I.

Liście sałaty rozdrobniono i z homogenizowano w buforze A. Homogenizowano 3x15s, następnie otrzymana próbkę przefiltrowano przez 4 warswy gazy i umieszczono w probówkach do wirówki K-23. Przygotowane próbki zrównoważono parami, odwirowano przez 90 sekund przy 1800 rpm. Zebrano supernatant, ponownie odwirowano przez 7 min przy 2500 rpm. Osad z tego wirowania zawieszono w 25 ml buforu B, odwirowano przy takich samych parametrach jak poprzednio. Powstały osad zawieszono w 10 ml buforu C i pozostawiono na mieszadle magnetycznym w lodzie przez 5 min. Po tym czasie dodano 10 ml buforu D i odwirowano przez 10 min przy 4000 rpm. Osad z tego wirowania zawieszono w 5 ml buforu B i wstawiono do lodu.

II.

Do dwóch probówek Eppendorfa odmierzono 75µl otrzymanej zawiesiny chloroplastów, 225µl wody i 1200µl acetonu. Odwirowano przez 5 min przy 10000 rpm. Zmierzono absorbancję względem próbki ślepej – powietrza oraz 80% actonu. Pomiarów dokonano przy λ= 645, 663 i 710 nm. Po pomiarze dokonano obliczenia zawartości chlorofilu.

III.

Kolejno dokonano oznaczenia aktywności PSII wraz z układem rozszczepiającym wodę.

Próbkę do tego pomiaru przygotowano następująco: pobrano 75µl roztworu chlorofilu uprzednio przygotowanego i 1425µl buforu E, otrzymując stężenie dwukrotnie większe niż obliczone. Początkowo rozpoczęto pomiary dodając 50 ul DCIP  w celu uzyskania A≅0,5 przy λ=590nm. Do tak przygotowanej próbki dodano 50 ul DCIP oraz przez 15 sekund oświetlano próbkę i dokonywano pomiaru absorbancji. Próbkę naświetlano łącznie przez 2 min.

Ad. II

Przygotowanie próbki do wirowania:

$${50ul - 1000ul\backslash n}{x\text{\ \ }ul\ - 1500ul\backslash n}{x = \frac{1500*50}{1000} = 75ul = > \text{otrzymana}\ \text{zawiesina}\ ch\text{loroplast}ow}$$

$${150ul - 1000\ ul\backslash n}{x\text{\ \ \ }ul\ - 1500\ ul\backslash n}{x = \frac{1500*150}{1000} = 225ul = > \text{wody}}$$

1500ul − (225ul+75ul) = 1200ul = >acetonu

Tab.1. Absorbancja próbek chlorofilu i acetonu.

L.p.	Długość fali [nm]	Próba ślepa (powietrze)	Próbka A	Próbka B	Średnia arytmetyczna (A+B)/2	Aceton 80%
1	645	0	0,854	0,837	0,8455	0,025
2	663	0	1,500	1,488	1,494	0,023
3	710	0	0,061	0,041	0,051	0,023

A_{sr.aryt.(A + B)/2} −  A_acetn 80% = A_danej λ

1. 645 nm 0, 8455 − 0, 025 = 0, 8205

2. 663 nm 1, 500 − 0, 023 = 1, 471

3. 710 nm 0, 051 − 0, 023 = 0, 028

OBLICZENIE STĘŻENIA CHLOROFILU:

c_{chl.a + b} = 20, 2(abs₆₄₅−abs₇₁₀) + 8, 02(abs₆₆₃−abs₇₁₀)

c_{chl.a + b} = 20, 2 * (0,8205−0,028) + 8, 02 * (1,471−0,028)

c_{chl.a + b} = 20, 2 * 0, 7695 + 8, 02 * 1, 443

c_{chl.a + b} = 15, 5439 + 11, 5728

c_{chl.a + b} = 27, 1167 ≅ 27, 12

Ad. III

Tab.2. Absorbancja w czasie oświetlania i po dodaniu 50 µl DCIP.

L.p.	Czas [s]	Absorbancja	DCIP	Oświetlanie
1	0	0,593	Nie	nie
2	15	0,693	tak, dodatek jednorazowy	nie
3	30	0,644	Obecne	tak
4	45	0,615	obecne	tak
5	60	0,604	obecne	tak
6	75	0,604	obecne	tak
7	90	0,602	obecne	tak
8	105	0,598	obecne	tak
9	120	0,597	obecne	tak

Wykres 1. Zależność wartości absorbancji od czasu oświetlania próbki.