Co się kryję w pieczarce dwuzarodnikowej, czyli badanie kinetyki enzymatyczne tyrozynazy.
Tomasz Berniak, Zbigniew Chałupka, Piotr Chmielowski
Streszczenie Celem przeprowadzonego doświadczenia było zbadanie kinetyki reakcje enzymatycznej powstawania dopachromu z L-DOPA w obecności tyrozynazy. Enzym występujący w wielu rodzajach organizmów żywych został wyizolowany z banana, pieczarki oraz ziemniaka. Otrzymane ekstrakty poddano analizie. Przy wykorzystaniu prędkości początkowej wyselekcjonowano jeden do dalszych pomiarów. Przy wykorzystaniu równania Michealisa-Menten wyznaczono KM i Vmax oraz zbadano wpływ inhibitora na szybkość reakcji enzymatycznej.
Wstęp:
Tyrozynaza jest metaloenzymem zawierającym w swojej strukturze atom miedzi. Enzym ten zawarty jest w organizmach żywych warunkujący proces produkcji melaniny (czynnika odpowiedzialnego za pigmentację tkanek). Aktywacja tyrozynazy zachodzi za pomocą promieniowania UV. Jest ona czynnikiem warunkującym reakcję syntezy L- DOPA z tyrozyny, która jest następnie przekształcany do dopachinonu. Inhibitorem wymienionego procesu jest kwas cytrynowy.
Przygotowanie eksperymentu:
Odczynniki: 15 mM roztwór L-DOPA ( 30μg (0,0295g) w 10 ml buforu cytrynowego o pH=6,6); ekstrakty enzymu tyrozynazy z : banana, pieczarki i ziemniaka (dwa ekstrakty), inhibitor – roztwór witaminy C
Analiza ekstraktów zawierających tyrozynazę:
Sporządzono cztery próbki wyizolowanego enzymu z banana, pieczarki i ziemniaków (dwa ekstrakty). Do 0,95 ml 6 mM L-DOPA dodano 0,05 ml ekstraktów zawierających tyrozynazę, energicznie wymieszano i dla tak przygotowanych próbek wykonano pomiar absorbancji przy długości fali 475nm.
Zanalizowano otrzymane widma i wybrano ekstrakt, którego wykres w początkowych wartościach wykazywał się najbardziej liniową zależnością. Zdecydowano, że dalsze badania kinetyki działania tyrozynazy przeprowadzi się na ekstrakcie z pieczarki. Przygotowano 5 próbek o stężeniach: 1,3,6,10 i 15 mM i postępowano analogicznie jak w poprzednim punkcie.
Wpływ działania inhibitora na szybkość reakcji enzymatycznej:
Przygotowano serię pomiarową (5 próbek) zawierającą następujące stężenia witaminy C: 12 mM, 1,2mM, 0,12 mM, 0,012mM, 0,0012 mM. Wykonano pomiar przy pomocy spektroskopu UV-VIS, badając wpływ stężenia inhibitora na przebieg reakcji
Wyniki
W celu wyboru enzymu sporządzono wykres zależności zmiany absorbancje w czasie przebiegu reakcji.
Następnie przeliczono absorbancje na stężenie dopachromu w każdej z próbek. Wykorzystano prawo Lamberta-Beera, oraz przyjęto wartość współczynnika molowego za równą 3800 M-1 cm-1, a następnie wyznaczono wartości prędkości początkowych w każdej z próbek.
Poch. tyr. |
Banan | Pieczarka | ZiemiakI | ZiemniakII |
|---|---|---|---|---|
Vo M/min |
5,45∙10-7 | 9,02∙10-5 | 5,86∙10-5 | 6,45∙10-5 |
Tab.1 Zestawienie prędkości początkowych z poszczególnych ekstraktów.
Analiza kinetyki reakcji enzymatycznej
Wyznaczono wartości parametrów KM i Vmax korzystając z modelu Michaelisa- Menten, natomiast stężenie obliczono z prawa Lamberta–Beera.
Rys 2. Wykres zależności 1/V od 1/[S]:
W oparciu o powyższy wykres wyznaczono: 1/Vmax równe 4812,z tego wynika że Vmax wynosi 2,08∙10-4 [min∙dm3/mol]. Km/Vmax wynosi 6,05, natomiast Km wynosi 0,0013 [mol/dm3].
Wpływ działania inhibitora na szybkość reakcji enzymatycznej:
Na rysunku 3 przedstawiono wpływ stężenia inhibitora na przebieg reakcji.
Rys3. Wykres zależności pomiędzy stężeniem inhibitora a absorbancją.
Wnioski
Jak można zauważyć na powyższych wykresach pieczarka jak i inne produkty żywnościowe nie służą tylko do konsumpcji, na podstawie ich analizy można wysnuć kilka ciekawych wniosków. Wybrana na podstawie odpowiedniej selekcji tyrozynaza wyizolowana z pieczarki charakteryzowała się liniową zależności wzrostu absorbancji od czasu. Wyznaczone wartości stałej Michaelisa oraz prędkości maksymalnej mieszczą się w zakresie tolerancji. Okazało się także, iż kwas cytrynowy może wykazywać inne właściwość, niż odbarwianie mocnej herbaty. Odpowiednie jego stężenie, powyżej 1,2 mM, powoduję całkowite zahamowanie reakcji konwersji prowadzącej do otrzymania dopachromu z L-DOPA.