Patrycja Kąkol 28.03.2012
186504
Mikrobiologia
grupa : Środa, godz. 7³⁰-9⁰⁰

Ćwiczenie 6-7
Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów.

Hodowla jest to zespół działań i procesów w wytwarzanych sztucznie optymalnych warunkach dla rozwoju danego organizmu hodowanego. Ma to na celu otrzymanie organizmów w warunkach sztucznych, dotyczy to także namnażania organizmów.
Aby hodować drobnoustroje, należy je posiać. Organizmy które posiewamy nazywane są inokulum lub zaszczep.
Hodowle można podzielić na:
• statyczne (okresowe)- posiane drobnoustroje rosną i rozmnażają się do momentu wyczerpania się składników pokarmowych bądź nagromadzenia się toksycznych produktów przemiany materii, które uniemożliwiają dalszy rozwój;
• ciągłe-polega na usuwaniu zużytego podłoża i zastępowaniu go świeżym, ma miejsce ciągły przepływ pożywki;
• zsynchronizowane- komórki w takiej hodowli dzielą się równocześnie, co nie ma miejsca w innych hodowlach, taki proces umożliwia badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle są to procesy nieuchwytne, ponieważ metody badawcze są mało czułe.

Cele posiewu są różne. Może to być na przykład wyizolowanie określonych drobnoustrojów z prób środowiskowych, w tym uzyskanie czystych szczepów, może to być także wspomniane wyżej namnażanie, które może służyć między innymi pozyskaniu produktów metabolizmu namnażanego drobnoustroju, lub zbadanie zdolności rozkładu określonych zanieczyszczeń.

Do posiewów używane są pożywki, dobierane w zależności od wymagań drobnoustroju, który chcemy posiać w celu namnażania, bądź w celu wyizolowania.
Wyróżniamy 3 rodzaje pożywek ze względu na ich konsystencje: stałe, płynne i półpłynne.
Istnieje także podział ze względu na wymagania pokarmowe drobnoustrojów, wyróżniamy tu pożywki: proste, wzbogacone, specjalne, wybiórcze (selektywne), wybiórczo-namnażające, wybiórczo-różnicujące.

CZĘŚĆ I

Zadanie 1.
Posiew izolacyjny na podłoże stałe (agar odżywczy).
Cel posiewu:
Wyizolowanie czystych szczepów drobnoustrojów w postaci kolonii;
Wykonanie:
Wyżarzoną i schłodzoną ezą pobrano zawiesinę bakterii i delikatnie rozprowadzono po powierzchni agaru. Posiane hodowle inkubowano w temperaturze pokojowej przez tydzień czasu.
Wynik posiewu:
Po tygodniu inkubacji na szalce Pietriego stwierdzono obecność kolonii o różnej morfologii. Można wyróżnić co najmniej 3 różne morfologicznie kolonie z dominacją koloni ciemnoczerwonych. Drugi rodzaj jest mały i szary, a trzecia kolonia jest żółtawa.

Zadanie 2.
Posiew ezą na skos agarowy.
Cel posiewu:
Przechowywanie szczepów i zwiększenie powierzchni.
Wykonanie:
Wyżarzoną i schłodzoną ezą pobrano zawiesiną szczepu bakterii i rozprowadzono po powierzchni skosu agarowego, zaczynając od dołu i prowadząc ezę zygzakowato ku górze.
Wynik posiewu:
Po inkubacji stwierdzono wzrost wzdłuż linii posiewu w postaci czerwonego nalotu.

Zadanie 3.
Posiew na podłoże płynne (bulion odżywczy).
Cel posiewu:
Określenie stosunku do tlenu danej bakterii (czy jest ona tlenowcem czy względnym beztlenowcem).
Wykonanie:
Ezą pobrano zawiesinę szczepu bakterii i przeniesiono do probówki z bulionem odżywczym i inkubowano przez 7 dni w temperaturze pokojowej.
Wynik posiewu:
Dla klasycznych tlenowców (Bacillus) typowy jest wzrost na powierzchni bulionu w postaci kożuszka, natomiast lekkie zmętnienie jest charakterystyczne dla względnych beztlenowców. W badanym szczepie stwierdzamy obecności względnych beztlenowców, ponieważ zaobserwowano zmętnienie w całej objętości pożywki.

Zadanie 4.
Posiew na podłoże płynne fermentacyjne.
Cel posiewu:
Badanie zdolności danego szczepu do fermentacji określonego cukru co przejawia się zmianą zabarwienia pożywki i wytworzeniem gazu zbieranego w rurce Durhama.
Wykonanie:

Ezą pobrano zawiesinę szczepu i przeniesiono do probówki i inkubowano przez 7 dni.
Wynik posiewu:
W próbie zaobserwowano zmianę zabarwienia na kolor żółty, co świadczy o zakwaszeniu, które nastąpiło w wyniku sfermentowania laktozy. W rurce Durhama zaobserwowano zebrany gaz, którym jest CO₂. Tak więc posiany szczep posiada zdolność do fermentacji cukru zawartego w pożywce.

Zadanie 5.
Posiew metodą kłutą na słupek agarowy z TTC.
Cel posiewu:
Zbadanie zdolności bakterii do ruchu.
Wykonanie:
Igłą mikrobiologiczną pobrano zawiesinę szczepu bakterii i zaszczepiono słupek agarowy wkłuwając igłę aż do dna słupka.
Wynik posiewu:
TTC po redukcji, gdy zachodzi dehydrogenaza, zmienia kolor na czerwony, dlatego wykorzystuje się go do wykrywania aktywności ruchowej bakterii. Z aktywnością dehydrogenazową mamy do czynienia kiedy bakteria wytwarza energię. Kolor czerwony wystąpi tam gdzie znajdują się bakterie, jeśli ma to miejsce poza miejscem wkłucia, oznacza to, że bakterie się poruszały.
W badanej próbie nie stwierdzono ruchu, przemieszczania się bakterii. W warunkach tlenowych bakterie mają zdolność ruchu i wzrostu, ale Sarcina lutea nie posiada ich w warunkach beztlenowych.

Zadanie 6.
Posiew metodą kłutą na słupek żelatynowy.
Cel posiewu:
Badanie zdolności szczepu do hydrolizy białka, czyli proteolizy.
Wykonanie:
Posiew wykonany jak zadaniu nr 5.
Wynik posiewu:
U posianego szczepu, Bacillus, nie stwierdzono zdolności do proteolizy, ponieważ nie nastąpiło upłynnienie żelatyny, które jest przejawem zdolności do proteolizy.

Zadanie 7.
Posiew metodą wgłębną na płytki Petriego.
Cel posiewu:
Określanie liczby komórek w badanym materiale, badania ilościowe.
Wykonanie:
Ustawiono probówki w statywie o zawartości 9 cm³ roztworu fizjologicznego. Do pierwszej wprowadzono 1 cm³ wyjściowej zawiesiny drobnoustrojów i wymieszano w mikrowytrząsarce. Uzyskano w ten sposób dziesięciokrotne rozcieńczenie próby. Postępując podobnie uzyskano rozcieńczenia 10²x, 10³x, 10⁴x, 10⁵x i 10⁶x.
Następnie umieszczono po 1 cm³ z każdej próby na sterylnych szalkach Petriego i zalano ciepłym agarem i inkubowano przez 7 dni.
Wynik posiewu:
Policzono bakterie, które wyrosły na szalce z rozcieńczeniem 10⁵x, było ich 43. Ilość bakterii występująca w 1 cm³ badanego rozcieńczenia to 4,3·10⁶ $\frac{\text{CFU}}{\text{cm}^{3}}$ .

Zadanie 8.
Posiew metodą powierzchniową głaszczką na podłoże stałe.
Cel posiewu:
Tak samo jak poprzedni, wykorzystywany w badaniach ilościowych.
Wykonanie:
Na sześciu płytkach odpowiednich dla poszczególnego rozcieńczenia, umieszczono po 0,1cm³ z każdego rozcieńczenia i wylano na powierzchnię. Wysterylizowaną głaszczką rozprowadzono zawiesinę po całej powierzchni pożywki. Odstawiono do inkubacji na 7 dni w temp. pokojowej.
Wynik posiewu:
Na płytce z rozcieńczeniem 10⁵x policzono kolonie, było ich 54.
Różnica w pierwszym i drugim posiewie może wynikać z tego, że bakterie w zadaniu 8 były posiewane na powierzchnię, co oznacza dostęp do większej ilości tlenu, więc możliwe, że wyrosło więcej tlenowców. W metodzie wgłębnej bakterie nie miały dostępy do tlenu, ale też może to wynikać ze zbyt wysokiej temperatury agaru i część bakterii zginęło, albo próba została źle wymieszana. Tak więc ostateczna liczba bakterii w 1 cm³ badanego rozcieńczenia dla zadania ósmego wynosi 5,4·10⁶ $\frac{\text{CFU}}{\text{cm}^{3}}$ .

CZĘŚĆ II

Zadanie 1.
Posiew na podłoże agarowe ze skrobią.
Podłoże to umożliwia zbadanie zdolności szczepu do hydrolizy skrobi (amylolizy), a także do określenia liczby bakterii amylolitycznych w badanej próbie.
Wykonanie:
Posiew wykonano metodą powierzchniową wprowadzając na pożywkę 100 μl zawiesiny bakterii Bacillus sp. i rozprowadzono głaszczką, następnie inkubowano przez 7 dni. Po okresie inkubacji zalano powierzchnię hodowli płynem Lugola, po odczekaniu kilku minut zaobserwowano barwne zmiany w pożywce.
Wynik posiewu:
Stwierdzono miejscową hydrolizę skrobi.

Zadanie 2.
Posiew na bulion z tryptofanem.
Podłoże to umożliwia zbadanie zdolności szczepu do wytwarzania indolu z tryptofanu, co jest ważną cechą biochemiczną wykorzystywaną w identyfikacji pałeczek grupy coli.
Wykonanie:
Pobrano zawiesiną Escherichia coli i zaszczepiono pożywkę, następnie inkubowano w temperaturze 37^oC. Po inkubacji wykonano próbę na indol dodając do hodowli 0,5 cm³ odczynnika Kovacsa.
Wynik posiewu:
Po dodaniu odczynnika Kovacsa pojawiła się intensywna barwa, koloru biskupiego, co świadczy o obecności indolu.

Zadanie 3.
Hodowla bakterii nitryfikacyjnych.
Hodowle bakterii autotroficznych prowadzi się zasadniczo na pożywkach zawierających jedynie związki nieorganiczne, natomiast związki organiczne wytwarzają asymilując CO₂.
Wykonanie:
Do probówki z pożywką mineralną Winogradskiego dla I fazy nitryfikacji wprowadzono grudkę ziemi, tak samo zaszczepiono pożywkę o tym samym podłożu, dla fazy II. Odstawiono do inkubacji na.
Wynik posiewu:
Brak odczytu.

Zadanie 7.
Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych.
Wykonanie:
Probówki z bulionem z KNO₃ zaszczepiono osadem dennym i zakorkowano uszczelniając folią. Odstawiono do inkubacji na 7 dni.
Wynik inkubacji:
Stwierdzono obecność gazu i zmętnienie pożywki, jest to przejawem aktywności bakterii denitryfikacyjnych. Zaobserwowany gaz, który się wytworzył to azot.

Zadanie 8.
Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii desulfurykacyjnych.
Wykonanie:
Słupki agarowe z octanem ołowiu zaszczepiono osadem dennym, metodą kłutą, następnie inkubowano przez 7 dni.
Wynik posiewu:
Po wkłuciu osadu czynnego i inkubacji pojawiła się czarna barwa, która jest wynikiem reakcji zredukowanych siarczanów do siarczków z kationami metali. Stwierdzono tym samym obecność bakterii desulfurykacyjnych.

Zadanie 9.
Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii fermentacji masłowej.
Wykonanie:
Probówki z 2% roztworem sacharozy zaszczepiono grudką ziemi, następnie ogrzewano przez 10 minut w łaźni wodnej w temp. 75-80^oC, w celu usunięcia tlenu i zabicia bakterii nieprzetrwalnikujących. Po ogrzaniu probówkę szybko schłodzono i zakorkowano uszczelniając folią i poddano siedmiodniowej inkubacji w temperaturze pokojowej.
Wynik posiewu:
Nie stwierdzono zapachu zjełczałego masła, co świadczy o braku obecności kwasu masłowego. Taki wynik posiewu może być spowodowany brakiem bakterii fermentacji masłowej w glebie lub ale czas ogrzewania w łaźni wodnej był zbyt długi.