Laboratorium 2

Podłoża mikrobiologiczne. Technika posiewów.

Upłynnianie żelatyny – hydrolizują ją bakterie
agar odżywczy – pożywka
agar-agar – to nie pożywka! To czynnik zestalający
(ptasie mleczko zawiera(ło?) agar-agar)
Sterylna pipeta = pipeta automatyczna
Niesterylna pipeta = pipeta zwykła

Sprawdzanie/ mieszanie zawartości probówek: trzyma się prawą ręką za probówkę, trzymając korek palcem i lekko uderza i otwartą lewą dłoń.

2 formy stałych pożywek:
1) PŁYTKA AGROWA – płytka Petriego z agarem odżywczym; jeśli jest szklana to można dosterylizować – złapać palnik od dołu i przejechać ogniem po powierzchni agaru (uchylonej płytki) – to też metoda pozbywania się pęcherzyków powietrza na świeżo wylanym agarze; płytkę z agarem zawsze trzyma się do góry nogami (do góry dnem z agarem) by zbierająca się na pokrywce woda (na płytkę wylewa się gorący agar, który zastygając paruje i ta para się skrapla na pokrywce) nie spływała i nie niszczyła hodowli;
2) SKOS – w probówce;

Ćwiczenia:
1. płytka agarowa – w jedną rękę w rękawiczce wziąć kolbę z gorącym agarem, drugą uchylić szalkę i nalać, aż wypełni wszystko + jeszcze 3 sekundy wlewać;
2. skos – do probówki nalać ok. 5 ml agaru i położyć ją pod ukosem na stojaku do probówek – służy do przechowywania bakterii przez kilka tygodni;
Posiew
Escherichia Coli (pałeczka okrężnicy) – wskaźnik zanieczyszczeń kałowych;
podłoża, z których siejemy -> na co siejemy (czym)
1. płynne -> stałe (eza)
2. płynne -> płynne (pipeta)
3. stałe -> płynne (eza)
4. stałe -> stałe (eza)
Kalibrowana eza- wiemy, ile mieści (po zanurzeniu w płynie na pętelce robi się błonka- jeśli eza jest kalibrowana to wiemy, jaka jest objętość płynu powstałego z tej błonki)

Ćwiczenia cd:
3. posiew 1 – ezę trzyma się jak długopis, wkłada do ognia aż się rozżarzy do czerwoności pętelka i kawałek drucika, wkłada się do płynnego podłoża, czeka aż bakterie napłyną (wkładając gorącą ezę zabiliśmy te, które były najbliżej), wyjmuje się i robi posiew na szalce (dokładnie, jednym pociągnięciem i delikatnie tylko dotykając agaru):

potem ponownie opala się ezę do czerwoności, by zniszczyć materiał biologiczny i odkładamy ezę do statywu (UWAGA! EZY NIE WOLNO ANI NA CHWILĘ ODKŁADAĆ PODCZAS WYKONYWANIA ĆWICZENIA!)
szalkę podpisuje się : inicjałami, datą wykonania ćwiczenia i nazwą używanej bakterii;
4. posiew 2 – do sterylnej probówki sterylną pipetą wlewa się 5 ml bulionu odżywczego
[mała pipeta- 20, 50, 100 μl – żółte]
i z hodowli płynnej przenosi się odpowiednią objętość do sterylnej probówki ze sterylnym bulionem;
5. posiew 3 – sterylizujemy ezę w ogniu do czerwoności, studzimy wbijając ją 1-2 razy w agar (z boku szalki, gdzie nie ma bakterii), potem delikatnie pobiera materiał biologiczny (dotykając ezą), wkłada do probówki z bulionem (stukając ezą o ścianki i dokładnie ją płukając bulionem), wyżarzyć ezę, odstawić;
6. posiew 4 – żarzymy ezę w ogniu, chłodzimy w agarze, delikatnie pobieramy bakterie z podłoża stałego, a następnie wkładamy do probówki i jak wcześniej delikatnie, jednym pociągnięciem:

TEORIA:

Pożywka (podłoże bakteryjne) – płynne, półpłynne lub stałe mieszaniny różnych związków chemicznych, w których lub na których namnażają się mikroorganizmy;

Cechy pożywek:
1. Zawierają łatwo dostępne źródła węgla i energii (organizmy heterotroficzne korzystają z różnych organicznych związków węgla; autotrofy wykorzystują CO₂);
2. Zawierają łatwo dostępne źródło azotu (heterotrofy: organiczne związki (aminokwasy, pepton) lub nieorganiczne (sole amonowe, azotany); nieliczne bakterie mają zdolność wiązania azotu atmosferycznego);
3. Zawierają zestaw mikroelementów: fosfor, siarka, magnez…
4. Wykazują odpowiedni dla danej grupy mikroorganizmów odczyn środowiska (pH);
5. Zapewniają izotoniczność środowiska (identyczne ciśnienie osmotyczne)

Klasyfikacja pożywek:
1. Zawartość:
- syntetyczne – o znanym składzie ilościowym i jakościowym;
- półsyntetyczne – znamy skład tylko związków nieorganicznych;
- naturalne – skład ilościowy i jakościowy znamy w przybliżeniu (mleko, jaja, krew…)
2. Konsystencja:
-płynne
-półpłynne
-stałe
Pożywka płynna + 0,3-0,5% agar-agaru = pożywka półpłynna
Pożywka płynna + 1,5-2,0% agar-agaru = pożywka stała
agar-agar – wielocukier zawierający galaktozę; otrzymywany z krasnorostów; rozpuszcza się w wodzie w 95-, krzepnie po ostudzeniu do 45-; na ogół oporny na działanie drobnoustrojów, dlatego używany do zestalania pożywek bakteriologicznych;
3. Ilość i jakość składników odżywczych:
- proste (podstawowe), np. bulion zwykły, agar zwykły;
- wzbogacone – pożywka prosta + czynnik wzbogacający (krew, surowica, witaminy, węglowodany);
- wybiórczo-namnażające – o takim składzie, na których rosną tylko wybrane przez nas drobnoustroje (łatwo je izolować i identyfikować);
- wybiórczo-różnicujące – do różnicowania poszczególnych gatunków bakterii na drodze biochemicznej (np. fermentujące laktozę, glukozę);
- specjalne – do hodowli bakterii o specjalnie wysokich wymaganiach odżywczych, zawierają np. surowice, witaminy;

Podstawowe podłoże stosowane powszechnie: bulion odżywczy- wyciąg z mięsa wołowego (woda mięsna) wzbogacony dodatkiem 1% peptonu (źródło azotu) i 0,5% NaCl (środowisko izotoniczne), pH 7,4.

Agar odżywczy = bulion mięsny + 1,5-2,0% agar-agaru

Cel: otrzymanie (namnożenie) jednego, określonego gatunku mikroorganizmu (czystej kultury).

Laboratorium 3

Posiew redukcyjny

Posiew redukcyjne służy do:
1) sprawdzenia czystości hodowli
2) izolacji czystych kultur

Ćwiczenie:
Potrzebna jest płynna hodowla. Wyżarzamy ezę w ogniu, pobieramy materiał z probówki, uchylamy(!) płytkę i siejemy bardzo gęsto:

zaczynamy siać jak na 1. do różowego punktu. Zamykamy płytkę. Wyżarzamy ezę w ogniu. Studzimy ją w agarze. Dotykamy ezą w różowy punkt i zaczynamy rysować jak w 2. pierwsze 1-2 ruchy zahaczając o linie 1 w pobliżu punktu, potem już nie wolno tego robić; rysujemy do drugiego różowego punktu (między 3). Odrywamy ezę, zamykamy płytkę. Żarzymy ezę w ogniu. Otwieramy płytkę. Studzimy w agarze. Zaczynamy rysować ostatni fragment, również dotykając najpierw 2-3 linii w pobliżu różowego punktu, potem już nie. Kończymy posiew, gdy dojdziemy do pierwszych linii. Dla ułatwienia, można obracać płytkę o 90 stopni między kolejnymi posiewami.

Kolonia – zbiór bakterii, które wyrosły z jednej komórki;

Jeśli w miejscu rysowania 3. powstają tylko pojedyncze, identyczne kolonie (kropki) – to znaczy, że posiew został wykonany poprawnie i E. Coli jest czysta.

Ćwiczenie cd.
Posiew redukcyjny z podłoża płynnego za pomocą głaszczki szklanej
Głaszczkę wkłada się do spirytusu i zapala w ogniu w celu sterylizacji (na 1-2 sekundy, nie wolno trzymać długo, bo pęknie). Wypala się w powietrzu. Posiew głaszczką wykonuje się jedynie z podłoża płynnego na stałe.
Pobiera się 100 μl bakterii z płynnego podłoża i rozlewa kroplami szybko w kilku miejscach na płytkę i zamyka ją. Sterylizuje się głaszczkę ponownie spirytusem. Następnie chłodzi się ją, dotykając wieczka szalki (szczególnie tym fragmentem, którym będziemy głaskać agar). Po ostudzeniu zaczynamy głaskać agar niezbyt mocno, starając się równomiernie rozprowadzić bakterie. Głaszcze się do czasu aż głaszczka przestanie się zupełnie gładko przesuwać. Sterylizujemy głaszczkę.
POSIEW GŁASZCZKĄ- ZAWSZE 100 μl BAKTERII Z PODŁOŻA PŁYNNEGO!