Hodowla komórkowa II

linie komórkowe: Bioptaty – wycinki uzyskane podczas - zakupiona w banku tkanek zabiegów chirurgicznych
- pochodząca z własnej hodowli kolekcji laboratorium

wstępne rozdrobnienie za pomocą skalpela i/lub igły

inkubacja z enzymem np. z trypsyną czas: w zależności od tkanki

tk. twarde (kość) do 24h

tk. miękkie: 5-10 min temp. 37˚C

Cel: uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek

dodanie pożywki w objętości co najmniej 2x większej niż objętość
użytego r-ru trypsyny

Cel: zahamowanie aktywności trypsyny

Przeniesienie zawiesiny komórek do naczynia hodowlanego

Dodanie pożywki

Przeniesienie naczynia hodowlanego wraz z zawiesiną komórek w pożywce do inkubatora

Hodowla pierwotna

Funkcja tkanki

Wypadkowa różnych interakcji: in vitro

- komórkowych dochodzi tylko do ekspresji jednostkowych,

- biochemicznych podstawowych funkcji komórek (monokultura),

- przestrzennych do których są wyposażone i są zdolne prezentować

je w warunkach uniemożliwiających interakcję z innymi komórkami

3 Metabolizm in vitro

Oparty na GLIKOLIZIE

Rola cyklu kwasu cytrynowego jest mniejsza.

Kom. świeżo uzyskane – metabolizm szybki

Po jakimś czasie od inkubacji – szybko spada

Kom. wyspecjalizowane – zachowane podstawowe funkcje

Metabolizm komórki jest oparty na glikolizie a rola cyklu kwasu cytrynowego jest mniejsza

4 Hodowla kofluentna – hodowla, w której komórki pokrywają ścisłą warstwą całą powierzchnię naczynia.

5 Pasażowanie:

· samoistna selekcja komórek o większej sile proliferacji

· komórki bardziej zróżnicowane giną

· hodowlę przerastają najczęściej fibroblasty tkanki łącznej lub elementy waskularne

Warunek wyprowadzania linii komórkowych:

- zapobieganie przerastania przez fibroblasty hodowli komórek bardziej wyspecjalizowanych

- stosowanie właściwych pożywek i substratów umożliwiających selekcję odpowiednich typów komórek

6 Czas życia komórek w hodowli in vitro

Komórki	Czas życia
Diploidalne	Czas wzrostu ograniczony; podział komórek: ograniczona liczba pokoleń
Heteroploidalne (nowotworowe) immortalizowane macierzyste niezróżnicowane embrionalne	Czas wzrostu nieograniczony: podział komórek nieograniczony
	nieśmiertelne

7 Czas życia komórek linii w hodowli zależy od:

wieku organizmu, z którego pobrano komórki

dobowego cyklu narządu

sezonowego cyklu narządu

endokrynowego cyklu narządu

rodzaju tkanki

8 Linie komórkowe o ograniczonym czasie wzrostu rosną przez konkretną liczbę pokoleń 20 do 80 podwojeń populacji.

Linia komórkowa o ograniczonym czasie wzrostu

9 Transformacja komórek

Zmiana fenotypu zależna od zmiany materiału genetycznego.

Zmiana ploidalności

Wzrost liczby zaburzeń chromosomowych.

Najczęstszy powód spontanicznej transformacji linii komórek prawidłowych - zbytnie zagęszczenie hodowli! Część komórek przestaje podlegać zahamowaniu kontaktowemu - wzrost warstwowy - utrata kontroli wzrostu

10 Transformacja indukowana in vitro:

· traktowanie komórek niektórymi związkami chemicznymi

· za pośrednictwem wirusów – SV40

Transformowane linie komórkowe - linie komórkowe unieśmiertelnione

- immortalizowane linie komórkowe

- linie komórkowe transformowane

11 Immortalizacja komórek

MPV - geny E6 i E7

EBV - cały wirus

SV40 (Simian virus 40) - gen LT

Adenowirusy - gen E1a