Synteza nukleotydów
dwie kategorie: synteza de novo i synteza rezerwowa.
Synteza de novo. Zasady nukleotydowe składane są z prostszych związków. Pirydyny: najpierw budowany szkielet zasady, które zostaje przyłączony do rybozy. Puryny: fragmenty dobudowywane do rybozy
Szlak rezerwowy. Przyłączenie do rybozy zasad odzyskanych z innych procesów.
Obydwa szlaki prowadzą do powstania rybonukleotydów.
Nukleozyd zawiera purynę lub pirymidynę przyłączone do cząsteczki cukru.
Nukleotyd – ester fosforanowy nukleozydu
De novo:
synteza nukleotydów pirymidynowych:
syntetyzowany pierścień zasady składa się z 2 cząsteczek wodorowęglanu, kwas asparaginowy i NH4+, NH4+ - grupa amonowa powstała w wyniku hydrolizy łańcucha bocznego glutaminy
przyłączenie do rybozy, powstaje nukleotyd pirymidynowy
biosynteza pirymidyn:
synteza karbomoilofosforanu, bierze udział jon wodorowęglanowy, amonowy i 2 ATP, katalizowany – syntetaza karbomoilofosforanowa – CPS:
a) fosforylacja jonu wodorowęglanowego z wykorzystaniem ATP, powstaje karboksyfosforan i ADP
b) karboksyfosforan reaguje z amoniakiem, powstaje kwas karbominowy i nieorganiczny fosforan
c) ostatni – kwas karbominowy ulega fosforylacji z udziałem ATP, powstaje karbomoilofosforan, katalizowany przez syntetazę karbomoilofosforanową
budowa CPS: białko zawiera dwie homologiczne domeny, każda katalizuje inny etap: a i b – centrum aktywne znajduje się na końcu C białka, domena ta tworzy strukturę nazywaną domeną wiążącą ATP. Otacza cząstkę ATP przytrzymując ją w orientacji umożliwiającą atak nukleofilowy na grupę fosforanową gamma. C – zachodzi w drugiej domenie CPS, centra aktywne obydwu domen wykazują wzajemne podobieństwo.
Enzym złożony z dwóch łańcuchów polipeptydowych, łańcuch krótszy – zawiera miejsce odpowiedzialne za hydrolizę glutaminy – odpowiada za uwolnienie jonu amonowego; łańcuch dłuższy – zawiera dwie domeny wiążące ATP. 3 centra aktywne oddzielone od siebie o 8nm.
Produkty pośrednie powstające w jednym przemieszczają się do następnego, przy czym nie odłączają się od cząsteczki enzymu. Migracja na drodze przenoszenia tunelowego. Cel przenoszenia tunelowego: brak utraty produktów pośrednich spowodowanych dyfuzją; związki nietrwałe (karboksyfosforan i kwas karbaninowy) chronione są przed hydrolizą.
reakcja karbomoilofosforanu z asparaginianem, powstaje karbomoiloasparaginian – enzym karbamoilotransferaza asparaginianowa.
Karbomoiloasparaginian ulega cyklizacji do dihydroorotanu
dihydroorotan + NAD+ utleniany do orotanu
orotan zostaje związany z rybozą z 5-fosforybozylo-1-pirofosporanu (PRPP) – aktywowana forma rybozy zdolna do przyłączania zasad nukleotydowych, powstaje z rybozo – 5 fosforanu > utworzenie nukleotydu pirymidynowego orotydylan katalizowany przez fosforybozylotransferazę pirymidynową
orotydylan >dekarboksylacja do urydynalu (UMP) – prekursor RNA – katalizowany przez dekarboksylazę orotydylanową
cytydyna:
nukleozydy monofosforanowe przekształcone w difosforany , enzym – kinaza nuklezymonofosforanowa – wykorzystanie ATP jako źródło grup fosforanowych
di i tri fosforany nukleozydów ulegają wzajemnym przemianom
trifosforan cytydyny powstaje z trifosforanu urydyny przez wymianę tlenu grupy karbonylowej na grupę aminową (wymaga ATP oraz glutaminy); CTP do syntezy RNA
zasady purynowe:
wymiana pirofosforanu na grupę aminową, powstaje 5-fosforybozylo-1-amina (grupa aminowa w konfiguracji beta), enzym – fosforybozyloaminotrasferaza glutaminowa
budowa enzymu: dwie domeny: pierwsza homologiczna do fosforybozylotransferaz, druga odpowiedzialna za pozyskiwanie jonów amonowych z hydrolizy glutaminy; konfiguracja aktywna tylko przy związaniu PRPP i glutaminy, jony amonowe przenoszone tunelowo na PRPP
złożenie pierścienia purynowego:
a) glicyna związana do grupy aminowej fosforybozyloamin, grupa karboksylaza glicyny aktywowana przez fosforylację i przyłączenie do grupy aminowej fosforybozyloaminy
b) N10-formylotetrahydrofolian przenosi grupę formylową na grupę aminową glicyny, aktywacja mrówczanu i jego przyłączenie do grupy aminowej glicyny prowadzi do powstania rybonukleotydu formyloglicynoamidowego, dwa enzymy: 1. dostarcza grupę formylową z N20-formylotetrahydrofolianu, 2. aktywuje mrówczan do formylofosforanu, który zostaje dołączony do grupy aminowej glicyny
c) przeniesienie atomu azotu z glicyny, podstawienie tlenu karbonylowego grupą NH prowadzi do powstania rybonukleotydu formyloglicynoamidynowego, atom N pochodzi z bocznego łańcucha glicyny z udziałem ATP
d) powstanie 5 skłądnikowego pierścienia imidazolowego, produkt: rybonukleotyd formyloglicyloamidynowy cyklizuje sie w wieloskładnikowy pierścień imidazolowy, 1ATP zużyta do zablokowania odwracalności reakcji, grupa fosforanowa ATP aktywuje tlen grupy karbonylowej, które zostaje zamieniony na N przyłączony bezpośrednio do rybozy
e) przyłączenie wodorowęglanu do egzocyklicznej grupy aminowej i do atomu C pierścienia imidazolu, jon wodorowęglanowy zostaje aktywowany przez fosforylację, następnie atakowany przez egzocykliczną grupę aminową, później przeniesienie grupy karbosylowej na pierścień ( bez ATP)
f) grupa karbosylowa imidazolu ulega fosforylacji, po której grupa fosforanowa podstawiona jest grupą aminową z asparaginianu
etapy te są homologiczne, każdy etap składa się z aktywacji tlenu związanego z atomem C (gr karbonylowa) na drodze fosforylacji, po której następuje wymiana grupy fosforanowej na jon amonowy lub grupę aminową działające jak nukleofile
g) usunięcie fumaranu. Fumaran ulega eliminacji pozostawiając atom N przyłączony do pierścienia.
h) dodanie grupy formylowej - z N10-formylotetrahydrofolianu do atomu N.
i) cyklizacja cząsteczki, utrata cząsteczki wody, przekształcenie w inozynian - IMP
szlak rezerwowy:
zasady purynowe:
wolne zasady mogą być przyłączane do PRPP. Prowadzi to do powstania monofosforanów nukleozydów. Enzym – fosforybozylotransferaza adeninowa katalizuje powstanie adenylanu: adenina + PRPP > adenylan + Ppi; enzym – fosforybozylotransferaza hipoksantyno-guaninowa (HGPRT) – katalizuje powstanie guanylanu i inozynianu: guanina + PRPP > guanylan + PPi, hipoksantyna + PRPP > inozynian + Ppi
synteza deoksyrybonukleotydów:
przeniesienie elektronu z reszty cysteinowej podjednostki R1 na rodnik tyrozylu podjednostki R2. Utrata elektronu jest przyczyną powstania bardzo reaktywnego rodnika cysteinotiolowego w centrum aktywnym R1
oderwanie atomu wodoru z węgla C3' rybozy przez rodnik cysteinotiolowy w wyniku czego właściwości rodnika zostają przeniesione na węgiel substratu
rodnik węgla C3' stymuluje usunięcie jonu hydroksylowego z atomu węgla C2'. Jon ten ulega następnie protonacji z udziałem kolejnej reszty cysteinowej enzymu i w postaci cząsteczki H2O opuszcza enzym
jon wodorkowy zostaje przeniesiony z reszty cysteinowej na węgiel C2' co kończy jego redukcję oraz powoduje ponowne przesunięcie rodnika na węgiel C3'. W wyniku tej reakcji powstaje mostek 2siarczkowy pomiędzy resztami cysteinowymi enzymu
uwolnienie deoksyrybonukleotydu z enzymu
mostek 2siarczkowy ulega redukcji z udziałem białka trioredoksyny. Umożliwia to regenerację aktywnego enzymu.
Utlenienie tioredoksyny z udziałem NADH katalizowane enzymem – reduktaza tioredoksyny
synteza deoksytymidylanu:
katalizowana przez syntaze tymidylanową – przemiana deoksyurydynalu dUMP na deoksytymidynal dTMP
grupa metylowa zostaje przyłączona do atomu węgla C5 pierścienia dUMP, donorem grupy metylowej jest N5,N10-metylenotetrahydrofolian
syntaza tymidylanowa rozpoczyna metylację przez dodanie grupy triolowej z reszty cysteinowej białka do pierścienia.
Grupa metylenowa ulega aktywacji co prowadzi do otwarcia pierścienia THF
aktywny UMP atakuje grupę metylenową. Utworzenie wiązania nowego wiązania C-C
jon wodorkowy ostaje przeniesiony z pierścienia THF na grupę metylenową. Powstaje grupa metylowa. Z atomu węgla grupy metylowej zostaje oderwany proton, który zostaje przeniesiony na cysteinę i umożliwia regenerację pierścienia.
Aby rozpocząć kolejna syntezę THF musi ulec regeneracji - enzym: reduktaza dihydrofolianowa, reduktor NADPH
blokowanie syntezy dTMP:
fluorouracyl (lek przeciwnowotworowy) przekształcenie do fluorodeoksyurydynalu F-dUMP, który blokuje nieodwracalnie syntazę tymidylanową, która katalizuje przejście z dUMP na dTMP. Drugi sposób blokowania syntezy dTMP – zahamowanie regeneracji tetrahydrofolianu i inhibitorem jest aminopteryna lub metotreksat. Metotreksat – powoduje śmierć dzielących się komórek (wszystkich – zdrowych i niezdrowych – utrata włosów)
regulacja biosyntezy nukleotydów:
synteza nukleotydów purynowych kontynuowana jest na drodze sprzężenia zwrotnego:
hamowanie aktywności fosforybozyloamidotransferazy glutaminowej – hamowanie przez AMP, GMP i IMP
hamowanie reakcji prowadzącej od inozynianiu. AMP blokuje zamianę inozynianu w adenylobursztynian i GMP blokuje syntezę ksantylanu
zależność substratowa pomiędzy syntezą rybonukleotydów adeninowych i guaninowych. GTP jest substratem do syntezy AMP a ATP jest substratem do syntezy GMP.
Każdy z łańcuchów polipeptydowych podjednostki R1 reduktazy rybonukleotydowej u bakterii zawiera dwa miejsca allosteryczne i jeden kontroluje całkowitą aktywność enzymu, drugi reguluje specyficzność substratową.
synteza NAD+ - dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy:
powstanie rybonukleotydu nikotynianu z nikotynianu i PRPP
powstanie deamino-NAD+ w wyniku przeniesienia reszty AMP z ATP na rybonukleotyd nikotynianowy
przyłączenie jonu amonowego z grupy amidowej glutaminy do grupy karboksylowej nikotynianu
mniej gruby punkt:
powstanie NADP+ - powstaje z NAD+ przez fosforylację grupy 2'hydroksylowej reszty rybozyadeninowej, katalizuje kinaza NAD+
powstanie FAD – dinukleotyd flawinoadeninowy:
fosforylacja rybofawiny z udziałem ATP, powstaje ryboflawino5'fosforan
ryboflawino5'fosforan łączy się z ATP i powstaje FAD i Ppi
zaburzenia metabolizmu nukleotydów:
za rozkład hydrolityczny nukletydów odpowiedzialny jest enzym nukleotydaza
za fosforolityczny rozkład nukleozydów odpowiedzialny jest enzym fosforylazy nukleozydowej. Rozkład prowadzi do powstania wolnej zasady i rybozo1fosforanu. Pod wpływem fosforybomutazy rybozo1fosforan może ulec izomeracji do rybozo5fosforanu (substratu wykorzystywanego do syntezy PRPP). Pozostałe zasady ulegają degradacji do produktów wydalanych z organizmu: AMP degradacja do hipoksantyny, hipoksantyna do ksantyny > enzym : oksydaza ksantynowa, ksantyna do kwasu moczowego, kwas moczowy tworzy moczan tracąc proton, moczan wydalany wraz z moczem
Choroba: DNA – SKAZA MOCZANOWA: objawy: wysoki poziom moczanu w surowicy, skrystalizowane sole moczanu prowadzą do uszkodzenia stawów i nerek
mutacje w genach kodujących enzymy syntezy nukleotydów:
zespół Lescha-Nyhana – nieopanowane zachowanie się natręctwo autoagresywne; powód: brak fosforybozylotransferazy hipoksantynoguaninowej; efekt: zwiększone stężenie PRPP znaczący wzrost syntezy puryn (szlak de novo) i nadprodukcja moczanu.