Elektroforeza

Elektroforeza to metoda separacji makrocząsteczek. Pod wpływem przyłożonego napięcia cząsteczki te, obdarzone ładunkiem elektrycznym, wędrują w polu elektrycznym. Prędkość przemieszczania zależy od ładunku makrocząsteczki, jej rozmiaru, kształtu, a także oporów ruchu środowiska. Technika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielenia DNA i jego analizy w żelu, a także do rozdzielania RNA czy białek.

Wyróżnia się dwa rodzaje żeli:

żele agarozowe – przygotowywane są z agarozy (wielocukier); stosowane do rozdzielania fragmentów DNA powyżej 500 pz;

żele poliakrylamidowe – charakteryzują się większą rozdzielczością; używane do rozdzielania mniejszych fragmenty DNA (poniżej 500 pz).

Aparaty do elektroforezy:

aparat i żel poziomy – żel umieszcza się poziomo; nalewamy do zbiornika odpowiedni bufor i przykładamy napięcie – to wywołuje migrację DNA (ma ładunek ujemny) od elektrody ujemnej (katody) do elektrody dodatniej (anody);

aparat pionowy – stosuje się go głównie do rozdziału w żelach poliakrylamidowych; żel umieszcza się pionowo; od góry i od dołu żelu są zbiorniki z buforem; kierunek migracji jest od elektrody ujemnej do elektrody dodatniej.

Rozdział elektroforetyczny zależy od kilku czynników:

konformacji DNA;

wielkości DNA – im większe, tym wolniej migruje w żelu;

stężenia agarozy;

przyłożonego napięcia;

rodzaju buforu.

Konformacja DNA

DNA plazmidowe może występować w trzech podstawowych formach przestrzennych: formie CCC (ang. covalently closed circular; kowalentnie zamknięty kolisty DNA; forma superskręcona); formie OC (ang. open circular; forma otwartokolista; występuje, gdy jedna z nici DNA ulegnie pęknięciu); formie L (ang. linear; liniowa; kiedy pęknięcie pojedyncze występuje na obydwu niciach DNA).

Poszczególne formy charakteryzują się tą samą masą i wielkością. Różnią się natomiast gęstością superhelikalną. Wszystkie trzy struktury migrują w żelach agarozowych z różną prędkością, w zależności od siły jonowej buforu i stężenia żelu.

Stężenie agarozy

Im większe stężenie żelu, tym szybkość migracji jest mniejsza. Ze wzrostem stężenia żelu wzrasta jego rozdzielczość (zdolność do rozróżniania fragmentów o zbliżonych wielkościach). Zazwyczaj stosuje się żele agarozowe o stężeniu do 1,2%. Jeśli badany DNA ma wielkość do 20 tysięcy par zadad to stosuje się wówczas żele o stężeniu od 0,8 do 1,2%. Jeśli DNA czy plazmidy są większe (od 20 do 100 tys. pz), to stosuje się żele o stężeniu mniejszym: 0,5 – 0,8%. Do jeszcze większych fragmentów DNA stosuje się żele o stężeniu 0,5 – 0,3% (taki rozdział przeprowadza się w chłodni, w temperaturze 4–10oC, ponieważ podczas takiej separacji powstaje podwyższona temperatura).

Przyłożone napięcie

Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie, a więc gdy umieści się ją w polu elektrycznym, będzie przemieszczać się w kierunku anody (elektrody dodatniej). Napięcie jest źródłem rozdziału. Jest to liczba woltów przypadająca na 1 cm długości żelu. Przez żel przepływa prąd. Najkorzystniejszy dla elektroforezy jest prąd o możliwie niskim natężeniu. Im większe stosuje się napięcie, tym rozdział jest szybszy. Dla dużych fragmentów DNA i plazmidów stosuje się niskie napięcie; dla małych – można stosować napięcia wyższe.

Rodzaj buforu

Stosuje się różne rodzaje buforów, takie jak:

bufor octanowy TAE – jest najczęściej stosowany; ma raczej niską pojemność buforową;

bufor fosforanowy TPE – najbardziej stężony;

bufor boranowy TBE.

Różnią się one stężeniem i pojemnością buforową. Najlepsze warunki rozdziału uzyskuje się przy zastosowaniu buforów rozcieńczonych, ponieważ przy dużym napięciu prądu uzyskuje się niskie jego natężenie. Nie można jednak takiej elektroforezy prowadzić długo – nie dłużej niż 2 godziny. W przypadku rozdziałów długotrwałych stosuje się bufory bardziej stężone.

Przed nałożeniem próby DNA w żel podbarwiamy próbę barwnikiem śledzących, np. błękit bromofenolowy, który wędruje w tym samym kierunku co DNA, z prędkością taką jak około 1.000 par zasad. Do barwnika śledzącego dodaje się tak zwany roztwór obciążający. Najczęściej jest to stężony roztwór mocznika lub sacharozy albo fikol 400. Czynnik obciążający powoduje, że próbka opada na dno studzienki (kanału), wypychając z niej bufor na zewnątrz.

Wyniki rozdziału elektroforetycznego obserwuje się po wybarwieniu DNA bromkiem etydyny i wizualizacji w świetle UV przy długości fali α = 260 nm (maksimum absorpcji dla DNA). Żel można sfotografować przy zastosowaniu odpowiedniego filtra.

Rys. Schemat przebiegu procesu elektroforezy (źródło: wikipedia.pl, domena publiczna).

Żel agarozowy z uformowanymi w nim trzema studzienkami (S) na próbki.

Wstrzyknięcie markera DNA (wzorzec masowy) do pierwszej studzienki.

Wprowadzenie badanych próbek do drugiej i trzeciej studzienki.

Przyłożenie napięcia. DNA porusza się w kierunku anody ze względu na posiadany ładunek ujemny.

Małe fragmenty DNA poruszają się szybko przez żel, duże fragmenty DNA – powoli. Normalnie DNA nie jest widoczny w trakcie tego procesu, dlatego do próbki DNA dodawany jest barwnik.

Efekt elektroforezy.