PSEUDOMONAS spp.

Gramujemne, urzęsione pałeczki Nie tworzą przetrwalników, rosną tlenowo Katalazo-dodatnie, oksydazo-dodatnie. Niefermentujące: nie rozkładają glukozy beztlenowo . Ze względu na małe wymagania życiowe bakterie Pseudomonas są szeroko rozpowszechnione(gleba, woda, ścieki, powietrze)T wzrostu 4 - 43°C, pH 7-8.5 Cechą charakterystyczną jest tworzenie rozpuszczalnych w wodzie barwników (błękitnozielonapiocyjanina, żółtozielona fluoryzująca pioverdina, fluoresceina, czerwona piorubina, brązowa melanina)Pseudomonas aeruginosana agarze:O/F test (Hugh and Leifson test)Pseudomonas są zdolne do rozkładu (utleniania) cukrów do kwasów; ten test służy do wykrywania słabych kwasów powstałych w wyniku utleniania glukozy

Największe znaczenie w mikrobiologii weterynaryjnej mają:

P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri P. mendoncina P. alcaligenes

Pseudomonas aeruginosa

Powszechna w wodzie, ściekach, glebie, przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt

Wytwarza niebieski barwnik-piocyjaninę Znaczna oporność na działanie środków dezynfekcyjnych i zwiększone stężenie CO₂ Oportunistyczny patogen człowieka, który może wywoływać zakażenia przyranne, po poparzeniach, zakażenia dróg moczowych, oddechowych, przewodu słuchowego, zatok, spojówek, jelita, ropnie podskórne i narządowe (niebieska ropa)Patogen szpitalny, wykazujący dużą oporność na antybiotyki

Pseudomonas fluorescens

Występowanie: woda, ścieki, gleba Psucie żywności, zwł. pochodz. zwierzęcegoNieszkodliwe dla zdrowych osób. Mogą wywoływać: zakażenia dróg oddechowych i moczowych, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, kości, szpiku, stawów, oka lub ucha, powstawanie ropni, zapalenie wsierdzia, zatrucia pokarmowe

Inne gatunki : P. fragi, P. putida, P. lundensis – mikroorganizmy psujące żywność.

Pseudomonasspp. są istotne ze względu na psucie się żywności, zwłaszcza schłodzonej. Liczebność powyżej 10⁷ CFU/g może powodować pogorszenie smaku, zapachu i wyglądu żywności.

Gnicie mięsa

Zmiany rozpadowe powodowane w białkach produktów żywnościowych przez enzymy drobnoustrojów (proteazy, amidazy)Produkcja małocząsteczkowych związków o nieprzyjemnym zapachu w wyniku rozkładu aminokwasów (merkaptany, siarkowodór, amoniak, aminy)

Produkcja śluzu (zwykle wskazuje na wzrost Pseudomonas, Streptococcus, Bacillus, Micrococcus, Lactobacillus)

CZYNNIKI WIRULENCJI

Otoczka alginianowa-czynnik antyfagocytarny i adhezyjny.Pilina (adhezyny)- kolonizacja nabłonka.Czynniki ułatwiające inwazję tkanek: proteazy, hemolizyny, cytotoksyna (leukocydyna), fosfolipaza C. Toksyny: egzoenzym S, egzotoksyna A, enterotoksyna. Ochrona przed fagocytozą: otoczka, śluz, biofilm.

Główne drobnoustroje odpowiedzialne za psucie żywności o wysokiej aktywności wody (A_w)Mimo, iż Pseudomonasspp. mogą początkowo stanowić niewielką część mikroflory żywności, w warunkach sprzyjających ich rozwojowi (a hamujących namnażanie się innych drobnoustrojów) mogą zdominować środowisko. Warunki te to: wysoka A_w, wysokie stężenie O₂, niska temp.

Niskie temp. wykorzystywane są do przechowywania mięsa po uboju i w czasie transportu, oraz sprzedaży (celem opóźnienia rozwoju drobnoustrojów psujących żywność).

Pseudomonasspp. to bakterie psychrotrofowe (zdolne do namnażania się w niskich temp.). Są najczęstszą przyczyną psucia się mięsa przechowywanego w niskich temp.!Początkowo namnażają się na powierzchni, ale stopniowo enzymy proteolityczne powodują rozkład tkanki łącznej w mięsie, co umożliwia bakteriom wnikanie w głąb mięśni.

Wybrane gatunki Pseudomonas – proteoliza żelatyny i kazeiny

Mięso i przetwory mięsne -- Oznaczanie liczby bakterii z rodzaju Pseudomonas

Agar z cetrimidem, fucydyną i cefalorydyną (CFC) – posiew powierzchniowy

Pożywka wybiórcza służąca do izolacji Pseudomonas zarówno produkujących pigmenty jak i nie produkujących (kolonie bezbarwne, zabarwione lub fluoryzujące). Hamuje namnażanie się gram-dodatnich i większości gram-ujemnych bakterii.

Pożywka agarowa Kliglera (posiew powierzchniowy + kłuty) Podłoże do hodowli pałeczek gramujemnych, pozwalające na określenie zdolności do rozkładu glukozy, laktozy i wytwarzania siarkowodoru. Pożywka ta zawiera glukozę i laktozę, tiosiarczan i jony żelaza oraz wskaźnik pH. Rozkład glukozy i laktozy objawia się zakwaszeniem i zażółceniem podłoża (rozkład glukozy - barwa w części skośnej różowa; rozkład laktozy - barwa żółta w całym podłożu). Wytwarzanie H2S - czarny siarczek żelaza.

Próba na oksydazęNa bibułę nasączoną odczynnikiem nanosi się kolonie z pożywki. Zabarwienie powinno pojawić się po ok. 2 min.Odczynnik w wyniku utleniania przez oksydazę przekształcany jest w kolorowy produkt .Kolonie, które wykazują pozytywną reakcję na oksydazę i rozwijają się wyłącznie na powierzchni pożywki Kliglera (warunki tlenowe) powinny zostać uznane za Pseudomonas

Rodzaj Listeria Należy do rodziny Corynebacteriaceae

Rodzaj obejmuje 6 gatunków patogenne: L. monocytogenes, L. ivanovii i niepatogenne: L. inocua, L. grayi, L. seeligeri, L. welshimeri Gram dodatnie pałeczki (0.4-05 μm 1-2 μm)Katalazo-dodatni Zdolność ruchu w temperaturze 20-25ºC Warunki wzrostu: Warunki tlenowe i beztlenowe

Szeroki zakres temperatur: -0.1 do 45ºC (potrafią przeżyć ponad 60min w 60ºC Szeroki zakres pH: 4-9.5 Wysokie stężenie soli (30%)Do optymalnego wzrostu wymagają biotyny, tiaminy, ryboflawiny, aa cukrów WYSTĘPOWANIE: Szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym (woda, ścieki, gleba, roślinność, ssaki, owady, ptaki) Ponadto: mrożone artykuły spożywcze, mleko, surowe warzywa (kalafior, marchew, sałata, kapusta, brokuły)Źródło- brak higieny podczas produkcji i przygotowania żywności; kiszonki

Listeria monocytogenes

Jeden z najważniejszych patogenów izolowanych z żywności

Wyróżnia się 13 serotypów : 1/2a, 1/2b, 1/2c – najczęściej izolowane z żywności; 1/2b i 4b - ponad 90% przypadków klinicznych. Źródło transmisji: * żywność (ponad 90% infekcji)- RTE food, produkty mleczne, coleslaw, owoce morza, wędzone ryby. * skóra – wysypka na rękach i ramionach gł. farmerzy i weterynarze (wydzieliny płciowe, martwy płód)- Listerioza. Współczynnik śmiertelności 20-30% Najbardziej narażone - osoby starsze oraz osoby o obniżonej odporności(65%), kobiety w ciąży i noworodki (23%)Okres inkubacji 20h (gastroenteritis), 20-30dni (postać inwazyjna). Wnikanie do komórek niefagocytujących.Rozmnażanie się i przemieszczanie w cytozolu komórek.Przenikanie z komórki do komórki.Pokonywanie naturalnych barier organizmu.Zapalenie opon mózgowych i mózgu, bakteriemia.Obumieranie płodu i poronienia

CZYNNIKI WIRULENCJI Internaliny.Listeriolizyna. Fosfolipazy Metaloproteinaza. BiałkoActA
Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Listeria monocytogenes

Wstępne namnażanie selektywne- pożywka pół-Frasera;Agar Oxford(hydroliza eskuliny);Agar PALCAM(hydroliza eskuliny, fermentacja mannitolu)Próbka analityczna + Rozcieńczalnik do przygotowania zawiesiny wyjściowej (zbuforowana woda peptonowa lub pożywka pół-Frasera)->Regeneracja uszkodzonych komórek 1h / 20ºC->Posiew powierzchniowy na ALOA 37ºC / 24-48h->Identyfikacja i oznaczenie liczby->Posiew na TSYEA 37ºC / 24h

Testy potwierdzające przynależność doListeriaspp. Test na katalazę,Barwienie Grama,Test na zdolność ruchu

Testy potwierdzające przynależność do L. monocytogenes:Test na hemolizę,Test na zdolność rozkładu węglowodanów,Test CAMP

PACIORKOWCE

Gramdodatnie bakterie o sferycznym kształcie (0.5-1µm), zwykle rosnące w parach lub łańcuszkach, nieruchliwe, nie tworząceprzetrwalników. Względne beztlenowce, katalazoujemne.Duże wymagania pokarmowe - preferują bogate pożywki, dlatego rosną dobrze w żywności takiej jak mleko, ser, mieszane sałatki z mięsem, jajkiem, owocami morza. Klasyfikacja: podział na grupy wg Lancefield (na podstawie antygenów cukrowych w ścianie komórkowej)

Grupa A: S. pyogenes, nieliczne szczepy S. anginosusi S. constelatus

Grupa B : S. agalactiae

Grupa C: S. dysgalactiae, S. equi, S. equi subsp. zooepidemicus

Grupa D :to 5 gatunków : E. faecalis, E. faecium, S. durans, S. avium, S. bovis

Grupa F: S. milleri

Grupa G: S. canisi inne zwierzęce paciorkowce ropotwórcze

Klasyfikacja paciorkowców wg Shermanna(na podstawie cech fizjologicznych)

Paciorkowce ropotwórcze (S. pyogenes, S. equi, S.equisubsp. zooepidemicus, S. dysgalactiaesubsp. equisimilis, S. agalactiae) – izolowane z ropy, wrażliwe na penicylinę

Enterokoki, in. paciorkowce kałowe (E. faecalis, E. faecium,) – tolerujące sole żółciowe, oporne na penicylinę Paciorkowce mleczne(L. lactis, L. cremoris) Viridans (S. viridans) – α-hemolityczne (zielony odcień)Pneumokoki (S. pneumoniae)

Podział ze względu na rodzaj hemolizy

Hemolizyny – wytwarzane przez paciorkowce ropotwórcze (S. pyogenesi in.).

β-hemoilza – hemolizyny powodują rozpuszczenie krwinek całkowite przejaśnienie wokół kolonii (S. pyogenes, S. agalactiae, S. equisimilis)

α-hemoliza – krwinki nie ulegają pełnemu rozpadowi strefa nieprzejrzysta i wyraźnie zazieleniona (S. mitis, S oralis, S. pneumoniae)

Streptococcus pyogenes

Najczęstszy i najważniejszy czynnik etiologiczny infekcji wśród przedstawicieli Streptococcusspp.

Może stanowić część flory bakteryjnej (bez objawów chorobowych).Zakażenie- droga kropelkowa, kontakt, zakażone przedmioty.Wywołuje infekcje miejscowe– stany zapalne ropne i gardła oraz migdałków podniebiennych, ropne zapalenie węzłów chłonnych i ucha środkowego, ropne infekcje skóry (liszajec, róża, ropne zapalenie tk. łącznej podskórnej)Uogólnione zakażenia: zakażenie połogowe, posocznica, Szczepy wytwarzające toksynę erytrogenną- płonica, STSS

Następstwami zakażeń mogą być: gorączka reumatyczna, ostre kłębuszkowe zapalenie nerek

infekcje uogólnione: posocznica, zakażenie połogowe, ostre zapalenia wsierdzia, infekcje miejscowe: rumień guzowaty, liszajec, cellulitis, róża

schorzenia wynikające z oddziaływania SPE A:szkarlatyna, STSS. późne powikłania: gorączka reumatyczna, ostre kłębuszkowe zapalenie nerek

CZYNNIKI WIRULENCJI S. PYOGENES

Otoczka hialuronowa. Białko M – wiąże fibrynogen z surowicy ułatwiając adhezję i blokuje wiązanie dopełniacza do peptydoglikanu hamowanie fagocytozy. Enzymy: streptolizyna O, streptolizyna S, streptokinazy, nukleazy, hialuronidaza, peptydaza serynowa, proteazy, glikohydrolaza NAD. Toksyny ertytrogenne: toksyna A (pirogenna, immunomodulująca), toksyna B (proteaza cysteinowa)

Streptococcus agalactiae(paciorkowiec bezmleczności)

Składnik fizjologicznej flory bakteryjnej jamy ustnej, nosogardzieli, p. pokarmowego, pochwy

Może wywoływać niebezpieczne zakażenia noworodków – bakteriemia, zapalenie płuc, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. U dorosłych (diabetycy, alkoholicy)- zapalenie pęcherza moczowego, odmiedniczkowe zapalenie nerek

Streptococcus pneumonia –pneumokoki Dawniej Diplococcuspneumoniae

Czynnik etiologiczny płatowego zapalenia płuc. Najczęstsza przyczyna bakteryjnego zapalenia płuc u człowieka

Jeden z 3 najważniejszych drobnoustrojów wywołujących ropne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto: ostre zapalenie zatok, zapalenie ucha środkowego, zapalenie wsierdzia, zapalenie otrzewnej, zapalenie osierdzia, tkanki łącznej, ropień mózgu. Może być izolowany z gardła zdrowych osób α-hemoliza!

Paciorkowce jamy ustnej-grupa viridans

Grupy: S. mitis, S. mutans, S. salivarius, S. milleri Naturalna flora jamy ustnej i gardła W przypadku przedostania się do krwi stają się przyczyną ciężkich zakażeń: posocznica, zapalenie wsierdzia, zapalenie kości i szpiku kostnego, zapalenie płuc (grupa S. milleri– najczęściej S. anginosus) Paciorkowce z grupy S. mutans odp. za tworzenie plytki nazębnej i inicjowanie próchnicy zębów (obfite wytwarzanie śluzu zewkom. - lewanu i dekstranu silne wł. adhezyjne)

Enterococci- paciorkowce kałowe

Gramdodatnie ziarniaki (2.5µm), brak zdolności ruchu, względne beztlenowce, nie wytwarzają katalazy. T wzrostu 10- 45ºC, niektóre mogą przetrwać T pasteryzacji Należą, z kilkoma wyjątkami, do grupy D wg Lancefield. Bakterie mają kształt kulisty lub owalny, występują jako pojedyncze komórki, dwoinki lub krótkie łańcuszki. Szeroko rozpowszechnione (woda, powietrze, ścieki, gleba,)Rodzaj obejmuje kilkanaście gatunków Składnik flory jelitowej, czasem spotykane w jamie ustnej. Patogeny oportunistyczne - mogą być przyczyną zakażeń dróg moczowych, bakteriemii, zapalenia wsierdzia.W materiale klinicznym dominują: E. faecalis(80-90%), E. faecium (10-15%); sporadycznie E. avium, E . casseliflavus, E. durans, E. gallinarum, E. raffinosus

Mogą powodować α lub β hemolizę, najczęściej nie hemolizują

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium

Objawy kliniczne: kurczowe bóle brzucha, głowy, biegunki, podwyższona temp. ciała

Są istotnym parametrem zanieczyszczenia, jeżeli jest obecny w liczbie przewyższającej bakterie grupy coli sugeruje to zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami pochodzącymi z ferm hodowlanych. Dłuższa przeżywalność w wodzie i większa odporność na działanie chloru niż bakterie grupy coli

CZYNNIKI WIRULENCJI

Substancja agregująca- umożliwia agregację komórek bakteryjnych i adhezję do komórek gospodarza Kwas lipotejchowy- wiązanie enterocytów, limfocytów, leukocytów i nabłonka, stymuluje wydzielanie cytokin Cytolizyny (hemolizyny)Żelatynaza – hydroliza żelatyny, kolagenu, kazeiny, hemoglobiny, biofilm Hialuronidaza – degradacja mukopolisacharydów i uszkodzenie tkanek Białko Esp– adhezja do powierzchni abiotycznych, biofilm. Podczas analizy mikrobiologicznej wody łatwiejsza od próby analizy wszystkich mirkoorganizmów w niej obecnych, jest analiza organizmów wskaźnikowych:Escherichia coli. Bakteriegrupy coli

Paciorkowce kałowe Laseczki z rodzaju Clostridium redukujące siarczyny: Powinny być stale obecne w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Liczebność w jelicie i kale ludzi oraz zwierząt powinna być duża. Identyfikacja przy pomocy łatwych metod. Długość życia w środowisku zewnętrznym powinna być większa niż bakterii chorobotwórczych. Nie powinny rozmnażać się w środowisku wodnym

Mięso i przetwory mięsne. Badania mikrobiologiczne. Wykrywanie obecności i oznaczanie liczby enterokoków :Izolacja i identyfikacja. Klasyczne metody diagnozowania przynależności grupowej – wg Lancefield.Obecnie najczęściej do diagnozowania przynależności grupowej stosuje się testy lateksowe. Testy PYR, CAMP, wrażliwości na STX, bacytracynę, krążki z optochiną

Wykrywanie enterokoków – pożywkiwybiórcze: Jako czynniki działające wybiórczo najczęściej stosowane są: azydek sodu, antybiotyki (kanamycyna, gentamycyna, wankomycyna), fiolet krystaliczny, sole żółciowe, Tween-80. PrzykłademsąpożywkiEdwardsa i McKenzie.

Pożywka z azydkiem sodu i fioletem krystalicznym Zawiera fiolet krystaliczny (hamuje wzrost gramdodatnich bakterii z wyj. enterokoków i niektórych streptokoków), azydek sodu (hamuje wzrost gramujemnych bakterii) jako składniki selektywne oraz glukozę i purpurę bromofenolową (wskaźnik pH). Inkubację przeprowadza się w temp. 37ºC, przez 48 godz. Wynikiem dodatnim jest zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą.

Pożywka Slanetza-Bartleya:Nie inhibujelaktokoków, które mogą być obecne w żywności. Wskaźnikiem jest tutaj redukcja TTC (chlorku trifenylotetrazolu) do formazanu, co objawia się czerwonym zabarwieniem kolonii. Służy do określania liczbyenterokoków metodą rozcieńczeń.

Test naciepłooporność 0,1 ml hodowli inokuluje się probówkę z bulionem odżywczym i glukozą, a następnie ogrzewa w łaźni wodnej w temp. 63ºC przez 30 min. Probówkę schładza się, a następnie inkubuje w temp. 37ºC przez 18 godz. Wynikiem potwierdzającym obecność enterokoków jest zmętnienie hodowli.

Clostridiumspp.

G + laseczki .Bezwzględne beztlenowce.T wzrostu 10-50°C (formy wegetatywne). Wytwarzanie endospor w niekorzystnych warunkach. Chorobotwórcze bakterie z rodzaju Clostridium

Clostridium tetani – tężec, Clostridiumbotulinum - botulizm, Clostridium difficile– antibiotic-associated diarrhea (AAD)Clostridiumperfringens

Clostridium tetani

Wytwarza silną neurotoksynę - tetanospazminę porażenie spastyczne .Okres inkubacji od kilku dni do miesiąca. Rezerwuar ścieki, odchody, koniowate

Clostridium difficile

Najczęstsza przyczyna rzekomobłoniastego zapalenia jelit (obecność szarych błon rzekomych na powierzchni błony śluzowej).Namnażanie związane ze stosowaniem antybiotyków o szerokim spektrum działania. 10serotypów – największa toksynotwórczość serotyp F. Objawy: biegunka,ból brzucha,gorączka,w ciężkich przypadkach odwodnienie i wstrząs

Clostridium botulinum

Intoksykacja- spożycie żywności zanieczyszczonej formą wegetatywną lub sporami nie wywołuje zatrucia. Nie inwazyjny- nie wnika do tkanek i nie namnaża się w organizmie. Produkuje 9 typów egzotoksyn AG Botulizm u ludzi- typy A, B, E, F Botulizm dziecięcy Toksyna botulinowa:

Egzotoksyna – gromadzona we wnętrzu komórki i uwalniana po jej śmierci i w wyniku autolizy podczas sporulacji Źródła zatrucia:żywność mało kwaśna, nie poddana sterylizacji, produkowana z surowców mięsnych niepeklowanych przechowywana w warunkach beztlenowych w temp. powyżej 10⁰C. Figi, brzoskwinie, fasola, szparagi, szpinak, ryby, domowe konserwy. Inaktywacja 5-10min 85°C Neurotoksyna- hamuje uwalnianie acetylocholiny do szczeliny synaptycznej i skurcz włókien mięśniowych powodując porażenie i zwiotczenie mięśni ( zatrzymanie akcji serca i paraliż mięśni oddechowych śmierć Objawy (18-96h):wymioty, biegunka, zaparcia, podwójne widzenie, niemożność połykania, zaburzenia mowy. Dawka infekcyjna 0.001 ng/ kg masy ciała

Clostridium perfringens

Toksykoinfekcja . Dawka infekcyjna 10⁵ – 10⁶ kom/g. W optymalnych warunkach b. krótki czas generacyjny .W zależności od szczepu mogą przeżywać w 100ºC od 5min do 5 godzin. U ludzi jest przyczyną następujących chorób: gangreny (zgorzel gazowa)martwiczego zapalenia jelit u dzieci. zatruć pokarmowych AAD. Toksyny:Cl. perfringens wytwarza przynajmniej 12 toksyn, w tym 4 letalne (hemolizyny, proteazy, neuraminidazy, toksyny nekrotyczne)oraz enterotoksyny. Szczepy Cl. Perfringens podzielono na 5 typów produkujących toksyny letalne (A do E), oraz enterotoksyczny typ F.Enterotoksyny są wytwarzane przez szczepy należące do typu A i F (chorobotwórcze dla człowieka)Typy BE – patogeny zwierząt

Toksyny produkowane przez szczepy Clostridium perfringens

Szczepy Clostridium perfringens i ichToksyny: Szczep Typ A : alfa, enterotoksyna (CPE).Typ B: alfa, beta, epsilon.Typ C : alfa, beta .Typ D : alfa, epsilon.Typ E : alfa, iota. Typ F enterotoksyna (CPE). alfa, beta – toksyny nekrotyczne

CPE Uwalniana w czasie sporulacji form wegetatywnych w przewodzie pokarmowym

Powoduje zmianę przenikliwości błony cytoplazmat., zahamowanie transportu glukozy, utratę jonów Ca²⁺ i białek, uszkadzając nabłonek jelitowy zwiększenie wydzielania płynów w jelicie czczym (biegunka)Inaktywacja 5 min/ 60ºC

Clostridium perfringens: rezerwuar: Spory Clostridium perfringens są szeroko rozpowszechnione w środowisku, występują w: ziemi ,przewodzie pokarmowym zwierząt i ludzi, ściekach oraz w produktach spożywczych (mięso, konserwy, sosy, zupy, rośliny strączkowe)
Cl. perfringens powoduje zatrucia pokarmowe.Podczas obróbki termicznej żywności (gotowanie, pieczenie) giną formy wegetatywne bakterii, lecz przetrwalniki nie są inaktywowane! powolne wychładzanie (powyżej 2h) w temp. pokojowej ,kiełkowanie spor, gwałtowny rozwój form wegetatywnych ,brak lub nieodpowiednia powtórna obróbka termiczna < 75⁰C zatrucia pokarmowe.Źródła zatruć pokarmowych Clostridium perfringens: Produkty żywnościowe [zupy, pieczenie mięsne (brak lub bardzo niska koncentracja tlenu)] przygotowywane w dużych ilościach, a następnie przechowywane przez długi okres czasu (> 2h) w temp. pokojowej.

objawy zatrucia

łagodny charakter zatrucia. objawy pojawiają się po 8-24 godz. od spożycia żywności: gwałtowne b. silne bóle brzucha, wzdęcia,niewielka biegunka (często z domieszką krwi), objawy najczęściej ustępują po 12-24 godz. przy dużej koncentracji enterotoksyny mogą powodować silną biegunkę odwodnienie. Z reguły objawy zatrucia charakteryzuje: brak gorączki (w odróżnieniu od zatruć pałeczkamiSalmonella)oraz brak wymiotów (w odróżnieniu od gronkowcowych zatruć pokarmowych)

Typ A produkujący toksynę β2 –poważniejsze objawy (długotrwała biegunka, niekiedy z domieszką krwi 1 – 2 tyg).Typ C- nekrotyczne zapalenie jelita cienkiego, objawy wstrząsu i toksemii, często śmierć. Diagnoza:wywiad,obecność drobnoustrojów w kale w ilości co najmniej 10⁶jtk/1g (składnik mikroflory jelitowej),obecność enterotoksyn w kale – test ELISA

Leczenie zatruć pokarmowych Clostridium perfringens: Zapobieganie odwodnieniu,Antybiotykoterapia rzadko stosowana

Zapobieganie zatruciom

Clostridium perfringens

kiełkuje w temp. od 10⁰ C do 60⁰ C. Żywność powinna być przetrzymywana w niższej lub wyższej temperaturze. Żywność po obróbce termicznej – schładzamy najpóźniej w ciągu 2 godz. do temperatury poniżej 4⁰C .Przed bezpośrednim spożyciem ponownie ogrzewamy >75⁰C.

Bacillusspp.

G+ tlenowa (względnie beztlenowa) laseczka ,Zdolność ruchu ( wyjątek B. anthracis)

Wytwarzają przetrwalniki (tylko w warunkach tlenowych)Katalazo-dodatnie

Psychrofilne, mezofilne i termofilne (zależnie od gatunku 5-75ºC)Niskie wymagania pokarmowe, wzrost w prostych pożywkach.Do identyfikacji i różnicowania gatunków Bacillus wykorzystuje się:

cechy morfologiczne (wielkość, kształt, położenie przetrwalnika, otoczka, rzęski-ruch)

właściwości biochemiczne (lecytynaza, hemoliza typu β)

wrażliwość na penicylinę

Bacillus subtilis- laseczka sienna

Cechy: małe komórki, brak otoczki, hemoliza typu β, nie wytwarza lecytynazy, wrażliwy na penicylinę.Saprofit występujący w glebie. Odpowiedzialny za śluzowacenie pieczywa (szare, maziste, ciągnące, nieprzyjemny zapach

Bacillusanthracis- laseczka wąglika

Cechy: otoczka, produkcja lecytynazy, brak hemolizy typu β, wrażliwy na penicylinę

Wywołuje śmiertelną chorobę u zwierząt (gł. bydło, konie, kozy, owce) źródło –pasze

Ludzie- zoonoza (wełna, futra, skóry, mączka kostna, hodowla zwierząt, weterynarze):

postać skórna (o.i. 4-5dni) - zmiany na skórze rąk, twarzy, szyi. postać jelitowa - krwawe wymioty i biegunka, ból brzucha, zaparcia.postać płucna – kaszel, gorączka, dreszcze, krwista plwocina, duszność i sinica ( zgon 24-36h)

Bacillus cereus- laseczka woskowa

Cechy: brak otoczki, hemoliza typu β, lecytynaza, oporny na penicylinę. Wzrost 5 - 50ºC

Występowanie: ziemia, zbiorniki słodkowodne, przewód pokarmowy ludzi (10%)Termooporność – kilka minut 100ºC (olej sojowy121ºC/ 30min)Namnaża się w produktach gotowanych, przetrzymywanych w temp. powyżej > 15ºC. Toksykoinfekcja – liczba bakterii niezbędna do wytworzenia dawki toksycznej od 10³/g do 5x 10¹⁰/ml. Zatrucia – 2 zespoły objawów klinicznych:

postać biegunkowa - o.i. 8-16h, gł. biegunka (symptomy podobne do Cl. perfringens)

postać wymiotna- o.i. 1-6h, złe samopoczucie, nudności, wymioty, brak biegunki i gorączki (objawy ustępują po 24h)Postać biegunkowa- toksyny.Toksyny syntetyzowane w fazie logarytmicznego wzrostu.Źródło: zupy, potrawy mięsne, sosy, produkty mleczne

Ciepłowrażliwe – 5 min/ 56ºC. Enterotoksyna hemolityczna – uszkodzenie kom. nabłonka jelitowego, dermonekrotyczne, hemolityczne. Enterotoksyna niehemolityczna – silne działanie cytotoksyczne (podobne do werotoksyn)Cytotoksyna K- silne wł. cytotoksyczne, nekrotyczne i hemolityczna, liza enterocytów j. cienkiego biegunka. Postać wymiotna - toksyny

Cereulidyna - toksyna syntetyzowana w fazie stacjonarnej wzrostu (gł. serotyp 1).Źródło: potrawy z ryżu.Najsilniej syntetyzowana w 12-15ºC.Oporna na wysokie temperatury (nie traci właściwości nawet 90 min w 126ºC)Wywołuje zmiany strukturalne w mitochondriach i wzmaga przewodnictwo w komórkach przez tworzenie potasowych kanałów wzrost przepuszczalności błony

GRONKOWCE

Gramdodatnie bakterie o kształcie sferycznym, rosnące zwykle w postaci gron (greckie staphyle = grona)Nieruchliwe, nie tworzące przetrwalników Mogą tworzyć otoczkiWzględne beztlenowce, katalazo-dodatnie (większość szczepów)Rosną na pożywkach prostych.Gronkowce wchodzą w skład naturalnej flory bakteryjnej skóry i jamy nosowo-gardłowej. Występują w przedsionku nosa(!), w przewodzie słuchowym, na włosach i  na skórze, w przewodzie pokarmowym, moczowo- płciowym, w okolicy pach i pachwin. Szeroko rozpowszechnione w środowisku: w powietrzu, kurzu, glebie, ściekach. Nosicielstwo S,aureus nos- główna nisza ekologiczna S.aureus u ludzi „nasalcarriers”- zwiększone ryzyko zakażeń tym patogenem

Eradykacja S.aureus z nosa- zmniejsza ryzyko infekcji u pacjentów poddawanych leczeniu operacyjnemu i hemodializie (zwykle izolaty- z nosa oraz wywołujący zakażenie- ten sam genotyp/ typ fagowy) nosicielstwo w przedsionku nosa (zdrowi dorośli):trwali nosiciele 20%

tymczasowi 30% „non- carriers” 50% .Ok.80% infekcji szpitalnych S.aureus ma charakter endogenny! Są one wywoływane przez bakterie obecne na skórze / błonach śluzowych jeszcze przed przyjęciem na oddział szpitalny!

Zdolne do produkcji dużej liczby zewnątrzkomórkowych enzymów i toksyn. Dość odporne na czynniki zewnętrzne (wysychanie, temp.)- otoczka! Warunki wzrostu: temp. 7 - 47,8ºC, z optimum przy 37ºC; pH 4,5 - 9,3 z optimum przy ok. 7. Gronkowce są zdolne do wzrostu przy aktywności wody niższej niż 0,95 (do 0,85).To drobnoustroje halotolerantne!

RODZAJ STAPHYLOCOCCUS Obecnie ponad 40 gatunków. Wśród nich 6 gat. koagulazododatnich:S. aureus S. intermedius S. pseudintermedius S. hyicusS. schleiferisubsp. Coagulans S. delphini. Szczepy koagulazododatnie uznawane są za bardziej chorobotwórcze, co jednak nie zawsze jest uzasadnione.Gronkowce koagulazoujemne CNS preferowane miejsca: S.capitis- głowa. S.cohnii- stopy. S.saprophyticus- układ moczowo płciowy i przewód pokarmowy. S.epidermidis- skóra

Najczęściej z próbek klinicznych izolowane są:CNS- coagulase-negativestaphylococci

S.epidermidis- zakażenia zw. z użyciem cewników,wkłuć centralnych, sztucznych zastawek, endoprotez; zdolność do tworzenia biofilmu, znaczny odsetek szczepów wielolekopornych

S.saprophyticus- zakażenia układu moczowo-płciowego F! Z przypadków infekcji Ho izoluje się też: S. haemolyticus, S.warneri, S.caprae, S.lugdunensis. CNS czynniketiologiczny także: endocarditis (NVE, PVE), endophthalmitis, BSI, SSI, foreign body-related infections, mastitis. cns –bogactwo gatunków S.carnosus, S.capitis, S.sciuri, S.lutrae, S.microti, S.muscae

CNS- specyfika gatunkowa. CNS jako składnik kultur starterowych: Kultury starterowe– odpowiednio wyselekcjonowane drobnoustroje (bakterie, pleśnie lub drożdże), dodawane do żywności w celu poprawy jej wyglądu, zapachu, smaku lub wydłużenia trwałości. Stosowane przede wszystkim w mleczarstwie i wędliniarstwie: S.xylosus, S.carnosus, S.pasteuri,S.equorum

Drobnoustroje te odpowiadają za rozwój korzystnego zapachu oraz powstanie odpowiedniej barwy produktu

S.aureus

Wśród wszystkich przedstawicieli rodzaju Staphylococcus najbardziej chorobotwórczy gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus). Zanieczyszczenie żywności S. aureus może stanowić zagrożenie dla zdrowia konsumenta ze względu na enterotoksyny produkowane przez wiele szczepów. Jeden z najczęstszych patogenów człowieka (zatrucia pokarmowe, zakażenia skóry i tkanek podskórnych, syndrom szoku toksycznego, infekcje układu moczowego i oddechowego, zapalenia wsierdzia, szpiku kostnego i kości, opon mózgowych, mięśnia sercowego)

Wytwarza szereg czynników wirulencji (zewnątrzkomórkowe toksyny i enzymy, otoczka i białka powierzchniowe).Zdolny do nabywania oporności na antybiotyki (MRSA – metycylinoopornyStaphylococcus aureus)

Czynniki wirulencji

Otoczka – chroni przed fagocytozą. Białko A – wiąże fragment Fc przeciwciał z klasy IgG, hamując tym samym odpowiedź immunologiczną. Katalaza – enzym rozkładający H₂O₂ (ochrona przed makrofagami) Toksyny: α, β (uszkadzają erytrocyty), γ (uszkadza lizosomy), leukocydyna (niszczy leukocyty) Eksfoliatyna - powoduje powstawanie rozległych pęcherzy i złuszczanie naskórka

Toksyna zespołu wstrząsu toksycznego TSST-1, superantygen, odpowiada za wstrząs toksyczny

Koagulaza – tworzy warstwę fibryny wokół bakterii (ochrona przed fagocytozą)

CF – clumpingfactor (koagulaza związana ze ścianą komórkową); powoduje agregację bakterii w obecności fibrynogenu

Próba na CF: metodą szkiełkową - na szkiełku podstawowym umieścić obok siebie dwie krople soli fizjologicznej. W obu kroplach zawiesić ezą bakterie (zawiesina powinna być koloru mleka). Do jednej kropli dodać ezą osocza króliczego i wymieszać. Wynikiem dodatnim jest aglutynacja.

Food- borne diseases

choroby o charakterze toksycznym/ zakaźnym spowodowane bądź przypuszczalnie spowodowane spożyciem wody lub żywności. obecnie znanych ponad 250 FBD. 2/3 zachorowań ma etiologię bakteryjną. najczęstsze objawy: biegunka i wymioty

FBD outbreak- 2 lub więcej przypadków podobnej choroby, wynikających ze spożycia tej samej żywności. FBD~76mln zachorowań, 325tyś hospitalizowanych każdego roku, 5tyś zgonów (USA)

wiele przypadków niezgłaszanych!Zatrucia w PL:

1.Salmoneloza

2.E.colibiegunkotwórcza

3.Kampylobakterioza

4.Gronkowce

5.Botulizm

6.Czerwonka bakteryjna

(szigeloza)

W przypadku zatruć wywołanych przez gronkowce w ponad 30% przypadków niezbędna była hospitalizacja

Intoksykacja- przyczyną zatrucia są toksyny już obecne w żywności w chwili jej spożywania. Do rozwoju objawów zatrucia nie jest konieczne dostanie się do organizmu samego zarazka, który je wytworzył! Toksykoinfekcja pokarmowa: do uruchomienia całej kaskady procesu chorobotwórczego i wystąpienia zatrucia pokarmowego niezbędna jest inwazja drobnoustroju. Substancje o charakterze toksyn, wyzwalające objawy chorobowe, wydzielane są dopiero w organizmie gospodarza

Żywność zagrożona: Sery, produkty ze skorupiaków i mięczaków, mleko w proszku i serwatka w proszku Ciasta i wyroby cukiernicze Rzadziej mięso drobiowe, wędliny, kiełbasy dojrzewające

Żywność szczególnie zagrożona występowaniem enterotoksyn: produkty garmażeryjne, sosy majonezowe, sery, kremy

Enterotoksyny gronkowcowe

Wywołują objawy zatrucia pokarmowego po spożyciu zanieczyszczonej żywności,Superantygeny ( aktywują limfocyty T – uwalnianie cytokin)Ciepłooporne (nawet 100ºC),

Oporne na hydrolizę w kwaśnej treści żołądka, Oporne na enzymy proteolityczne takie jak trypsyna i pepsyna, Stymulują ośrodek wymiotny,Produkowane przez S. aureus oraz prawdopodobnie przez niektóre szczepy gronkowców koagulazoujemnych

23 czynniki lub potencjalne czynniki patogenne Wszystkie obecnie znane enterotoksyny są superantygenami !

Objawy gronkowcowego zatrucia pokarmowego Występują dość szybko (2-6 godz.) po spożyciu zanieczyszczonej żywności.Mdłości, wymioty, kurczowe bóle brzucha, w cięższych przypadkach bóle głowy, kurcze mięśni i zmiany ciśnienia krwi (zależy to od ogólnego stanu zdrowia pacjenta oraz od spożytej ilości). Czasem krwawe wymioty i stolec.Dawka toksyczna wynosi zwykle ok. 1 μg (osiągana gdy liczebność bakterii przekroczy 10⁶jtk/g żywności), choć może być tak niska jak 100-200 ng. Źródła zanieczyszczenia żywności: Kontakt bezpośredni (skóra),Droga kropelkowa (jama nosowo-gardłowa),Zanieczyszczone powierzchnie i narzędzia.

ZAPOBIEGANIE:Kontrola stanu skóry pracowników (ropiejące rany na rękach)Odzież ochronna (maski na twarz)Odpowiednia dezynfekcja narzędzi i powierzchni. Nie wszystkie szczepy S. aureus produkują enterotoksyny.Nieobecność żywych S. aureus w żywności nie wyklucza obecności enterotoksyn. Warunki niesprzyjające wzrostowi bakterii mogą doprowadzić do ich śmierci, podczas gdy dostateczna do wywołania choroby ilość enterotoksyn pozostanie w żywności.

Żywność podlega badaniu w kierunku enterotoksyn gdy liczba S.aureus przekracza 10⁵ jtk/g badanej żywności

Wykrywanie enterotoksyn w żywności – metody serologiczne

Immunodyfuzja w żelu Testy lateksowe ELISA

Mikrobiologia żywności i pasz -- Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) -- Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej Baird-Parkera Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL :pożywkaGiolitti i Cantoni(Pożywka wybiórcza do izolowania i namnażania gronkowców):Chlorek litu hamuje rozwój gramujemnych bakterii.Telluryn potasu hamuje wzrost gramdodatnich laseczek.Pirogronian sodu w połączeniu z glicyną stymuluje wzrost gronkowców

Gronkowce przy wzroście na płynnej pożywce Giolitti-Cantoni powodują wytworzenie szarego lub czarnoszarego osadu, bądź zaczernienie całej pożywki.Pożywka baird-parkera

W przypadku wyniku dodatniego na pożywce Giolitti i Cantoni, przesiewa się bakterie na podłoże Bairda i Parkera celem potwierdzenia obecności S. aureus Zawiera chlorek litu, telluryn potasu z glicyną, pirogronian sodu oraz emulsję jaja kurzego- S. aureus jest w stanie rozkładać żółtko (lipaza)Na pożywce Bairda-Parkera rosną w postaci czarnych, błyszczących kolonii, zwykle otoczonych matową lub przejrzystą strefą (szczepy produkujące lipazę).

próba na katalazę

Na szkiełko podstawowe nałożyć kroplę soli fizjologicznej. Zawiesić ezą bakterie w płynie fizjologicznym. Dodać kroplę nadtlenku wodoru. Wynikiem dodatnim jest wytwarzanie bąbelków.

próba na wytwarzanie koagulazy

Do jałowej probówki przenieść 0,1 cm³ hodowli, dodać 0,3 cm³ plazmy krwi króliczej. Po 4-6 godzinach inkubacji w temp. 37ºC obserwować ścinanie się plazmy. Jeżeli wynik jest ujemny inkubację wydłużyć o kolejne 24 godziny.

Oznaczanie obecności pałeczek Salmonella spp. w żywności

Enterobacteriaceae(enterobakterie-pałeczki jelitowe)

To gram-ujemne bakterie jelitowe o kształcie pałeczek, niesporulujące, fermentujące glukozę i tworzące kwas.Komórki bakteryjne są dość duże, urzęsione (nieliczne wyjątki). Niektóre szczepy są otoczkowe.To względne beztlenowce. Hoduje się je na prostych podłożach, w warunkach normalnej atmosfery. Rodzina Enterobacteriaceae- kilkadziesiąt rodzajów bakterii:SalmonellaProteusEscherichiaHafniaEnterobacterCitrobacterYersiniaKlebsiellaShigellaSerratiaEnterobacter (Cronobacter) sakazakii.Są to ruchliwe, gram-ujemne pałeczki, należące do rodziny Enterobacteriaceae. Dobrze rosną w warunkach tlenowych i beztlenowych. Nie tworzą przetrwalników. Ich temperatury rozwojowe mieszczą się w granicach 5- 45°C. Są wrażliwe na wysoką temperaturę, ale wykazują dużą wytrzymałość na wysuszanie. Wykazują wrażliwość na wysokie stężenia NaCl (tolerancja do 9%) oraz niskie pH.

Charakterystyka pałeczek z rodzaju Salmonella Fermentują glukozę, natomiast nie fermentują laktozy i sacharozy, co jest ważną cecha podczas ich identyfikacji. Są zdolne do dekarboksylacji lizyny, ornityny i argininy. Redukują azotany, wytwarzają siarkowodór. Nie upłynniają żelatyny i nie rozkładają mocznika (cecha różnicująca z Proteusspp.- test na wytwarzanie ureazy).Systematyka pałeczek Salmonella spp: obejmuje dwa gatunki: S. enterica i S. bongori. Gat.Salmonella entericapodzielony został na 6 podgatunków, a każdy z nich, ze względu na różnice w budowie antygenów, na typy serologiczne- tzw. serowary

Systematyka pałeczek Salmonella spp.S. bongori (20 serowarów)Zaliczamy tu niezwykle rzadko występujące serowary, o znikomej lub niezbadanej patogenności dla człowieka. Serowary te izolowane są najczęściej od zwierząt zmiennocieplnych, takich jak węże czy niektóre gatunki żółwi i jaszczurek.Systematyka pałeczek Salmonella spp.

S. enterica- w obrębie gatunku wyróżniamy 6 podgatunków (subspecies) : enterica(ponad 2500 serowarów)salamae arizonae diarizonae houtenae indica.Salmonella entericaspp. enterica: Do głównych serowarów należą: S. Enteritidis, S. Typhimurium(S. Virchow, S. Hadar– odpowiedzialne za zapalenie jelita cienkiego i grubego )S. Typhi- wywołujący dur brzuszny (durowe)S. Paratyphi– wywołujący dury rzekome(durowe)Istnieją także gatunkowo specyficzne serowarySalmonella spp.S. Dublin- cielęta(durowe)S. Gallinarum, S. Pullorum- drób(durowe)S. Typhi- człowiek

S.choleraesuis(durowe) Dominujące serowary w zatruciach ludzi :S.Enteridtidis (45%) i S. Typhimurium(22.4%)

Występowanie Pałeczki Salmonella spp. najczęściej zasiedlają przewód pokarmowy zwierząt domowych oraz dzikich, drobiu hodowlanego, ptaków, owadów, a także gryzoni. Dużą rolę w przenoszeniu pałeczek Salmonella spp. odgrywają produkty roślinne, szczególnie z terenów nawożonych fekaliami(krążenie pałeczek jelitowych w przyrodzie).Źródłem zanieczyszczenia żywności mogą być także ludzie chorzy i nosiciele tych bakterii. Z racji dużej oporności na wysuszanie, pałeczki te mogą przeżywać przez długi czas w kurzu, paszach, suszonej żywności. Zarazki te bardzo dobrze radzą sobie także w produktach płynnych i mrożonych, w których przeżywają przez długi czas w stanie anabiozy. Najczęściej izolowane są z jaj oraz produktów je zawierających (lody, ciastka, kremy, czekolada).Salmonella in food(najwyzszy indeks niezgodnosci): mielone mięso drobiowe i wyroby z niego pochodzące przeznaczone do spożycia po obróbce termicznej,mięso mielone i wyroby mięsne przeznaczone do spożycia na surowo,owoce morza,surówki warzywne i sałatki owocowe (RTE food),produkty jajeczne,wyroby mięsne i drobiowe przeznaczone do spożycia po obróbce termicznej,produkty mleczne ( z mleka niepasteryzowanego lub poddanego łagodne obróbce termicznej)

Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmow a o uruchomienia całej kaskady procesu chorobotwórczego niezbędna jest inwazja drobnoustroju.Substancje o charakterze toksyn, wyzwalające objawy chorobowe, wydzielane są dopiero w organizmie gospodarza, a nie w żywności, jak w przypadku gronkowcowych zatruć pokarmowych.

Czynnikami wirulencji zarazka są:

organella i struktury komórkowe o właściwościach adhezyn i białek inwazyjnych (np. OMP), umożliwiające mu bezpośredni kontakt z komórkami makroorganizmu (adherencję) lub wnikanie do ich wnętrza. Substancje o charakterze toksyn wyzwalające objawy chorobowe. Do substancji o charakterze toksyn zaliczamy:LPS ściany komórkowej (charakter endotoksyny, działanie pyrogenne)

Ciepłooporne i ciepłowrażliwe enterotoksyny identyczne z enterotoksynami ST i LT E.coli, wpływające na zmianę aktywności sekrecyjnej i enterosorpcyjnej nabłonka jelitowego.Cytotoksynywywołujące nasilone zmiany zapalne i destrukcję komórek nabłonka jelitowego np. Shiga T

Dwie podstawowe formy kliniczne salmonellozy: 1.zatrucie pokarmowe-gastroenteritis; jest to postać lokalna choroby2. gorączki durowe, przebiegające pod postacią infekcji uogólnionych.

Dawka infekcyjna dla człowieka to ok. 10⁵kom/g zanieczyszczonej żywności. Dla osób starszych i niemowląt już 10² kom/g (100 komórek/1 gram) może się okazać wystarczające do wywołania choroby. Po przedostaniu się do przewodu pokarmowego pałeczki Salmonella spp. zdolne są do namnażania w jelicie cienkim, kolonizacji i przenikania w głąb ściany jelita. Po uwolnieniu endotoksyn zawartych w komórkach widoczne są objawy salmonellozy: gorączka, bóle brzucha, biegunka, wymioty. Objawy widoczne są po 12-48h od wprowadzenia zarazka do organizmu.

Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa.Krótko po wystąpieniu objawów zarazki pojawiają się w kale, natomiast bardzo rzadko dochodzi do ich wysiewu do krwi.Najczęściej do uogólnienia procesu chorobowego dochodzi w przypadku zakażeń S. Choleraesuis, wtedy następuje gwałtowna zwyżka temperatury (nawet do 40 st. C), a zarazki można wyodrębnić w posiewach z krwi. Z krwiobiegiem Salmonella przenoszona jest do różnych narządów, np. płuc, stawów, serca, powodując lokalne zapalenia (pneumonia, osteomielitis, endocarditis, meningitis) W przypadku implantacji w pęcherzyku żółciowym, rekonwalescent staje się długotrwałym nosicielem i siewcą zarazka.

Horyzontalna metoda wykrywania Salmonellaspp. Oznaczanie obecności pałeczek Salmonella sp. w próbkach żywności obejmuje kilka etapów: I. Przednamnażanie na wodzie peptonowej II. Namnażanie selektywne na pożywce półpłynnej III. Różnicowanie na podłożach agarowych IV. Identyfikacja w oparciu o testy biochemiczne i serologiczne . Schemat postępowania:Badana próbka->Zbuforowana woda peptonowa 37 ºC / 18h->Zmodyfikowana pożywka półpłynna Rappaport-Vassiliadis 41.5 ºC / 24h->Agar selektywny XLD + BGA lub pożywka bizmutawo-siarczynowa

37 ºC / 24h Badania potwierdzające.Salmonella sp. - stosowane podłoża: Zbuforowana woda peptonowa - pożywka stosowana w celu nieselektywnego namnażania pałeczek Salmonella sp., sprzyja regeneracji komórek uszkodzonych podczas procesów technologicznych. Zmodyfikowana pożywka półpłynna Rappaport-Vassiliadis (MSRV)– silnie selektywna, zawiera w swoim składzie zieleń malachitowąi chlorek sodu, które hamują wzrost mikroflory towarzyszącej. Pożywka XLD– zawiera laktozę, L-lizynę, ksylozę, dezoksycholan sodu. Typowe kolonie Salmonella sp. są lekko przezroczyste z czerwonym brzegiem i czarnym centrum. Pożywka BGA- z zielenią brylantową, czerwienią fenolową, laktozą, sacharozą. Typowe kolonie Salmonella sp. są koloru podłoża (różowe) i otoczone jasno-czerwoną strefą.

Salmonella- wzrost na pożywce XLD Na pożywce XLD typowe kolonie Salmonella mają czarne środki i są otoczone lekko przezroczystą strefą koloru jasnoczerwonego; wokół kolonii zwłaszcza przy gęstym wzroście Salmonella widoczna jest strefa różowoczerwona, różnej szerokości.Czarne zabarwienie centralnej części kolonii wynika ze zdolności do produkcji siarkowodoru (H2S)Barwa różowa pożywki wokół kolonii dowodzi zdolności dekarboksylacji lizyny obecnej w pożywce XLD .Szczepy Salmonella nie wytwarzające siarkowodoru np. (S.Paratyphi A) rosną na pożywce XLD w postaci różowych kolonii z ciemniejszymi, różowymi środkami

Salmonella- wzrost na podłożu BGA Charakterystyczne kolonie są koloru podłoża (różowe) i otoczone jasno-czerwoną strefą. Ponieważ bakterie z rodzaju Salmonella nie fermentują laktozy (poza nielicznymi szczepami) ani sacharozy, dochodzi do alkalizacji podłoża i różowego wybarwienia pożywki. Escherichia coli on BGA Agar. E. coli rozkłada laktozę zawartą w pożywce. Dochodzi do zakwaszenia podłoża i zmiany barwy pożywki na cytrynowo- żółtą.

Właściwości biochemiczne –podłoże TSI (Kliglera):agar trójcukrowy (glukoza, laktoza, sacharoza)TSI- podłoże ma postać słupka i półskosu, - posiewy wykonuje się w dwojaki sposób: na powierzchni skosu i wgłębnie. - dokonujemy obserwacji fermentacji glukozy (barwa słupka), laktozy (barwa skosu), wytwarzania gazu (pęcherzyki gazu, porozrywany agar) oraz wytwarzanie H₂S (barwa czarna).

Całe żółte:E.coli(calość zolta: fermentacja glukozy i laktozy) Salmonella i Proteus(czerwony skos, czarny slupek: fermentacja laktozy i wytwarzanie H2S) Shigella(skos czerwony, slupek zolty: fermentacja glukozy)

Podłoże SS Salmonella- ShigellaZawiera laktozę, cytrynian sodu, cytrynian żelazowy, oraz czerwień obojętną i zieleń brylantowąTo podłoże wybiórcze stosowane do izolacji pałeczek Salmonella i Shigella.Zahamowany jest wzrost flory G+ oraz częściowo E. coliDrobnoustroje laktozododatnie(E. coli) rosną w postaci czerwonych kolonii lub bezbarwnych, z czerwonymi środkamiSalmonella i Shigellatworzą kolonie bezbarwne, przejrzyste, a szczepy wytwarzające siarkowodór tworzą kolonie z czarnymi środkami.Proteuswzrost obfity, w formie gładkiej, tworzy kolonie duże, płaskie koloru żółtego. Szczepy wytwarzające siarkowodór tworzą również kolonie z czarnym środkiem.

Wytwarzanie ureazy na pożywce Christensena Dekarboksylacja lizyny Wykrywanie ß-galaktozydazy Reakcja Vogues-Proskauera (VP) Wytwarzanie indolu na pożywce z tryptofanem

Badanie serologiczne kolonii podejrzanych o przynależność do Salmonella spp.

Podstawą klasyfikacji pałeczek Salmonella są różnice we właściwościach antygenowych.

Metoda badania: aglutynacja szkiełkowa.Określamy obecność antygenów somatycznych (O), rzęskowych (H) oraz otoczkowych (Vi)Wykluczamy szczepy zdolne do autoaglutynacji (roztarcie niewielkiej ilości hodowli z agaru odżywczego z kroplą soli fizjologicznej).Czas oczekiwania 30-60s., obserwacja szkiełka na czarnym tle, lupa powiększającaPierw badanie na obecność antygenu rzęskowego (H)Następnie ocena reakcji z surowicami anty-O. Używamy kolejno surowicy poli- i monowalentnej. W przypadku badania żywności nie używamy surowicy grupowo specyficznej anty-OA ( S.Typhi, S. Paratyphi- serowary te nie są specyficzne dla żywności)Korzystamy z surowic anty- OD, OB, OC i OE (bo niemal 100% szczepów izolowanych z żywności należy do tych serogrup)

Wykrywanie obecności antygenów otoczkowych Vi Potwierdzenie ostateczne:Szczepy, określone jako Salmonella lub podejrzane o przynależność do rodzaju Salmonella, w razie niejasności,należy przesłać do ośrodka referencyjnego dla tego drobnoustroju, w celu wykonania ostatecznego typowania.Do przesłanego drobnoustroju należy dołączyć wszelkie informacje na jego temat.

Oznaczanie obecności pałeczek Campylobacterspp. w żywności

Campylobacterspp.

Główny czynnik etiologiczny biegunek u Ho na całym świecie. W roku 2010 kampylobakterioza była najczęściej występującą chorobą odzwierzęcą w EU-212,064 przypadków (raport EFSA 2012)Problem dotyczy nawet 0,8% ludzi każdego roku!Charakterystyka ogólna drobnoustrojów Campylobacter . Bakterie znane od 1886 roku, dawniej klasyfikowane jako rodzaj Vibrio, nazwa Campylobacter wprowadzona później. Cienkie zakrzywione (seagullwing, corkscrew), gram-ujemne pałeczki, niewytwarzające przetrwalników. Pojedyncza rzęska, uni- lub bipolarnie, więc zdolność do ruchu; w świeżych preparatach wysoce ruchliwe, ruch skokowy (mikroskop z ciemnym polem widzenia lub kontrastowo-fazowy)Katalaza+, oksydaza+ Nie fermentują glukozy

Campylobacterales: Helicobacterspp.Helicobacterspp.

Czynniki zjadliwości- rola w rozwoju procesu zapalnego: adhezyny, antygen A CagA, VacA wytwarzanie rzęsek, białka blok. wytwarzanie kwasu soku żołądkowego, mucynaza, katalaza, ureaza, SOD

Charakterystyka ogólna drobnoustrojów: Bakterie termofilne i mikroaerofilne

Optymalny wzrost w atmosferze o zredukowanej zawartości tlenu, w temp. 42˚C (war. panujące w pp. ptaków!) Brak wzrostu w temperaturze pokojowej Wrażliwośćna czynniki środowiska (wysychanie, pH<5.0, NaCl> 2.5%) znacznie większa niż Salmonella sp. lub E.coli. Powolne namnażanie- okres inkubacji podłoży: 48-72h!Trudna hodowla drobnoustroju- wymaga podłoży wzbogaconych, z dodatkiem czynników selektywnych (antybiotyki), aparatów do inkubacji posiewów w atm. mikroaerofilnej (anaerostatów)Więc rzeczywista liczba przypadków zatruć na tle Campylobacterspp. znacznie niedoszacowana!

W obrębie rodzaju zidentyfikowano wiele gatunków i podgatunków

Patogenne dla człowieka są:C.jejuni subspecies jejuni Campylobacter coli C.jejuni subspecies doylei Campylobacter lari C.fetus subspecies fetus Campylobacter hyointestinalis Campylobacter concisus. Campylobactersp:. C.helveticus C.lari C.canadensis

Rezerwuary Campylobacterspp. Drób- zakażenia Campylobacterspp. W zakażeniach ptaków dominują C.jejuni i C.coli Infekcja u drobiu najczęściej przebiega bezobjawowo

U młodych osobników możliwe stany zapalne jelit (enteritis) i biegunki Często jedynie obniżenie produkcyjności stada Pozostałe gatunki ptaków:wróble i jaskółki- najwyższy procent nosicielstwa: od 50-100% wrony do 89% gołębie miejskie do 60% mewy ok. 50% Campylobacterspp. może także kolonizować przewód pokarmowy wielu innych gatunków zwierząt:Bydło: C. jejunii C. hyointestinalisoraz C.fetussubsp. veneralis (choroba mętwikowa)Owce: C.fetussubspeciesfetus(enzootyczne ronienia owiec)Trzoda chlewna: C.coli, rzadziej C.larii C.upsaliensis; C. mucosalisiC.hyointestinalissą składnikami normalnej flory jelitowej

Rezerwuary Campylobacterspp.Wysokie nosicielstwo wśród zwierząt towarzyszących! Koty- prewalencja do 92%, dominuje C. helveticusPsy- do 76% zakażonych, dominuje C. upsaliensis

Kliniczne objawy zakażenia u kociąt i szczeniąt (biegunka); zarazki przez cały okres trwania choroby wydalane są wraz z kałem do otoczenia. Zwierzęta te mogą być źródłem zakażenia zwłaszcza dla dzieci (brak dostatecznej higieny, np. po zabawie z pupilami)

Czynniki zjadliwości zarazka Campylobacter spp:

Ruchliwość i chemotaksja (mutanty pozbawione tych cech nie były w stanie kolonizować enterocytów) Adhezja i inwazyjnoś(dochodzi do reakcji pomiędzy adhezynami na powierzchni komórki bakteryjnej a receptorami na powierzchni komórek eukariotycznych gospodarza)

Zdolność do produkcji enterotoksyn i cytotoksyn(VT-like), toksyna LT(biegunka sekrecyjna)

Po dostaniu się do jelita większość szczepów Campylobacterspp. przedostaje się przez warstwę śluzu, przyczepia się do komórek nabłonka jelitowego i do nich wnika. Funkcję adhezyn spełniają białka rzęski, białka błony zewnętrznej oraz glikolipidy. Białka błony zewnętrznej, (np. CadF- białko wiążące fibronektynę) umożliwiają proces internalizacji komórki bakteryjnej.

Reszty cukrowe glikolipidów i glikoprotein biorą udział w stymulacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Campylobacterspp.aspekt epidemiologiczny Epidemie pokarmowe u ludzi

Co roku Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności publikuje raport dot. zoonoz u ludzi

Raport opiera się o dane przekazywane przez państwa członkowskie EUIstotną częścią tego opracowania jest informacja dot. występowania zatruć pokarmowych u ludzi o charakterze epidemicznym, wywoływanych przez chorobotwórcze bakterie, wirusy i pasożyty Raport zawiera informacje nt liczby epidemii pokarmowych, ich źródeł w postaci żywności (…) oraz dróg zakażeń człowiekaEpidemie pokarmowe u ludzi:Epidemia pokarmowa (food-borne outbreak ) to epidemia, której źródłem jest żywność; zachorowania obejmują dwa lub więcej przypadków, a ich wystąpienie jest związane lub prawdopodobnie związane z tym samym źródłem zakażenia. Zatrucia na tle termofilnych pałeczek Campylobacterspp.- na III miejscu

liczba przypadków systematycznie wzrasta (coraz lepsza diagnostyka!)W latach 2005-2010 kampylobakterioza była najczęściej występującą chorobą odzwierzęcą u ludzi

Camylobacterspp. –żywność zagrożona mięso drobiowe i jego produkty (niepoddane odpowiedniej obróbce termicznej) skóra drobiu po uboju wilgotna, pokryta śluzem; zarazki te izolowane są nawet ze 100% tuszek, w 1g skóry drobiu po uboju nawet 100- 10000 tyś. pałeczek)

mleko i przetwory mleczne (zwłaszcza mleko niepasteryzowane! Pasteryzacja łatwo niszczy zarazek)Owoce oraz warzywa- pola nawożone obornikiem i gnojowicą Niedogotowane mięso wieprzowe, wołowe, dziczyzna, baranina, podrobyJajaOwoce morza (ostrygi, małże)Woda. Jakiekolwiek inne pokarmy zanieczyszczone poprzez kontakt z surowym mięsem drobiowym

Zatrucia ludzi- przebieg i objawy To toksykoinfekcja pokarmowaDawka infekcyjna-500 bakterii!

Do zakażeń ludzi dochodzi relatywnie łatwo i częstoOkres inkubacji: 2- 5 dni od spożycia zakażonej żywności Zwykle postać zapalenia żołądka i jelit lub zapalenia jelit (gastroenteritis/enteritis) Najczęściej biegunka>>krwawa, połączona z bólem brzucha i gorączką

Ponadto nudności, wymioty, ogólne osłabienie Samowyleczenie w ciągu 3- 6 dni i dłużej(!)

Uogólnione zakażenie- rzadko U dzieci objawy mogą sugerować zapalenie wyrostka robaczkowego Lek z wyboru: azytromycyna lub erytromycyna Zatrucia ludzi- przebieg i objawy

Zatrucie może mieć groźny przebieg w przypadku osób w złym stanie ogólnym, chorych na raka, zakażonych HIV, diabetyków i ludzi starszych W USA każdego roku z powodu kampylobakteriozy notuje się ok. 1000 zgonów Późne konsekwencje zakażenia pałeczkami Campylobacterspp.

Jak zapobiegać zatruciom?Przestrzeganie zasad higieny podczas przygotowywania, podawania posiłków oraz przechowywania żywności (dotyczy to w szczególności potraw z drobiu)

Wystarczająco długa obróbka cieplna dań z drobiu(sok wypływający z nakłutego mięsa winien być klarowny)Wydzielenie osobnych desek i tacek używanych tylko do przygotowywania potraw z drobiu (aby nie doszło do ew. zakażenia krzyżowego pozostałych dań, zwłaszcza tych, które nie będą już poddawane obróbce termicznej) Dokładne mycie rąk

przed przystąpieniem do przygotowywania posiłków, w trakcie i po zakończeniu prac kuchennych

po kontakcie z osobą wykazującą objawy zatrucia pokarmowego

po zabawie ze zwierzętami domowymi Jak najszybsze schładzanie potraw (do dwóch godzin po przyrządzeniu) Rozmrażanie drobiu w lodówce, nie w temperaturze pokojowej (zwróć uwagę aby sok nie skapywał na produkty na niższych półkach); gdy nie ma wystarczająco dużo czasu- należy użyć mikrofalówki

Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacterspp.

Metoda ta ma zastosowanie do badania żywności i pasz oraz próbek środowiskowych z obszaru produkcji żywności i obrotu żywnością. Wykrywanie obecności bakterii z rodzaju Campylobacter wymaga wykonania następujących etapów badań:Namnażanie na selektywnej pożywce płynnej

Izolowanie i wybór do potwierdzeń Potwierdzenie Pobieranie próbek. Próbka powinna być w pełni reprezentatywna, nie może ulec uszkodzeniu ani zmianie podczas transportu lub przechowywania Bakterie z rodzaju Campylobacter są wrażliwe na mrożenie, ale stosunkowo dobrze przeżywają w warunkach chłodniczych, niewskazane jest stosowanie mrożenia, zaleca się przechowywanie próbek w temp. +3˚C +/- 2C Próbki należy poddać badaniom tak szybko, jak to możliwe; Chronić przed wysuszeniem Wielkość naważki, zawiesina wyjściowa i rozcieńczenia Aby przygotować wyjściowa zawiesinę należy zmieszać określona ilość próbki (masa lub objętość) z dziewięciokrotną objętością płynnej pożywki namnażającej (bulion Boltona) 1.Namnażanie: Bulion Boltona- płynna pożywka namnażająca Inkubacja w warunkach mikroaerofilnych 37˚C przez 4-6h, a następnie w 42˚C przez 44 +/- 4 h 2. Izolacja

Hodowlę z pożywki namnażającej przesiewamy na dwie różne selektywne pożywki agarowe:

1.agar CCDA (charcoal cefoperazone deoxycholate agar) 2.pożywkę agarową różniącą się zasadniczo od CCDA: do wyboru: Agar Skirrow, Agar Karmali , Agar Prestona. inkubacja w atm. mikroaerofilnej, w 41,5°C, 44h po tym czasie sprawdzić obecność typowych/ podejrzanych kolonii Campylobacterna płytkach. CCDA Agar :Typowe kolonie są szarawe, często z metalicznym połyskiem, płaskie i wilgotne, z tendencją do rozlewającego wzrostu

3. Potwierdzanie gatunków
Campylobacterspp. Bakterie żywotne jedynie w atm. mikroaerofilnej, wszystkie czynności wykonywać możliwie szybko! Do badań wybieramy 1 podejrzaną/ typową kolonię; gdy wynik ujemny- pobieramy kolejne 4 kolonie. Przesiew wybranej kolonii na pożywkę agarową Columbia z krwią.Ocena cech morfologicznych i zdolności do ruchu pod mikroskopem

Ocena zdolności do wzrostu w temp. 25˚C w atm. mikroaerofilnej na pożywce Columbia z krwią

Ocena zdolności do wzrostu w temp. 41,˚5C w atm. tlenowej na pożywce Columbia z krwią

Wykrywanie oksydazy- część wybranej charakterystycznej kolonii rozetrzeć na bibule filtracyjnej nasączonej odczynnikiem na oksydazę.Reakcja dodatnia, gdy w ciągu 10s fioletowe lub ciemnoniebieskie zabarwienie.4. Identyfikacja gatunkowa(nieobligatoryjna)wykrywanie katalazy

określanie wrażliwości na kwas nalidyksowy i cefalotynę, wykrywanie zdolności hydrolizy hipuranu, wykrywanie zdolności hydrolizy octanu indoksylu