieniowania jest stałe.

Zasada ASA:

Atomowa spektrofotometria absorpcyjna , zwana również absorpcją atomową, polega na pomiarze promieniowania monochromatycznego pochłoniętego przez wolne atomy danej substancji.

Metoda ta wprowadzona została w latach 1953-55 i stała się jedną z najczęściej stosowanych instrumentalnych metod analitycznych.

Podstawą asa jest prawo promieniowania Kirchoffa, zgodnie z którym pierwiastek absorbuje promieniowanie a takiej długości fali, jaką emituje w stanie wzbudzonym.

Mierzona absorbancji jest wprost proporcjonalna do liczby atomów w jednostce objętości, czyli do stężenia oraz grubości warstwy absorbującej

Aby mogła zajść absorpcja danego promieniowania dostatecznie duża liczba atomów musi znajdować się w stanie podstawowym

Wolne atomy danego pierwiastka powstające podczas atomizacji przechodzą ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego.

W zależności od sposobu otrzymania wolnych atomów rozróżnia się absorpcyjną spektrofotometrię:

- płomieniową – roztwór próbki rozpyla się bezpośrednio w obszarze płomienia, gdzie następuje kolejno odparowywanie rozpuszczalnika i atomizacja w wyniku dysocjacji termicznej

- bezpłomieniową – gdy następuje elektrotermiczna atomizacja próbki.

Aparatura:

Źródło światła -> atomizer -> monochromator -> detektor, wzmacniacz -> miernik

Promieniowanie ze źródła emitującego widmo liniowe, charakterystyczne dla oznaczanego pierwiastka przechodzi przez atomizer, do którego wprowadzana jest badana próba i pada na szczelinę monochromatora który z kolei oddziela linię rezonansową od pozostałych, co następnie w detektorze zostaje przetworzone na sygnał elektryczny, mierzony na mierniku (pomiar absorbancji).

Źródło promieniowania stanowi na ogół lampa z katodą wnękową. Katoda powinna emitować promieniowanie atomów metalu, który chcemy oznaczyć; Wadę tę eliminują lampy dwu lub trójpierwiastkowe, których katody są wykonane z mieszanin proszków metali.

Atomizacja – zachodzi w atomizerach:

Proces ten jest bardzo krótkotrwały i można w nim rozróżnić następujące etapy:

1. Odparowanie rozpuszczalnika – powstaje aerozol ciało stałe-gaz

2. Stopienie i parowanie stałych cząsteczek – powstają pary soli (MA)

3. Dysocjacja termiczna MA-> M + A

Atomizery płomieniowe

- oznaczany pierwiastek występuje na ogół w formie związku chemicznego, z którego należy wydzielić go w postaci wolnych atomów.

Najczęściej używanym atomizerem jest płomień.

Rozpylane w gazach kropelki cieczy docierają do stożka wewnętrznego (świecąco-redukującego), gdzie odparowują, z związek chemiczny zawierający oznaczany pierwiastek ulega dysocjacji.

Do najczęściej stosowanych płomieni należą płomień:

- powietrze-acetylen, podtlenek azotu-acetylen

(dla pierwiastków tworzących trudno dysocjujące tlenki)

- powietrze-metan

(dla metali łatwo ulegających jonizacji)

Płomień jako atomizer łatwy i tani w użyciu ma wady:

- mała wydajność atomizacji

- absorpcja promieniowania przez gazy płomienia

- niejednorodność oraz interferencje fizyczne i chemiczne

Dlatego też wprowadzono atomizację bezpłomieniową.

Atomizery bezpłomieniowe

Obecnie do atomizacji elektrotermicznej wykorzystuje się głównie atomizery typu kuwety grafitowej.

Urządzenie to jest ogrzewane elektrycznie w czterech etapach:

1. Próbkę odparowuje się w temp 100-200 st C w czasie do kilkudziesięciu sekund

2. Próbka ulega mineralizacji

3. Odparowanie i atomizacja…..

4. …..

Monochromatory

Monochromator ma oddzielić linię rezonansową od innych linii emitowanych przez źródło i płomień, ważnym parametrem pomiaru jest więc szerokość szczeliny monochromatora.

Optymalna szerokość szczeliny jest kompromisem między dobrą rozdzielczością monochromatora, a ilością światła padającego na detektor

Używane monochromatory są to pryzmatu i siatki dyfrakcyjne.

Detektor

Zadaniem detektora jest mierzenie natężenia padającego promieniowania i porównianie wyników do wzorca (krzywej wzorcowej).

Interferencje

Zakłócenia w metodzie ASA można podzielić na trzy grupy:

Zakłócenia spektralne – powstają w wyniku nakładania się linii lub pasm absorpcyjnych i emisyjnych

Dwa różne pierwiastki w roztworze mogą mieć linie absorpcyjne w zbliżonych długościach fali i mogą nawzajem abrosbować emitowane promieniowanie

Zakłócenia fizyczne

Zakłócenia chemiczne

Fotometria płomieniowa

Zasada:

Fotometria płomieniowa jest działem spektralnej analizy emisyjnej i oparta ….

Różnica: Energia pochłaniania przez atom nie pochodzi od lampy z katodą wnękową.

W12

Pierwszy termin – test abcd jedna odp poprawna

Drugi termin – pytania otwarte!

Jeśli nie ma Cię na pierwszym terminie to szybko zwolnienie lekarskie

Wyniki n a ehmsie w piątek po południu (40% egzamin, 60% ćwiczenia)

Chromatografia:

1. Gazowa:

- adsorpcyjna (kolumnowa -> na kolumnach pakowanych lub kapilarna)

- podziałowa (kolumnowa -> na kolumnach pakowanych lub kapilarna)

1. Cieczowa:

- adsorpcyjna (kolumnowa -> klasyczna , wysokosprawna, ciśnieniowa
cienkowarstwowa -> wysokosprawna, ciśnieniowa, planarna)

- jonowymienna (kolumnowa -> klasyczna, wysokosprawna)

- żelowa (kolumnowa -> klasyczna, wysokosprawna)

- podziałowa (kolumnowa -> klasyczna, wysokosprawna, ciśnieniowa)

cienkowarstwowa

1. Fluidalna:

- adsorpcyjna

- podziałowa

(są różne podziały, nie trzeba ich dokładnie znać)

Chromatografia gazowa GC (gas chromatography)

Wszystkie rodzaje chromatografii, jak również chromatografia gazowa opierają się na zasadzie podziału związków między dwie fazy:

Fazę stacjonarną – ciało stałe lub ciecz trudno lotna osadzona na nośniki lub ścianie kolumny (wypełnienie kolumny)

Fazę ruchomą – gaz.

Rozdzielenie substancji dokonuje się przez zróżnicowany podział składników pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną.

Substancje nielotne : sacharydy, aminokwasy, wyższe kwasy tłuszczowe - przed rozdziałem przeprowadza się w lotne pochodne.

Aparatura

Chromatograf:

- butla z gazem nośnym (faza ruchoma)

- dozownik

- urządzenie dozujące (strzykawka)

- detektor

- wzmacniacz sygnału detektora

- komputer z drukarką

- regulator temperatury

- termostat kolumny (w nim są zamknięte kolumny, podgrzewa kolumnę)

- kolumna (faza stała – na nią nanosimy próbę)

- przepływomierz

- odtleniacz

- regulator przepływu gazu

Schemat chromatografu gazowego:

Gaz nośny (faza ruchoma)

Najczęściej stosuje się gazy obojętne, chemicznie bierne:

- hel

- azot

- argon

- wodór

Przy wyborze gazu uwzględnia się detektor stosowany w analizie (np. detektor promieniowo-jonizacyjny).

Kolumny (faza stacjonarna)

W chromatografii gazowej stosuje się dwa rodzaje kolumn:

- kolumny z wypełnieniem o średnicy 2-8mm, długości kilku metrów

- kolumny kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,2-0,3mm , długości do kilkuset metrów, o otwartym przekroju dla przepływu gazu nośnego co znacznie polepsza rozdział w porównaniu z kolumnami pakowanymi (te kolumny stosuje się w analizie żywności).

Kolumny mają najczęściej postać spiralnych nawiniętych na walec rurek, tak aby można było umieścić je w termostacie.

Materiałem do wyrobu kolumn jest szkło, stal, teflon. Szkło i teflon używane są do analizy substancji rozkładających się podczas procesu rozdziału.

Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych mogą być absorbentami lub cieczami osadzonymi na ściankach kapilar.

- kolumny z warstwą porowatą wypełnioną absorbentem, zwane PLOT (porous layer open tubular)

- kolumny z gładkimi ściankami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną tzw. WCOT (wall coated open tubular)

- kolumny, na ścianki których naniesiono nośnik nasycony fazą stacjonarną, SCOT (suport coated open tubular).

(tym się za bardzo nie przejmujemy)

Wypełnienie kolumn zależy od rozdzielanych związków.

Podstawowym kryterium podziału faz jest ich polarność.

Do niepolarnych faz należą między innymi węglowodory oraz silikony grupa wysokotemperaturowych faz stacjonarnych stosowana jest do rozdziału m.in. wyższych kwasów tłuszczowych, pestycydów, fenoli.

Polarne fazy zawierają dużą liczbę polarnych grup należy tu m.in. grupa glikoli polietylenowych; przy nazwach tych faz podawane są liczby które oznaczają masę cząsteczkową (im masa jest wyższa tym w wyższej temperaturze można je stosować).

Ciekłe fazy stacjonarne

Wybór fazy stacjonarnej zależy od rozdzielanej substancji tak aby faza stacjonarna pod względem chemicznym była podobna do substancji rozdzielanej w myśl zasady ze podobne rozpuszcza się w podobnym.

Temperatura rozdziału:

- temperatura rozdziału ma duży wpływ na rozdział związków i powinna być zbliżona do ich temperatur wrzenia

- analizę można prowadzić w stałej temp. (chromatografia izotermiczna) (do rozdziału związków, których temp wrzenia nie różnią się więcej niż o kilkadziesiąt stopni)

- lub w programowanej temp. (chromatografia gradientowa)

Detektory stosowane w chromatografii gazowej mają za zadanie przetworzenie fizycznych bądź fizykochemicznych właściwości wykrywanej substancji na sygnał elektryczny. Z wielu detektorów używanych w chromatografii najczęściej używany jest detektor płomieniowo-jonizacyjny w skrócie zwany FID (flame ionization detector).

FID:

- zasada pomiaru polega na zmianie przewodnictwa elektrycznego płomienia wodoru w polu elektrycznym po wprowadzeniu substancji.

- gaz nośny opuszczając kolumnę jest mieszany z wodorem, a dodatkowo w przestrzeni detektora do płomienia wodorowego doprowadzone jest powietrze; płomień umieszczony jest między dwiema elektrodami.

Inne detektory używane w analizie żywności:

- cieplno-przewodnościowy (katarometr)

- wychwyt elektronów (electron capture)

- do oznaczania określonych grup związków chemicznych – detektory o wysokiej selektywności.

Czas retencji – czas schodzenia danego związku z kolumny. Przy stałej temperaturze (przy stałych warunkach) dla danego związku jest zawsze taki sam. Daje informację o tym JAKI to związek.

Pole powierzchni pod krzywą świadczy o ILOŚCI danego związku.

Piki muszą być symetryczne – nie mogą „ogonować”.

W13

HPLC – WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA – HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Chromatografia cieczowa pozwala na rozdzielenie składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między dwie nie mieszające się fazy:

-Ruchomą -Stacjonarną

- Składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy ruchomej poruszają się szybciej niż składniki o większym powinowactwie do fazy stacjonarnej

- Chromatografia cieczowa stosowana jest do grupy związków nielotnych czy rozkładających się w wysokich temperaturach

Aparatura:

• Zbiorniki eluentów

• Pompa

• Manometr

• Dozownik

• Przedkolumna

• Kolumna w termostacie

• Przepływomierz

• Detektor

• Kolektor frakcji

• Rejestrator, komputer

Kolumny

Rozdział chromatograficzny zachodzi w wypełnionej fazą stacjonarną kolumnie

Chromatografia analityczna – rozdział jakościowy i ilościowy; kolumny o średnicach wewnętrznych 4- i długości 10-

Chromatografia preparatywna – oddzielenie substancji od zanieczyszczeń; kolumny preparatywne rzędu kilku metrów i średnicy wewnętrznej > 1cm

W analityce używa się dwa typy kolumn

• O fazach normalnych (NP., Normal Phase) – polarna faza stacjonarna (np. żel krzemionkowy lub tlenek glinu), niepolarna faza ruchoma

• O fazach odwróconych (RP – Reverse Phase) – niepolarna faza stacjonarna (np. węglowa C-8, C-18, C-30), polarna faza ruchoma

• Kolumny RP są częściej stosowane w analityce

Fazę ruchomą (eluent) stanowią

• Pojedyncze rozpuszczalniki

• Lub ich mieszaniny tworzące mieszaninę jednorodną (nie może tworzyć się emulsja)

Pompowane do komory mieszania pod wysokim ciśnieniem przed podaniem na kolumnę

• Należy używać eluentów o bardzo wysokim stopniu czystości (odczynniki specjalne do HPLC)

• Nawet mała ilość innej substancji w fazie ruchomej może mieć znaczny wpływ na wynik rozdziału (zmiana czasu retencji, ogonowanie pików)

• Moc elucji rozpuszczalników, w przypadku niepolarnej fazy stacjonarnej (stosowanej przy RP), wzrasta w kolejności woda metanol acetonitryl aceton tetrahydrofuran; (im mniejsza jest zawartość acetonitrylu w wodzie, tym bardziej rozdzielony jest chromatogram – schemat)

Podczas rozdziału można stosować

• Stały skład eluentu (chromatografia izokratyczna)

• Zmienny wzajemny stosunek rozpuszczalników w mieszaninie (chromatografia gradientowa)

Elucja gradientowa polepsza rozdzielenie składników mieszaniny analizowanej próbki, a czasem jest wręcz konieczna do ich rozdziału

Detektory

Do wykrywania związków lub ich grup w HPLC stosuje się różne rodzaje detektorów, w których wykorzystuje się właściwości fizyczne rozdzielanych związków, np.

• Absorpcję

• Załamanie światła

• Fluorescencję i inne

Najbardziej rozpowszechnione są detektory UV

• Stosowane m.in. do oznaczania białek, polifenoli, konserwantów, zanieczyszczeń

• Działające na zasadzie absorpcji światła w zakresie ultrafioletu

• Wrażliwe na zmiany szybkości przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury

• Względna czułość (czyli najmniejsze stężenie substancji rozpuszczonej, które można wykryć) jest równa około 1 nanograma (10^-9 g/kg)

• Zdolność załamywania światła przez związki zawierające asymetryczne atomy węgla (np. sacharydy) wykorzystano w detektorze refraktometrycznym

  • Detekcja odbywa się na podstawie pomiaru różnicy załamania światła czystego eluentu i eluentu zawierającego badany związek przepływających przez dwie równoległe cele detektora

  • Przy pracy z detektorem refraktometrycznym musi być utrzymana stała temperatura pomiaru, gdyż współczynnik załamania światła zmienia się wraz ze zmianą temperatury

  • Detektor ten nie może być stosowany do pomiarów z użyciem elucji gradientowej, gdyż współczynnik załamania światła zmienia się wraz ze zmianą składu fazy ruchomej

  • Czułość tego detektora nie przekracza najczęściej 10^-6 g/kg (1 mikrograma)

• Istota detekcji fluorescencyjnej polega na pomiarze intensywności światła, o określonej długości fali, emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego pobudzenia światłem o innej długości fali.

• Detektor fluorescencyjny przy wykrywaniu niektórych związków chemicznych może być około 1000 razy bardziej czuły niż detektor absorpcji w nadfiolecie i umożliwia wykrywanie związków na poziomie pikogramów (10^-12 g/kg)

• Detektor fluorescencyjny jest najbardziej specyficznym i selektywnym detektorem spośród wszystkich detektorów wykorzystywanych w chromatografii cieczowej

• W przypadku związków, które nie posiadają naturalnej zdolności do fluorescencji, można przeprowadzić związki nie fluoryzujące w ich fluoryzujące pochodne

Identyfikacja rozdzielonych związków

• Każdy z rozdzielanych związków ma swój stały czas retencji

Przy zastosowaniu takich samych warunków rozdziału (kolumna, jej wypełnienie, temperatura, rodzaj i szybkość przepływu fazy ruchomej)

• Na tej podstawie można przeprowadzić

  • Analizę jakościową

  • Analizę ilościową