Nukleotydy, estry nukleozydów i kwasu fosforowego. Typowym miejscem estryfikacji jest grupa hydroksylowa przy atomie węgla C-5 pentozy, tj. ugrupowanie HO-CH₂- występujące zarówno w rybozie rybozie, jak i w uboższej od niej o jeden atom tlenu deoksyrybozie (inaczej dezoksyrybozie).

Produkty estryfikacji nazywa się 5'-fosforanami danego nukleozydu (nukleozydo-5'-fosforanami), np. adenozyno-5'-fosforan (czyli kwas adenylowy, inaczej adenozynomonofosforan, skrót AMP).

Połączenie adenozyny z grupą dwufosforanową prowadzi do adenozyno-5'-dwufosforanu (skrót ADP), przyłączenie zaś grupy trójfosforanowej daje adenozyno-5'-trójfosforan

1. DWUNICIOWA BUDOWA HELISY DNA wg Watsona i Cricka 1953r

1)Dwa helikalne łańcuchy polinukleotydowe zwijają się dookoła wspólnej osi. Łańcuchy są antyrównoległe – biegną w przeciwnych kierunkach.

2) Zasady purynowe i pirymidynowe znajdują się wewnątrz, a fosforany i dezoksyrybozy na zewnątrz helisy. Płaszczyzny zasad są prostopadłe do osi helisy, a płaszczyzny pierścieni cukrów są prawie prostopadle ułożone względem zasad

3) Średnica helisy wynosi 2.0 nm.Odległość miedzy sąsiednimi zasadami mierzona wzdłuż osi wynosi 0.34 nm. Zasady są skręcone względem siebie pod kątem 36º. Na całkowity skręt spirali przypada po 10 nukleotydów w każdym łańcuchu, co daje okres powtarzalności 3,4 nm.

4) Dwa łańcuchy łącza się między sobą wiązaniami wodorowymi między parami zasad (A/T, G/C)

5) Kolejność zasad w łańcuchu polinukleotydowym nie jest w żaden sposób ograniczona. Ściśle określona sekwencja zasad niesie informacja genetyczną.

1. ALTERNATYWNE STRUKTURY PODWÓJNEJ HELISY DNA

Model zaproponowany przez Watsona i Cricka znany jest jako helisa B-DNA.

Na powierzchni helisy B-DNA występuje duży rowek o średnicy 2,2 nm i mały rowek o średnicy 1,2 nm. W warunkach fizjologicznych lizba par zasad wynosząca 10,4 na skręt helisy uznana została za charakterystyczną dla formy B-DNA.

Forma A-DNA jest dwuniciową prawoskrętną helisą, która staje się szersza i krótsza niż helisa B-DNA. Na całkowity skręt helisy A przypada 11 par zasad. Duży rowek jest głęboki i wąski. Mniejszy rowek ulega prawie całkowitemu zanikowi.Ma kształt bardzo szeroki i płytki.

Forma Z-DNA jest lewoskrętna, ma więcej par zasad przypadających na jeden skręt, staje się długa i wąska. Strukturę nazwano Z ze względu na szkielet cukrowo-fosforanowy, który kształtem przypomina literę Z. Nie stwierdzono występowania formy Z in vivo.

1. WŁAŚCIWOŚCI DNA wg Chargraffa(1950r)

1. Stosunki ilościowe adeniny do tyminy i guaniny do cytozyny sa bliskie 1.0 dla wszystkich badanych cząsteczek DNA. Ilość reszt purynowych równa jest ilości reszt pirymidynowych.

2. Stosunek A/T i G/C jest typowy i stały dla DNA danego organizmu.

3. Jeżeli DNA zawiera większy procent par A/T to organizm jest bardziej wrażliwy na działanie promieni UV

4. Promieniowanie jonizujące wywiera efekt na DNA bogate w pary G/C

5. Zasób informacji zakodowany w DNA jest największy przy 41% par G/C. Zwiększenie i zmniejszenie procentowe zawartości tych par obniża możliwość kodowania przez DNA informacji.

1. GENY.

Gen, podstawowa jednostka dziedziczenia, zlokalizowana w chromosomach, decydująca o przekazywaniu cech potomstwu.

Gen jest odcinkiem łańcucha DNA, zawierającym pewną liczbę nukleotydów, których sekwencja stanowi informację genetyczną, warunkującą syntezę określonych białek (biosynteza białka) lub cząstek kwasu RNA, co w dalszej konsekwencji w toku skomplikowanych ciągów reakcji prowadzi do wykształcenia się określonej cechy organizmu. Geny występują także u bakterii i wirusów nie posiadających chromosomów.

W zależności od efektów działania, np. wpływu na wykształcenie się cech morfologicznych organizmu, wyróżnia się różne kategorie genów, np.:

1) geny dominujące i recesywne,

2) geny plejotropowe - wpływające na wykształcenie kilku różnych cech,

3) geny kumulatywne (poligeny, polimeryczne) - których działanie sumuje się z działaniem innych genów,

4) geny dopełniające - współdziałające z innym genem w wykształceniu danej cechy,

5) subletalne - obniżające żywotność organizmu lub letalne - prowadzące do jego śmierci (np. gen powodujący wystąpienie braku krzepliwości krwi u zwierząt lub gen uniemożliwiający wytwarzanie chlorofilu u roślin),

Ze względu na mechanizm działania wyróżniamy:

1) strukturalne - zawierają informację dotyczącą biosyntezy białka,

2) regulatorowe (regulatory) - regulują aktywność genów strukturalnych.

Zespół genów we wszystkich chromosomach danego organizmu określa się jako genotyp.

U Prokariota geny zawierają ciągłą sekwencję nukleotydów w DNA, natomiast u Eukariota geny niosące informację genetyczną (egzony) są przedzielone intronami. Tak więc informacja u Eukariota jest nieciągła i w procesie biosyntezy białka introny muszą zostać usunięte, a powstałe w ten sposób fragmenty DNA połączone w całość.

Termin gen wprowadził W.L. Johansen.

Poziomy organizacji chromatyny

1. podwójna helisa DNA

2. nić DNA nawinięta na histony tworzy nukleosomy

3. włókno chromatynowe (włókno 10 nm) - zbudowane z upakowanych nukleosomów

4. soleniod (włókno 30 nm) - spiralnie skręcone włókno 10 nm

5. splątane domeny (pętle)

6. chromatyna skondensowana (chromosom)

Chromosomy politeniczne, olbrzymie powstają na drodze endoreplikacji. spotykane w jądrach komórek gruczołów ślinowych Drosophila melanogaster.

Chromosomy szczoteczkowe można zaobserwować w profazie mejozy w oocytach ryb, płazów, gadów i ptaków.

1. REPLIKACJA

Replikacja polega na rozwinięciu helisy DNA na krótkim odcinku i syntezie na matrycy obu nici, nici komplementarnych.

Jest to proces semikonserwatywny (półzachowawczy) co oznacza, że powstała cząsteczka zawiera jedną nić matczyną, a drugą potomną.

Powstają dwie identyczne dwuniciowe kopie pierwotnej cząsteczki wyjściowej DNA.

Przebieg replikacji u Prokaryota

• INICJACJA – rozpoczyna się w miejscu origin (ori) gdzie syntetyzowany jest odcinek RNA - starter o długości około 10 do 60 nukleotydów

• ELONGACJA – na nici o polarności 3` do 5` nowo syntetyzowany łańcuch może wydłużać się w sposób ciągły, a na nici o przeciwnej polarności w postaci fragmentów Okazaki (około 1000 – 2000 nukleotydów)

• TERMINACJA – replikacja kończy się po przejściu widełek replikacyjnych wzdłuż całej kolistej cząsteczki chromosomu przy udziale sekwencji terminacyjnych Ter E, D, A, C, B i F

J. Carins w roku 1963 stosując technikę autoradiografii jako pierwszy zaobserwował i opisał replikację DNA u E. coli .

Przebieg replikacji u Eukaryota

• INICJACJA - rozpoczyna się w w kilku miejscach chromosomu jednocześnie (wiele miejsc ori), w każdym z nich syntetyzowany jest odcinek RNA tzw. starter o długości około 10 nukleotydów

• ELONGACJA – synteza DNA przy udziale polimerazy zachodzi na obu niciach w sposób nieciągły ( ze względu na wiele miejsc inicjacji)

• TERMINACJA – zakończenie replikacji ma miejsce w momencie fizycznego zetknięcia się widełek podążających ku sobie z przeciwnych kierunków

Enzymy replikacji:

• Helikazy – rozdzielają nić DNA, rozcinają wiązania wodorowe

• Białka SSB – zapobiegają zwijaniu się pojedynczych nici DNA

• Topoizomerazy – rozluźniają superskręty w cząsteczce DNA, przecinają wiązania fosfodiestrowe w łańcuchu polinukleotydowym

• Ligazy – łączą fragmenty DNA (fragmenty Okazaki, fragmenty po wycięciu starterów)

• Polimerazy – przeprowadzają syntezę DNA

Bakteryjne polimerazy DNA

Polimeraza DNA 1 Polimeraza DNA II Polimeraza DNA III

Eukariotyczne polimerazy DNA

Polimerazy α Polimerazy β Polimerazy γ Polimerazy δ Polimerazy ε

DNA a RNA

• W RNA zamiast dezoksyrybozy występuje ryboza (posiadająca dodatkowy atom tlenu przy drugim atomie węgla)

• W RNA zamiast tyminy występuje uracyl (tworzy komplementarna parę z adeniną)

• RNA jest cząsteczką jednoniciową

• W RNA mogą występować zmodyfikowane zasady (np. dihydrourydyna, inozyna itp.)

KWAS RYBONUKLEINOWY (RNA)

• mRNA - matrycowy (informacyjny) RNA

• tRNA – transportujący RNA

• rRNA – rybosomalny RNA

• snRNA – mały jądrowy RNA

• hnRNA – heterogenny RNA

1. EKSPRESJA GENÓW U PRO- I EUKARYOTA.ZNACZENIE KWASÓW NUKLEINOWYCH W MEDYCYNIE.

Ekspresja genów - wytwarzanie produktu genu w postaci białka zakodowanego w określonej sekwencji nukleotydów.

Transkrypcja - przepisywanie informacji genetycznej z DNA na mRNA

Translacja - tłumaczenie informacji genetycznej z mRNA na białko

KOD GENETYCZNY

Kod genetyczny - współzależność między sekwencją zasad w DNA (lub mRNA stanowiącym jego transkrypt), a sekwencją aminokwasów w białku.

Cechy kodu genetycznego:

1. Trójkowy - jeden aminokwas koduje grupa trzech zasad (kodon)

2. Niezachodzący –nukleotyd wchodzący w skład danego kodonu, nie zachodzi na kolejną trójkę. Każdy z nukleotydów wchodzi w skład tylko jednego kodonu

3. Bezprzecinkowy - sekwencja zasad jest odczytywana kolejno od określonego punktu startowego

4. Uniwersalny – taki sam in vivo i in vitro i dla wszystkich żywych organizmów

5.Zdegenerowany (wieloznaczny) – większość aminokwasów kodowana jest przez więcej niż jeden triplet

Kodony określające ten sam aminokwas nazywamy synonimami. Większość synonimów różni się tylko trzecią zasadą tripletu. 61 kodonów określa aminokwasy, 3 nie kodują aminokwasów, lecz są rozpoznawane jako miejsca zakończenia syntezy łańcucha polipeptydowego.

Są to:

UAG - amber (N-1 rozpoznawany przez czynnik RF-1

UAA - ochre (N-2) rozpoznawany przez RF-1 i RF-2

UGA – opal (N-3) rozpoznawany przez RF-2

W mitochondriach niektórych organizmów UGA koduje tryptofan

Do przeprowadzenia transkrypcji konieczne są:

1. Matryca - dwuniciowy lub jednoniciowy DNA

2. Aktywowane prekursory: ATP, GTP, UTP, CTP

3. Dwuwartościowe jony metali Mg⁺² i Mn⁺²

4. Polimeraza RNA zależna od DNA

Cechy charakterystyczne transkrypcji

• Transkrypcja przebiega w kierunku 5^’ 3^’

• Polega na ataku grupy 3^’ OH rosnącego łańcucha na fosforan nadchodzącego trójfosforanu nukleozydu

• Polimeraza nie wymaga startera

• Synteza RNA na matrycy DNA jest konserwatywna

• Polimerazy RNA nie maja właściwości nukleolitycznych

• Wszystkie rodzaje RNA są syntetyzowane przez jedną polimerazę u Prokaryota i trzy polimerazy u Eukaryota

• Nowo powstałe RNA jest komplementarne i antyrównoległe do DNA matrycowego

• Transkrypcja zachodzi tylko na jednej nici w określonym regionie genomu

Polimeraza RNA u Procaryota

• Podjednostka σ odszukuje miejsca promotorowe

• Podjednostka α wiąże białka regulatorowe

• Podjednostka β wiąże trifosforany rybonukleozydów

• Podjednostka ß^’ wiąże matrycę DNA

• Jednostka pomocnicza Rho uczestniczy w oddzieleniu polimerazy od DNA pod koniec procesu transkrypcji

ENZYMY TRANSKRYPCJI U EUKARYOTA

• Polimeraza RNA I - w jąderku, transkrypcja

rDNA (genów kodujących rRNA)

• Polimeraza RNA II - w nukleoplazmie, transkrypcja

mRNA (pre – mRNA), sn RNA

• Polimeraza RNA III – nukleoplazma, transkrypcja

pre-tRNA,5S rRNA, sn RNA

Transkrypcja średniej wielkości genu (około 1500 par zasad) przez 1 cząsteczkę polimerazy RNA trwa około 50 sek. Na tym samym odcinku DNA może jednak pracować równolegle 15 polimeraz przesuwających się jedna za drugą co umożliwia transkrypcję ponad tysiąca transkryptów z 1 genu w ciągu godziny

Miejsce terminacji jest ściśle określonym miejscem w DNA, gdzie kompleks polimeraza RNA – DNA - RNA ulega dysocjacji.

Sygnał terminacji niesiony przez DNA polega na pojawieniu się powtarzających się sekwencji palidromowych rozdzielonych zasadami wtrąconymi.

W 2 powtórzonych sekwencjach porządek zasad zostaje odwrócony. Cząsteczka RNA przybiera kształt „spinki do włosów„ na skutek transkrypcji tych sekwencji.

SPLICING

• składanie mRNA = wycinanie intronów i łączenie eksonów

Na końcach intronów znajdują się sekwencje dwunukleotydowe zwane sekwencjami zgodnymi (konsensusu) – GU przy końcu 5^’ i AG przy końcu 3^’, które umożliwiają precyzyjne wycinanie intronów z pre-mRNA. Sekwencja GU przy końcu 5^’odpowiada miejscu donorowemu, a sekwencja AG przy końcu 3^’ miejscu akceptorowemu. Miejsce rozgałęzienia zawiera A umiejscowioną 20 zasad powyżej terminalnego końca 3^’ i na tym poziomie zahacza się koniec 5^’ intronu tworząc lasso.

Modyfikacja postranskrypcyjna tRNA:

• przyłączanie sekwencji CCA do końca 3^’

• brak struktury „cap”

• wycinanie intronów

• modyfikacja zasad (pseudourydyna - Ψ, inozyna - I, dihydrourydyna - UH₂, rybotymidyna - T, metyloguanozyna - mG, metyloinozyna – Mi

Rybosomy charakteryzują się specyficznymi stałymi sedymentacji

• Prokaryota - podjednostki 30S i 50S - rybosom 70S

• Eukaryota - podjednostki 40S i 60S – rybosom 80S

Regulacja ekspresji genów

• Istnieje ścisłe powiązanie między aparatem genetycznym komórki a jej stanem czynnościowym

• Produkty kodowane przez różne geny są wytwarzane w ilościach określonych właściwościami strukturalnymi i funkcjonalnymi danej komórki

• Regulacja tego systemu odbywa się przez włączanie i wyłączanie odpowiednich genów

• Regulacja ekspresji genów dotyczy zarówno organizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych

• W pojedynczej komórce eukariotycznej tylko około 15% genów ulega ekspresji; przy czym w różnych typach komórek aktywowane są różne geny

Regulacja ekspresji genów u Prokaryota

U Prokaryota ekspresja genów

regulowana jest na dwóch poziomach:

• TRANSKRYPCJI – przez regulację liczby tworzonych cząsteczek mRNA

• TRANSLACJI – przez regulację liczby kopii polipeptydów powstałych na matrycy konkretnej cząsteczki mRNA

Regulacja przez kontrolę szybkości inicjacji transkrypcji

• REGULACJA WEWNĘTRZNA – dotyczy poziomu transkrypcji jednego genu względem innego w zależności od promotora; jest to inaczej stopień oddziaływania między polimerazą RNA a promotorem

• REGULACJA ZEWNĘTRZNA – poziom transkrypcji regulowany jest przez czynniki zewnętrzne, niezależne od struktury genu

Promotory u Prokaryota

• Geny zawierające promotory słabe, wykazują niski poziom ekspresji – są to głównie geny kodujące produkty potrzebne w niedużych ilościach

• Promotory silne indukują z większą częstością procesy inicjacji trankrypcji – nawet co 2 sekundy

Efektory allosteryczne

• Cząsteczki represorów są białkami allosteryczymi

• Efektory allosteryczne przyłączają się do centrum allosterycznego (inne niż centrum aktywne)

• Efektorami allosterycznymi mogą być aminokwasy, czy też hormony steroidowe

• Wiązania między białkami allosterycznymi i efektorami są słabe, a oddysocjowanie efektora zależy od jego stężenia

Rodzaje operonów bakteryjnych

• INDUKOWANE (KATABOLICZNE)- produkcja enzymów jeśli substrat obecny w środowisku

• ULEGAJĄCE REPRESJI (ANABOLICZNE)- produkcja enzymów jeśli substancja syntetyzowana nie istnieje w komórce

• PODLEGAJĄCE REGULACJI POZYTYWNEJ – transkrypcja w obecności induktora

• PODLEGAJĄCE REGULACJI NEGATYWNEJ – blokowanie transkrypcji przez wolny represor

Metylacja DNA

• Metylacja DNA polega na enzymatycznym przyłączaniu reszt metylowych (-CH₃) do nukleotydów

• Procesowi temu podlegają cytozyny wchodzące w skład dinukleotydu CpG

• Metylacja cytozyn związana jest z obniżeniem aktywności transkrypcyjnej – stanowi sygnał wyłączenia genu

• Jest procesem odwracalnym

• Spełnia istotną rolę w długoterminowej inaktywacji genów (chromosom X, protoonkogeny)

Czynniki transkrypcyjne

• Są to czynniki kontroli ekspresji genów

• Zdolne są przyłączyć się do DNA do specyficznych sekwencji

• Mogą regulować poziom transkrypcji dodatnio lub ujemnie

• Kodowane są przez geny regulatorowe, które stanowią 5-10 % genomu człowieka

• Mają budowę modularną i składają się z domen białkowych pełniących określone funkcje:

• DOMENY WIĄŻĄCE DNA

• DOMENY ODPOWIEDZIALNE ZA DIMERYZACJĘ

• DOMENY TRANSAKTYWUJĄCE

• Scharakteryzowano trzy typy domen wiążących na podstawie występujących w nich motywów:

- helisa-zwrot-helisa

- palce cynkowe

- helisa-pętla-helisa

• W domenach odpowiedzialnych za dimeryzację wyróżnia się dwa typy motywów:

- suwak leucynowy

- helisa-pętla-helisa