BIOLOGIA LABORATORIUM

1. Rozdział chromatograficzny aminokwasów hydrolizatu włosów ludzkich.

Materiały: hydrolizat włosów ludzkich; 0,5% r-ry wodne aminokwasów (histydyna, arginina, glicyna, cystyna, cysteina, lizyna, kwas glutaminowy, tyrozyna, walina, fenyloalanina); płytka do chromatografii TLC pokryta silikażelem; rozpuszczalnik: n-butanol - kwas octowy - woda w stosunku12:3:5; wskaźnik: 0,1% alkoholowy r-r ninhydryny;

Czynności:

1. na płytce chromatograficznej na wysokości 1 cm narysowano linię startu i miejsca naniesienia r-rów aminokwasów;

2. naniesiono wodne r-ry aminokwasów i hydrolizatu włosów za pomocą kapilar;

3. płytkę umieszczono w komorze chromatograficznej;

4. po 2 godzinach wyjęto płytkę i zaznaczono ołówkiem linię mety;

5. płytka została wysuszona, spryskana r-rem ninhydryny, ponownie wysuszona, wywołane plamki zaznaczono ołówkiem;

Obserwacje:

1) na płytce pojawiły się plamki o różnych barwach (każda reprezentująca konkretny aminokwas);

2) wystąpiło także kilka plamek w linii nałożenia hydrolizatu;

Obliczenia: R_f = r₁/r₂; r₁ - droga przebyta przez związek; r₂=61[mm] - droga od startu do linii mety;

Wartości współczynnika retencji(R_f) dla wszystkich aminokwasów:

Kwas glutaminowy 0,2
Histydyna 0,107
Cysteina 0,176
Glicyna 0,154
Arginina 0,138
Lizyna 0,107
Walina 0,353
Cystyna 0,235
Tyrozyna 0,352
Fenyloalanina 0,492

Hydrolizat: 0,092; 0,2; 0,384; 0,475; 0,630; 0,723

Wnioski:

W oparciu o wartości współczynnika retencji poszczególnych aminokwasów można zidentyfikować skład hydrolizatu włosa. Aminokwasy występujące w ludzkim włosie to między innymi: cysteina, kwas glutaminowy, walina, lizyna.

2. Odczyn barwny wiązania peptydowego - próba biuretowa.

Materiały: r-r NaOH; 0,1% r-r CuSO₄; 0,5% r-ry żelatyny, kazeiny i glicyny; zawiesina mąki pszennej;

Czynności:

1. do podpisanych probówek dodano osobno: 2 ml badanego r-ru białka, 2 ml r-ru glicyny i 2 ml wody destylowanej;

2. do każdej przygotowanej probówki dodano 2 ml r-ru NaOH; po wymieszaniu dodawano kroplami 0,1% r-r CuSO₄, aż pojawiło się zabarwienie (~15 kropli);

Obserwacje:

1. próbka kontrolna (z wodą) - r-r barwy błękitnej (wynik negatywny próby biuretowej);

2. probówka z glicyną - błękitny r-r (wynik negatywny);

3. probówki z kazeiną, żelatyną, mąką pszenną - fioletowy r-r (wynik pozytywny);

Wnioski:

1. Roztwory kazeiny (białko mleka), żelatyny (- kolagen) i mąki pszennej (- białka glutenowe) po dodaniu NaOH i CuSO₄ zmieniły zabarwienie z błękitu na fiolet, tym samym dając pozytywny wynik próby biuretowej, co wykazuje, że w/w związki zawierają wiązania peptydowe;

2. Roztwór glicyny nie zmienił zabarwienia - mimo tego, że jest ona aminokwasem, nie posiada wiązań peptydowych, ponieważ jest monomerem;

3. Wykrywanie wolnych grup aminowych za pomocą ninhydryny.

Materiały: 0,1% r-r ninhydryny; 0,5% r-ry żelatyny, kazeiny, glicyny;

Czynności:

1. do podpisanych probówek dodano osobno: 2 ml badanego r-ru białka, 2 ml r-ru glicyny i 2 ml wody destylowanej;

2. do każdej probówki dodano 0,5 ml r-ru ninhydryny i zapisano obserwacje;

3. po podgrzaniu probówek w łaźni wodnej (5min, 95°C) zapisano obserwacje;

Obserwacje:

1. na zimno: r-r glicyny był jasnofioletowy, a reszta r-rów była prawie bezbarwna;

2. po podgrzaniu: r-r glicyny - ciemnofioletowy; r-ry kazeiny i żelatyny- jasnofioletowe;

Wnioski:

1. Próba w reakcji z glicyną, żelatyną i kazeiną dała wynik pozytywny.

2. Reakcja ninhydrynowa służy do wykrywania aminokwasów - glicyna jest aminokwasem, a żelatyna i kazeina zawierają aminokwasy, ponieważ są białkami.

3. Podgrzanie przyspieszyło reakcję.

4. Rozpuszczalność polisacharydów.

Materiały: agar, celuloza, skrobia;

Czynności:

1. do każdej probówki dodano odrobinę badanego cukru i 2 ml wody destylowanej;

2. probówki podgrzano w łaźni wodnej (5min, 95°C), zapisano obserwacje;

Obserwacje:

1. W zimnej wodzie destylowanej - żadna z badanych substancji nie uległa rozpuszczeniu.

2. Po podgrzaniu w probówce z agarem powstał żel, ze skrobi powstał kleik, a celuzoza nie rozpuściła się.

Wnioski:

Agar rozpuszcza się w wysokich temperaturach, a jego roztwór po ochłodzeniu tworzy żel. Skrobia także rozpuszcza się tylko w wysokich temperaturach dając kleik skrobiowy. Celuloza jest nierozpuszczalna w wodzie.

5. Właściwości redukcyjne cukrów.

Materiały: skrobia, sacharoza, fruktoza, maltoza, odczynnik I Fehlinga (CuSO₄), odczynnik II Fehlinga (NaOH+winian sodowo-potasowy), odczynnik Benedicta;

Próba Fehlinga:

1. w oznaczonych probówkach zmieszać po 1 ml r-ru Fehlinga I i r-ru F. II;

2. do jednej probówki dodać 1 ml wody destylowanej (probówka kontrolna), do pozostałych - po 1 ml badanego r-ru cukru, wymieszać;

3. probówki podgrzać w łaźni wodnej (5min, 95°C), zanotować obserwacje;

Obserwacje (Fehling):

1. Probówka kontrolna, r-r skrobi, sacharozy - bezbarwne;

2. R-r fruktozy - czerwony osad; maltozy - brunatnoczerwony osad;

Próba Benedicta:

1. do oznaczonych probówek dodać 5 ml r-ru Benedicta;

2), 3) jak w próbie Fehlinga;

Obserwacje (Benedict):

1. probówka kontrolna, r-r skrobi, sacharozy - brak reakcji (błękitny r-r);

2. r-r fruktozy - czerwony osad (Cu₂O)

3. r-r maltozy - niebieski r-r;

Wnioski:

1. fruktoza i maltoza są cukrami o właściwościach redukcyjnych;

2. obie próby powinny dać taki sam rezultat, więc niebieskie zabarwienie r-ru maltozy jest wynikiem nieudanego doświadczenia (powinien pojawić się osad Cu₂O)

6. Badanie produktów spożywczych na zawartość skrobi i cukrów redukujących.

Materiały: banan, jabłko, ryż, odczynnik Benedicta, płyn Lugola;

Czynności:

1. do 3 podpisanych probówek dodać odpowienio kawałek banana, jabłka i kilka ziarenek ryżu; do każdej dodać 2 ml wody destylowanej;

2. probówki podgrzać w łaźni wodnej (5min, 95°C);

3. do każdej dodać 5 kropli płynu Lugola, zanotować obserwacje;

4. powtórzyć 1), 2), do każdej probówki dodać po 5 ml r-ru Benedicta i umieścić w łaźni wodnej na kolejne 5 min;

Obserwacje:

Jabłko - po dodaniu płynu Lugola r-r pozostał żółty (wynik negatywny); po dodaniu odczynnika Benedicta pojawił się ceglasty osad;

Ryż - po dodaniu płynu Lugola - ciemny; po dodaniu odczynnika Benedicta - brak zmian;

Banan - po dodaniu płynu Lugola - ciemny; po dodaniu odcz. Benedicta - zielony r-r, słaboceglasty osad;

Wnioski:

Jabłko - nie ma skrobi, za to duże stężenie cukrów redukujących;

Ryż - ma skrobię, nie ma cukrów redukujących;

Banan - ma skrobię, ma cukry redukujące, ale w mniejszym stężeniu niż jabłko;

---