Temat ćwiczenia

TECHNIKA MIKROSKOPOWA

Wprowadzenie

• Powstawanie obrazu mikroskopowego. Bieg promieni świetlnych oraz sposób powstawania obrazu przedstawiono na rysunku. Jak wynika z układu optycznego mikroskopu, powstający obraz jest pozorny, powiększony i odwrócony.

• Powiększenie całkowite mikroskopu. Oblicza się je, mnożąc powiększenie obiektywu przez powiększenie okularu i ewentualnie przez powiększenie pośredniego układu optycznego. W praktyce całkowite powiększenie mikroskopów świetlnych mieszczą się w zakresie od 10 do 1500x.

• Zdolność rozdzielcza mikroskopu. Jakość obrazu oraz ilość informacji możliwych do uzyskania na jego podstawie uzależniona jest nie tylko od użytego powiększenia, ale przede wszystkim od tzw zdolności rozdzielczej układu optycznego.

2

Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość dzieląca dwa punkty, które w obrazie mikroskopowym dostrzegane są oddzielnie. Im mniejsza jest ta odległość, tym lepsza jest zdolność rozdzielcza układu optycznego i tym więcej informacji zawartych jest w obrazie mikroskopowym. W praktyce oznacza to również, że lepsza zdolność rozdzielcza umożliwia stosowanie większych powiększeń. Zdolność rozdzielczą mikroskopu określa wzór: Ad2λ= gdzie: λ= długość fali tworzącej obraz (np. światła dla mikroskopu świetlnego); λ = 0,55 μm A = apertura numeryczna obiektywu mikroskopu, obliczana wg wzoru: αsin⋅=nA gdzie: n = współczynnik załamania fali tworzącej obraz charakteryzujący środowisko zawarte pomiędzy preparatem a soczewką obiektywu (w mikroskopach świetlnych jest to szkło lub powietrze) α = kąt pomiędzy osią optyczną obiektywu a najbardziej skrajnym promieniem wpadającym do jego soczewki czołowej przy prawidłowym zorganizowaniu układu. W ostatnich latach zdolność rozdzielczą mikroskopu świetlnego można poprawić przez cyfrową obróbkę obrazu, wymagającą skomplikowanego oprzyrządowania komputerowego – uzyskana poprawa jest jednak nieznaczna.

3

BUDOWA MIKROSKOPU ŚWIETLNEGO W skład każdego mikroskopu świetlnego wchodzą dwa zespoły: mechaniczny i optyczny.

1. Zespół mechaniczny

Zespół mechaniczny zbudowany jest z następujących elementów:

• podstawa mikroskopu, z reguły masywna, zapewniająca jego stabilność;

• statyw, do którego przymocowany jest stolik przedmiotowy i tubus

• stolik przedmiotowy, posiadający w środku okrągły otwór dla przejścia wiązki promieni świetlnych. Stolik wyposażony jest w poruszane współosiowymi pokrętłami prowadnice, umożliwiające przesuwanie preparatu w dwóch prostopadłych do siebie kierunkach. Dodatkowa kalibracja (na prowadnicach lub pokrętłach) pozwala na liczbowe określenie współrzędnych dowolnego miejsca w preparacie i szybkie odszukanie go przy powtórnym oglądaniu

• tubus, na którego przeciwległych końcach zamocowane są podstawowe elementy optyczne tworzące obraz: okular i obiektyw. We współczesnych mikroskopach stosuje się tzw. tubus łamany, w którym osie optyczne obiektywu i okularu tworzą ze sobą pewien kąt, co umożliwia wygodne mikroskopowanie

• urządzenie rewolwerowe – obrotowa tarcza znajdująca się na dolnym końcu tubusu, do której wkręca się 3-6 obiektywów. dzięki obecności mechanizmu zatrzaskowego umożliwia szybkie ustawienie pożądanego obiektywu w osi optycznej (zmianę powiększeń)

• śruba makrometryczna i mikrometryczna. Precyzyjne ustawienie ostrości obrazu wymaga regulacji odległości pomiędzy preparatem a obiektywem, czyli pomiędzy stolikiem przedmiotowym a tubusem. W zależności od konstrukcji mikroskopu elementem ruchowym może być bądź stolik, bądź tubus, a przesuwu dokonuje się za pośrednictwem dwóch zazwyczaj współosiowych pokręteł umieszczonych w statywie mikroskopu: śruby makrometrycznej (szybkiego przesuwu) oraz mikrometrycznej (wolnego przesuwu) oraz mikrometrycznej (wolnego przesuwu)

4

2. Zespół optyczny W skład zespołu optycznego wchodzą:

• źródło światła - mikroskopy badawcze posiadają wbudowane w podstawę własne źródło światła (żarówkę) o regulowanej jaskrawości świecenia, wyposażone w przesłonę. Mikroskopy szkolne wyposażone są w dwustronne lusterko mogące obracać się we wszystkich płaszczyznach. Za jego pośrednictwem można korzystać z zewnętrznych źródeł światła (światło dzienne lub lampa)

• filtry - mikroskopy badawcze wyposażone są w kilka barwnych filtrów (niebieski, zielony, żółty, czerwony), pomocnych przy kontrastowaniu obrazu mikroskopowego i przy wykonywaniu mikrofotografii, a także w filtr ciemny, zmniejszający jaskrawość obrazu przy mniejszych powiększeniach

• przesłona - umieszczona z reguły (pod) kondensatorem pozwala na regulacje jasności pola widzenia i kontrastowości obrazu

• kondensor – jest to układ '73oczewek skupiający wiązkę promieni świetlnych wysyłanych ze źródła światła w celu optymalnego oświetlenia pola widzenia w preparacie. Apertura numeryczna kondensatora powinna być zgodna z aperturą obiektywu. Kondensator można przesuwać pionowo za pomocą odrębnego pokrętła, co umożliwia dodatkową regulację jaskrawości oświetlonego pola widzenia

• obiektyw – jeden z dwóch (oprócz okularu) elementów tworzenia obrazu powiększonego. Jest to układ soczewek dobranych w ten sposób, aby zniwelować wady optyczne soczewki. Obiektywy można podzielić na tzw. obiektywy suche (małych i średnich powiększeń) oraz obiektywy immersyjne (dużych powiększeń). Przy używaniu tych ostatnich należy wypełnić przestrzeń pomiędzy preparatem a soczewką czołową obiektywu olejkiem immersyjnym, którego współczynnik załamania światła jest taki sam jak współczynnik szkła. Unika się w ten sposób ugięcia (dyfrakcji) promieni świetlnych na granicy szkła i powietrza, które przy dużych powiększeniach niekorzystnie wpływa na jakość obrazu.

Na obudowie każdego obiektywu znajdują się podstawowe dane dotyczące jego charakterystyki: powiększenie oraz apertura numeryczna. Najczęściej stosowane powiększenia obiektywów to: 5, 10, 20, 40 x (suche), 60 i 90-100 x (immersyjne)

5

• pośrednie układy optyczne - pomiędzy obiektywem a okularem znajdują się zazwyczaj tzw. pośrednie układy optyczne, zależne od typu i konstrukcji mikroskopu. Najczęściej spotykamy zwierciadła załamujące promienie świetlne pod określonym kątem, zgodnym z kątem załamania tubusa

• okular - jest to układ soczewek działający na zasadzie lupy, za pomocą którego oglądany jest obraz mikroskopowy. Powiększenie okularu (5 – 15 x) oznaczone jest na jego obudowie. specjalna odmianę stanowią okulary zapewniające szczególnie duże pole widzenia. W mikroskopach badawczych używa się mikroskopu podwójnego (binokularu) o regulowanym rozstawie, który umożliwia wygodniejsze i mniej meczące wzrok obuoczne oglądanie obrazu.

Elementy składowe mikroskopu przedstawia rysunek. Budowa mikroskopu: 1. Okular; 2. Rewolwer; 3. Obiektyw; 4. Śruba makrometryczna; 5. Śruba mikrometryczna; 6. Stolik; 7. Źródło światła; 8. Kondensor; 9. Statyw

6

Przeprowadzając obserwacje drobnoustrojów należy zwrócić uwagę na wielkość i kształt oraz układ komórek (pojedyńczy, podwójny, poczwórny, w łańcuszkach, w gronach, w skupiskach itp.). Rysując komórki możliwie dokładnie tej samej wielkości co w obrazie mikroskopowym – możemy zmierzyć długość i szerokość komórki [mm]. Będzie to wymiar pozorny, który należy przeliczyć dla otrzymania w przybliżeniu wielkości rzeczywistej [μm]. Wymiar rzeczywisty ustalamy na podstawie wzoru: wymiar rzeczywisty [µm] = wymiar pozorny [mm] x 1000 /powiększenie mikroskopu

Temat ćwiczenia

IDENTYFIKACJA MIKROFLORY I MIKROFAUNY WÓD SŁODKICH

Wprowadzenie

cytoplazma. U pierwotniaków wyróżnia się wyspecjalizowane organelle ruchowe:

1. 1. wić, rzęska – identyczne twory pod względem konstrukcji, jednak różniące się ilością, wielkością oraz tym, iż rzęski połączone są włókienkami pod warstwą błony komórkowej – co pozwala na skoordynowanie ruchów.

   2. nibynóżki – wykształcone u niektórych zarodziowców, ich działanie polega na przelewaniu cytoplazmy do różnych rejonów komórki, a co za tym idzie tworzenie "wypukleń" – co pozwala na przemieszczanie się ruchem ameboidalnym oraz na "oblewanie" ciała potencjalnej ofiary.

Temat ćwiczenia

WARUNKI PRACY Z MATERIAŁEM BIOLOGICZNYM

Wprowadzenie

Sterylizacja w znaczeniu mikrobiologicznym jest to proces zabicia drobnoustrojów w każdej formie, a więc zarówno form wegetatywnych jak i przetrwalnikujących. Podstawowym warunkiem pracy z mikroorganizmami jest stosowanie wyjałowionego sprzętu, pożywek i prowadzenie wszelkich operacji w warunkach sterylnych.

Metody sterylizacji

1.  metody fizyczne

    metody mechaniczne

    metody chemiczne

Metody fizyczne obejmują: sterylizację cieplną (suchą i z parą wodną), sterylizację promieniami ultrafioletowymi, promieniami jonizującymi, sterylizację ultradźwiękowymi.

sterylizacja cieplna sucha

- wyjaławianie przez wyżarzanie

- wyjaławianie przez opalanie

- wyjaławianie za pomocą suchego, gorącego powietrza

- wyjaławianie przez gotowanie

- wyjaławianie w autoklawie

- pasteryzacja

3

- sterylizacja ciągła

APARATY DO STERYLIZACJI

Autoklaw jest aparatem służącym do sterylizacji pożywek. W aparacie zagotowuje się wodę i doprowadza do nadciśnienia pary wodnej. Autoklaw ma budowę kotła o podwójnych ściankach i podwójnym dnie, zaopatrzony jest w manometr, termometr, wentyl bezpieczeństwa oraz przewody elektryczne lub gazowe. W górnej części znajduje się gruba pokrywa, którą uszczelnia się za pomocą śrub. Wodę wprowadza się do określonej wysokości i ogrzewa. Dla uzyskania nasyconej pary wodnej, co następuje po zupełnym wyparciu powietrza pozostawia się otwarty zawór, który się zamyka po ujściu powietrza. Od tej chwili manometr wskazuje podnoszenie się ciśnienia i po uzyskaniu wymaganego stopnia utrzymuje się go na stałym poziomie. Pożywki sterylizuje się przeważnie pod ciśnieniem ok. 1,5 lub 1 atm w ciągu 20-30 minut. Czas sterylizacji zależy od objętości płynów w kolbach lub innych naczyniach. Im mniejsza jest objętość pożywki tym krótszy może być czas sterylizacji.

W autoklawie sterylizuje się pożywki, których składniki nie ulegają rozkładowi pod wpływem wysokiej temperatury. Temperatura w autoklawie jest zależna od nadciśnienia pary wodnej.

Zależność między temperaturą a ciśnieniem pary wodnej (wg R.Molliera)

Aparat Kocha jest pod względem budowy w zasadzie podobny do autoklawu z tą różnicą, że jest ona znacznie prostsza. Służy on do sterylizacji pożywek w temperaturach do 100 0C, w parze bieżącej. Para wodna krąży w aparacie, przy czym część jej zostaje odprowadzona na zewnątrz.

Sterylizację w bieżącej parze wodnej stosuje się wówczas, gdy zachodzi potrzeba ochrony składników pożywki przed rozkładem w wyniku działania temperatury przekraczającej 100 0C. Czas przetrzymywania pożywek w aparacie Kocha wynosi zwykle 15-30 minut.

Aparat Kocha znalazł zastosowanie do niszczenia form wegetatywnych w płynnych środkach spożywczych (mleko, soki). W tym celu stosuje się pasteryzację. Pasteryzacją nazywamy jednorazowe podgrzanie płynu do temperatury w granicach 60 – 80 0C, z wyłączeniem grzejnika po osiągnięciu żądanej temperatury.

Celem wyeliminowania z pożywek form wegetatywnych i przetrwalników drobnoustrojów, należy zastosować pasteryzację frakcjonowaną zwaną tyndalizacją. Tyndalizacja pożywek polega na trzykrotnym przeprowadzeniu pasteryzacji w aparacie Kocha w odstępach 24-godzinnych.

Temat ćwiczenia

MIKROBIOLOGICZNA KONTROLA POWIETRZA

Wyróżnia się dwie grupy pobierania prób oparte na:

• osiadaniu zawiesin drobnoustrojów

• filtracji powietrza przez filtry

Osiadanie zawiesin drobnoustrojów może być wywołane: - wpływem sił grawitacji (metoda sedymentacyjna Kocha) - wpływem energii kinetycznej nadanej powietrzu (metoda zderzeniowa) - wpływem sił elektrostatycznych (elektroprecypitacja) - działaniem rozpylonych par lub cieczy (metoda syfonizacji) Filtrowanie powietrza przez filtry dzieli się w zależności od rodzaju użytego filtra: - filtrowanie powietrza przez filtry nierozpuszczalne (jałowy piasek, mielone szkło, węgiel, wata, błony koloidalne), - filtrowanie powietrza przez filtry rozpuszczalne (cukier, siarczan VI sodu), - filtrowanie powietrza przez ciecze (bulion, fizjologiczny roztwór chlorku sodu) w odpowiednich warunkach Metoda sedymentacyjna Kocha Najczęściej stosowaną metodą badania stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza jest metoda sedymentacyjna Kocha oparta na swobodnym osiadaniu pyłków i kropelek niosących mikroorganizmy, pod wpływem sił grawitacji. Płytki Petriego z jałowym podłożem stałym otwiera się, a następnie zamyka po określonym czasie ekspozycji, zależnym od przewidywanego zanieczyszczenia powietrza (5, 15, 30minut). Płytki inkubuje się w odpowiednich warunkach czasu i temperatury, a następnie liczy się wyrosłe kolonie. Wynik ostateczny, tj. ilość drobnoustrojów odnoszony do 1 m3, oblicza się, bazując na założeniu, że w czasie 5 minut na płytce o powierzchni 100 cm3 osiada tyle drobnoustrojów, ile znajduje się w 10 dm3 (0,01 m3) powietrza

3

traA⋅⋅⋅=24105π gdzie: A – ilość drobnoustrojów w 1 m3, a – średnia liczba drobnoustrojów na płytce, 2rπ - powierzchnia płytki Petriego [cm2], t - czas ekspozycji [min], 5 - współczynnik przeliczeniowy czasu ekspozycji płytek. Zaletą tej metody jest jej łatwość wykonania w krótkim czasie. Wadą to, że liczba mikroorganizmów osiadłych i wyrosłych na płytkach Petriego jest uzależniona od ruchu powietrza oraz fazy bakteryjnego aerozolu. Faza gruboziarnista opada szybciej, faza drobnoziarnista wolniej, jądra kropelkowe i faza pyłu bakteryjnego jeszcze wolniej. Metoda zderzeniowa W tych metodach rozróżniamy dwa sposoby przepuszczania powietrza tzn. wirowanie powietrza wciąganego przez przyrząd lub zderzenie strumienia zassanego powietrza z pożywką Metoda pierwsza zwana metodą wirowania polega na przepuszczeniu powietrza przez wirujący z dużą szybkością cylinder z pożywką. Powietrze zostaje wprawione w ruch obrotowy, a siłą odśrodkową drobnoustroje odrzucane są na ścianki cylindra i zatrzymywane są w pożywce, następnie cylinder z drobnoustrojami na pożywce termostatuje się. Metoda druga polega na uderzeniu zassanym powietrzem w warstwę pożywki. Powietrze jest zassane przez aparat, przechodzi przez otworki w głowicy, pod którą umieszcza się płytkę z pożywką. Następnie płytkę z pożywką inkubuje się w termostacie. Metody tego typu mają coraz szersze zastosowanie ze względu na szybkość i prostotę wykonania analiz oraz możliwość zbadania ściśle określonej ilości powietrza.

4

Po okresie inkubacji oblicza się liczbę kolonii wyrosłych na płytkach, a następnie ilość drobnoustrojów w 1 m3 powietrza według wzoru: tVaA⋅⋅=1000 gdzie: A – ilość drobnoustrojów w 1 m3 powietrza a – średnia liczba kolonii przypadająca na płytkę Petriego V – ilość przepuszczonego powietrza przez aparat w ciągu 1 minuty t – czas pobierania próby powietrza w minutach Metoda elektroprecypitacji Zasada metody elektroprecypitacji polega na zastosowaniu siły elektrostatycznej przy oznaczaniu liczby mikroorganizmów występujących w powietrzu. Metodę tę oparto na fakcie, że wszystkie cząstki, w tym także drobnoustroje posiadają pewien ładunek elektryczny. W aparatach do analiz zwanych precypitatorami, płytki Petriego z pożywką stałą podłączone są do źródła prądu o określonym napięciu, pełniąc tym samym rolę elektrod przyciągających cząstki (drobnoustroje) naładowane przeciwnie. Metoda syfonizacji Metoda syfonizacji jest pewnego rodzaju modyfikacją sposobów filtracyjnych. Powietrze zassane za pomocą pompy rozpyla płyn znajdujący się w zbiorniczku tzw. syfonizacyjnym i w ten sposób następuje wychwycenie przez płyn pyłu i mikroorganizmów znajdujących się w badanym powietrzu. Następnie powietrze i część płynu przedostaje się do zbiorniczka, gdzie ulega filtracji. Pobrane próby płynu ze zbiorniczka syfonizacyjnego i adsorbującego miesza się i posiewa na odpowiednie pożywki stałe.

5

Metoda filtracji Metoda filtracji polega na przepuszczeniu określonej objętości powietrza przez określone jałowe filtry. Po przefiltrowaniu powietrza, wypłukuje się zatrzymane drobnoustroje ze stałego materiału filtracyjnego znaną objętością cieczy, które następnie posiewa się na pożywki stałe. Filtrowanie jest dobrą metodą do określania obecności konidiów pleśni i przetrwalników bakteryjnych. Płytki inkubuje się w określonej temperaturze, a następnie oblicza się ilość drobnoustrojów ze wzoru: VbaA1000⋅⋅= gdzie: A - ilość drobnoustrojów w 1 m3 a – przeciętna liczba drobnoustrojów na płytce Petriego b – ilość płynu absorbującego w cm3 V – ilość przepuszczonego przez płyn absorpcyjny powietrza w dm3

Temat ćwiczenia

OZNACZANIE TOKSYCZNOŚCI ŚCIEKÓW

Wprowadzenie

W badaniach toksykologicznych organizmami testowymi mogą być: bakterie, rośliny, zwierzęta lub ich zespoły. Ze względu na to, że obecnie metodyka badań toksyczności nie jest dostatecznie ujednolicona, w różnych krajach przyjmowane są odmienne kryteria oceny działania trucizn na organizmy, szczególnie odnośnie określenia ich dawek i sposobu obliczania. W Niemczech, zgodnie ze stosowaną metodyką badań toksykologicznych, w zakresie toksyczności ostrej- wyróżnia się:

1. - dawkę graniczną – najwyższe stężenie trucizny, które jeszcze nie oddziaływuje szkodliwie na organizmy

   - dawkę progową – najniższe stężenie trucizny, które wywołuje pierwsze spostrzegalne zmiany w organizmach

   - dawki śmiertelne – stężenia trucizny, które powodują śmierć 50- lub 100% organizmów (LC50, LC100).

W Stanach Zjednoczonych do oceny toksyczności ostrej przyjęto dawkę określaną jako średnia granica tolerancji (TLm), tj. stężenie trucizny, w której przeżywa 50% organizmów po 96 godz. trwania testu. Odpowiada to dawce LD50 organizmów. Ponadto, wprowadzono pojęcie współczynnika stosowalności, tj. ilorazu najwyższego stężenia trucizny (które nie wywołuje spostrzegalnych zmian w organizmach testowych) i dawki TLm. Stężenie bezpieczne badanego związku (SC) wylicza się dzieląc wartość współczynnika stosowalności przez 10. W Polsce, zgodnie z metodyką opracowaną w normach dotyczących oznaczenia toksyczności ostrej na rozwielitce dużej (Daphnia magna) PN-72 C-4610 oraz gupiku (Lebistes reticulatus) PN-72 C-04610, wyróżnia się stężenie C50, dla zdefiniowanych substancji chemicznych lub ich mieszanin oraz R50 dla nieokreślonych mieszanin zanieczyszczeń. Dawka C50 lub R50 odpowiada dawce LC50. Najczęściej, jako kryterium oceny toksyczności działania trucizn na organizmy przyjmuje się wartość C50, LC50 lub LD50, a także DL50, które są synonimami dawki śmiertelnej dla 50% osobników. Wartość tej dawki w zależności od czasu trwania badań można obliczyć za pomocą różnych metod, zarówno w oparciu o określone wzory statystyczne jak i graficzne. Dla określonych zakresów stężeń badanej substancji, Liebmann zaproponował następującą ocenę stopnia jej toksyczności:

3

Stężenie substancji, mg/dm3 Stopień toksyczności < 1 wysoko toksyczna 1 - 10 mocno toksyczna 10 - 100 średnio toksyczna 100 - 1000 słabo toksyczna > 1000 zaledwie toksyczna Analiza testowa z zastosowaniem bakterii służy do oceny przebiegu biochemicznych procesów samooczyszczania wód oraz oczyszczania ścieków w obecności substancji toksycznych. Badania powyższe polegają na określeniu wpływu ścieków przemysłowych lub ich składników na intensywność rozwoju bakterii oraz zachodzących procesów biochemicznych, ze szczególnym uwzględnieniem zdolności mikroorganizmów do wykorzystywania różnych źródeł węgla i azotu. W analityce testowej trucizn przy zastosowaniu bakterii jako kryterium szkodliwego działania substancji przyjmuje się hamowanie wzrostu mikroorganizmów. Obserwacje stopnia zahamowania wzrostu bakterii w zależności od czasu ich kontaktu z trucizną można przeprowadzić m.in. za pomocą metody płytkowej Kocha oznaczając ogólną liczbę bakterii lub w podłożu płynnym określając ich wzrost na podstawie zmian makroskopowych. Intensywność działania substancji toksycznych można określić m.in. badając zdolność do wykorzystywania łatwo rozkładalnego źródła węgla przez wybrany szczep bakterii w obecności związków toksycznych. Jako kryterium oceny działania trucizn przyjmuje się zmiany ilościowe mikroorganizmów i stopień zahamowania przemian biochemicznych podczas procesu rozkładu.

KONTROLA CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ WODY PITNEJ

Wprowadzenie

Woda przystosowana do picia i potrzeb gospodarczych ludności powinna odpowiadać podstawowym wymaganiom sanitarno-epidemiologicznym:

1.  powinna być klarowna, bezbarwna, bezwonna i orzeźwiająca w smaku

    nie powinna zawierać składników trujących, ani też nadmiernych ilości związków żelaza, manganu, wapnia i magnezu

    nie powinna zawierać bakterii chorobotwórczych, pasożytów zwierzęcych oraz ich jaj i larw

Pożądane jest poza tym, aby woda miała niską temperaturę 7 – 12 oC i zawierała odpowiednie ilości składników potrzebnych dla organizmu ludzkiego, jak jod i fluor. Woda w miejscu jej poboru do bezpośredniego użytku przez konsumentów nie może zawierać składników lub domieszek szkodliwych dla zdrowia, wywierających ujemny

2

wpływ na smak, zapach lub wygląd, bądź wykazywać cech wskazujących na zanieczyszczenia. Woda przeznaczona do spożycia ze wszystkich ujęć i wodociągów musi spełniać wymagania sanitarne, regulowane przepisami państwowymi (Rozporządzenie Ministra Zdrowia), które znajdują się w Dzienniku Ustaw. Badania rutynowe wykonywane w laboratoriach skupiają się na wykrywaniu bakterii w badanych próbkach wody, które wskazują na kałowe zanieczyszczenie wody. Bakterie służące za wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody spełniają następujące wymogi:

1.  stale występują w kale ludzi i zwierząt ciepłokrwistych,

    ich liczba przekracza liczbę drobnoustrojów chorobotwórczych,

    nie mogą występować w wodzie nie zanieczyszczonej,

    nie mogą namnażać się w środowisku wodnym,

    w wodzie powinny przeżywać dłużej aniżeli drobnoustroje chorobotwórcze,

    nie powinny zmieniać swoich cech fizjologicznych i biochemicznych pod wpływem środowiska zewnętrznego

    ich wrażliwość na środki dezynfekujące stosowane do dezynfekcji wody powinna być zbliżona do wrażliwości organizmów patogennych

    metody ich wykrywania powinny być proste i szybkie.

Wskaźniki zanieczyszczenia wody są:

1.  bakterie grupy coli – szczepy Escherichia coli, drobnoustroje rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella

    bakterie grupy coli typu fekalnego – szczepy Escherichia coli, nieliczne drobnoustroje rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella

    paciorkowce kałowe - Enterococcus i Streptococcus faecalis

    laseczki redukujące siarczany z rodzaju Clostridium, - dotyczy badania wód powierzchniowych

Wskaźnikiem zanieczyszczenia wody powinien być jeden drobnoustrój, który wskazywałby na obecność lub brak w wodzie nie tylko jelitowych bakterii chorobotwórczych, lecz wszystkich organizmów chorobotwórczych łącznie z

3

wirusami i pasożytami zwierzęcymi. Niestety, żaden z poznanych organizmów wskaźnikowych stanu sanitarnego wody nie spełnia wymagań. Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu kałowego dowodzi o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody: kałem, ściekami, glebą lub gnijącym materiałem roślinnym. Wykrycie w badanej próbce wody paciorkowców kałowych potwierdza występowanie w tej wodzie świeżych zanieczyszczeń kałem zwierzęcym, ludzkim lub ściekami z ferm hodowlanych. O starym odległym w czasie skażeniu kałowym wody świadczy występowanie w badanej próbce wody bakterii (Clostridium) redukujących siarczyny. Są one dobrym wskaźnikiem prawidłowości w przeprowadzanych procesach uzdatniania wody: koagulacji, sedymentacji i filtracji. Powinny być one wyeliminowane już na tym etapie badania wody, gdyż są odporne na późniejszą dezynfekcję. Sanitarna analiza bakteriologiczna wody polega na: - oznaczeniu ogólnej liczby bakterii (psychro- i mezofilnych) w 1 ml wody - wykrywaniu bakterii grupy coli Bakterie grupy coli są gramujemnymi pałeczkami, zdolnymi do wzrostu w warunkach tlenowych i beztlenowych. W temperaturze 37 oC w czasie 48 godzin fermentują laktozę tworząc kwasy i gazy. Cechy te zostały wykorzystane w badaniach rutynowych. Bakterie grupy coli typu kałowego wykazują te same właściwości biochemiczne i fermentacyjne podczas inkubacji w temperaturze 44 oC.

Do oceny jakości bakteriologicznej wody do picia konieczne jest wykonanie badań w kierunku ogólnej liczby bakterii oraz bakterii grupy coli.

4

Metody badania bakterii grupy coli będących najlepszym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego wody to: - metoda fermentacyjna probówkowa FP - metoda filtrów membranowych FM METODA FERMENTACYJNA - PROBÓWKOWA FP Do opracowania metody fermentacyjnej - probówkowej wykorzystano właściwości bakterii grupy coli, które fermentują laktozę i wytwarzają w podłożu kwas i widoczny gaz w ciągu 48 godzin hodowania. Metodą probówkową oznacza się bakterie grupy coli i paciorkowce kałowe we wszystkich rodzajach wód i ścieków, a szczególnie w wodach mętnych o małej liczbie oznaczanych bakterii oraz w ściekach chlorowanych. Metoda ta polega na posiewie określonej objętości badanej wody do płynnej pożywki zawierającej laktozę, pepton, purpurę bromokrezolową jako wskaźnik pH oraz chlorek sodu, który ogranicza rozwój niektórych bakterii gramdodatnich i obserwacji zachodzących zmian po 24 i 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37 oC. Obecność bakterii grupy coli w pożywce stwierdza się na podstawie obecności gazu w rurce Durham oraz zmiany barwy z fioletowej na żółtą (zakwaszenie środowiska). Wynik badania wody metodą fermentacyjną podaje się w postaci miana coli i najbardziej prawdopodobnej liczny drobnoustrojów (NPL) bakterii grupy coli w 100 cm3 próbki, odczytanej z odpowiednich tablic. W celu sprawdzenia obecności bakterii grupy coli typu kałowego inkubuje się próby w 44 oC. Metoda FP obejmuje 4 etapy: - badanie wstępne - na podstawie wytworzonego gazu w ciągu 24 lub 48 godzin inkubacji w temp. 37°C stwierdza się obecność bakterii coli - badanie potwierdzające - wykonywane są w przypadku dodatniego lub wątpliwego wyniku badania wstępnego, ma ono na celu stwierdzenie czy bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym na pewno należą do grupy coli - badanie uzupełniające - na jego podstawie stwierdza się obecność bakterii coli w przypadku wątpliwego wyniku badania potwierdzającego

- badanie ostateczne - polegają na ustaleniu czy bakterie nie wykazujące zdolności gazotwórczej (fermentacji laktozy) należą do grupy coli.

5

METODA FILTRÓW MEMBRANOWYCH FM Wykorzystuje się ją w celu oznaczania paciorkowców kałowych oraz beztlenowych bakterii przetrwalnikujących i redukujących siarczyny we wszystkich rodzajach wód (wyjątek stanowią wody zawierające dużo zawiesiny). Metoda FM jest stosowana także do oznaczania paciorkowców kałowych w ściekach. Metody tej nie można stosować do wykrywania paciorkowców w ściekach chlorowanych. Zasada metody FM: Określona ilość próbki bakterii jest przesączana przez filtr membranowy (uprzednio jednak wegetatywne bakterie są niszczone metodą termiczną). Bakterie zatrzymują się na filtrze, który zostaje umieszczony na pożywce agarowej, gdzie bakterie rozwijają się i tworzą kolonie widoczne gołym okiem możliwe do policzenia. Filtr jest inkubowany przez 24 h w temperaturze 35°C lub 37°C w celu wykrycia bakterii grupy coli lub w temperaturze 44°C w celu wykrycia termotolerancyjnych bakterii grupy coli. (Kolor koloni bakterii grupy coli zależy od zastosowanego podłoża). Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące i redukujące siarczyny tworzą kolonie zabarwione na czarno - konieczny aparat do wytwarzania warunków beztlenowych. Natomiast paciorkowce kałowe występujące w badanej próbce zabarwiają się na czerwono i różowo.

Tokysczność wynika z:

• oddziaływania toksyny z receptorami komórkowymi;

• przerwania funkcji membrany komórkowej;

• reakcji chemicznych z elementami składowymi komórki;

• hamowania/współzawodnictwa systemów enzymatycznych komórki.

Toksyczność

Do efektów toksykologicznych zaliczane są:

• toksyczność;

• mutagenność;

• rakotwórczość;