HODOWLA I WZROST MIKROORGANIZMÓW

Mikroorganizmy hodujemy na specyficznych podłożach.

Wymagania odżywcze mikroorganizmów:

1. Źródła węgla:

1. Chemoorganotrofy: metabolizują organiczne źródła węgla (najczęściej celuloza, maltoza, ale też aminokwasy, białka)

2. Autotrofy: korzystają z nieorganicznych źródeł węgla: CO2 (najczęściej bakterie purynowe i siarkowe)

1. Źródła azotu: -NH3, -NH2, -NO3, NO2, -N2

2. Źródła siarki: SO4, S203, S

3. Źródła energii:

1. Chemautotrofy: pochodząca z utleniania:

• Związków nieorganicznych (np.-NH3)

• Związków organicznych

1. Fotoautotrofy: energia świetlna

IZOLOWANIE CZYSTYCH KULTUR

Klon – mikroorganizmy pochodzące od jednej komórki – jednorodne genetycznie (czysta kultura)

Szczep – mikroorganizmy jednego gatunku wyprowadzone z różnych klonów (poszczególne szczepy tego samego gatunku mogą różnić się właściwościami, dlatego mogą rosnąć na różnych pożywkach)

1. Posiew redukcyjny na agarze odżywczym (zestalenie agar-agarem – ciekły do 44st.C, topi się 85st.C) – robi się różne wzorki na płytkach, żeby rozcieńczyć naszą hodowle na płytce.

2. Metoda płytek lanych – rozcieńczamy hodowlę komórek w probówkach z użyciem płynu fizjologicznego (najczęściej 10^-1), następnie z kilku kolejnych probówek pobieramy komórki i wylewamy na płytkę, którą zalewamy płynnym agarem, mieszamy pipetą, by równomiernie rozprowadzić komórki, gdy agar się zestala, kom zatrzymują się w tych miejscach, w których się obecnie znajdują, przechowuje się je do góry dnem

3. Metoda szeregu rozcieńczeń – różni się tym, że posiew wylewamy na gotową płytkę z agarem. Na płytkę posiew wylewamy pipetą i rozprowadzamy równomiernie. Dążymy do tego, żeby kolonii było jak najmniej.

PRZECHOWYWANIE MIKROORGANIZMÓW

Przechowywanie nie powinno wpłynąć na cechy morfologiczne i chemiczne naszej hodowli

1. Skosy mikrobiologiczne – podłoża stałe w probówkach – najprostszy sposób, probówki zakleja się i umieszcza w lodówce

2. Wkłucia w podłoża stałe – stosuje się do mikroorganizmów beztlenowych, bo wprowadza się je do dna naszej probówki i zakleja ją parafiną – odcina się tlen, zmniejsza ich metabolizm

3. Liofilizacja – I etap: schładza się hodowle szybko do -700 stopni (nie niszczą się struktury), następnie II etap: suszy się pod próżnią (wody nie może być więcej niż 1%), ważne jest stosowanie czynników ochronnych stabilizujących białka, enzymy, żeby ich nie uszkodzić

4. Ciekły azot – stabilizacja glicerolem lub DMSO – w stężeniu 5-10% w stosunku do roztworu. Glicerol jest dobry, bo utrwala białko

PODŁOŻA MIKROBIOLOGICZNE

skład podłoża zawsze jest podawany dla podłoża płynnego

1. Syntetyczne – zdefiniowane:- minimalne – bazowe; optymalne – pełne; minimalne składa się z szeregu związków organicznych, takich, które są potrzebne tylko do przeżycia i minimalnego wzrostu; aby uzyskać maksymalny wzrost stosuje się optymalne, które nie jest zazwyczaj specyficznie określone

2. Niezdefiniowane – kompleksowe; naturalne

- bulion odżywczy – najprostsze podłoże naturalne – wyciąg mięsny, pepton, NaCl, zasady organiczne, kreatynina, witaminy

- agar odżywczy – to co wyżej z dodatkiem agaru (agar stosuje się, bo nie jest on wykorzystywany przez mikroorganizmy)

HODOWLE WZBOGACAJĄCE, NAMNAŻAJĄCE

Stosuje się je, gdy chcemy wyizolować czystą kulturę, ważne jest częste przeszczepianie hodowli, pożywkę stosuje się pod tylko jeden typ mikroorganizmów, preferując ich wzrost

Selektywne faworyzowanie jednego gatunku – izolacja – inhibitor będzie faworyzował jeden mikroorganizm, a hamował wszystkie inne

Podłoża selektywnie różnicujące (np. Podłoże Mac Conkey’a – rozróżnienie w obrębie pałeczek – koliformy (E. coli, Salmonella, Shigella))

Przebieg procesu różnicowania:

• fiolet krystaliczny –inhibicja G(+)

• fermentacja laktozy (E. coli) obniża pH, wtedy czerwień obojętna zyskuje kolor czerwony

• sole żółciowe krystalizują na żółto wokół kolonii, które fermentują laktozę

• brak fermentacji laktozy – barwa biała wokół kolonii – Salmonella, Shigella

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA WZROST MIKROORGANIZMÓW

1. pH – nawet najmniejsza zmiana ich stężenia może bardzo wpłynąć na właściwości pożywki (są to najszybciej poruszające się jony), ważne jest też, żeby pH nie zmieniało się znacząco podczas hodowli– bakterie preferują alkaiczne pH=8, a grzyby poniżej 7, neutrofile w pH obojętnym, acydofile w kwaśnym, alkalofile w zasadowym. Może dojść do samozatrucia hodowli, dlatego pożywki muszą być wcześniej buforowane (np. bakterie preferujące wyższe pH mogą wydalać jakiś kwas i może dojść do samozatrucia)

2. Stosunek do obecności tlenu – stężenie tlenu w probówkach jest najwyższe na górze, a najniższe na dole (wyróżniamy: aeroby – wymaga obecności tlenu, anaeroby – tlen jest dla nich toksyczny, anaeroby fakultatywne, anaeroby tolerujące O2 te dwie mogą rosnąć przy obecności i przy braku tlenu – energie pobierają albo na zasadzie fermentacji albo z oddychania komórkowego, mikroacerofile – wymagają niskich stężeń tlenu)

3. Stosunek do temperatury

• punkt śmierci cieplnej – temperatura, w jakiej hodowla ginie w ciągu 10 minut

• czas śmierci cieplnej – minimalny czas potrzebny do zabicia hodowli w danej temperaturze

• - temperatura optymalna – temperatura, przy której organizm osiąga optymalne tempo wzrostu – nie idzie w parze z temperaturą optymalną enzymów – używana przy intensywnych namnażaniu, ale czasami, gdy obserwujemy proces metaboliczny warto ją zmienić pod względem temperatury optymalnej danego enzymu.

• - temperatura minimalna i maksymalna – temperatura, po przekroczeniu której organizm zamiera

• - psychrofile – optimum 15 stopni (0-20)

• - mezofile – optimum 30 stopnii (20-40)

• - termofile – (40-70)

• -termofile ekstremalne – (65-90)

• - hipertermofile

4. Ciśnienie

• Hydrostatyczne – barofile – wymagają bardzo wysokiego ciśnienia

• Osmotyczne – osmofile (np. 7,5% NaCl – Staphylococcus aureus)

• Halofile – obligatoryjne osmofile – nie stężenie soli, a np. stężenie cukrów czy innych czynników

DYNAMIKA WZROSTU BAKTERII

1. Szybkość wzrostu – czas generacji – czas potrzebny komórce do podzielenia się (czas pomiędzy podziałami)

2. Charakterystyka wzrostu w hodowli stacjonarnej (ograniczenia: ubytek składników odżywczych; toksyny)

• Lag faza – komórki rosną nie dzielą się – od momentu zaszczepienia do rozpoczęcia podziałów

• Faza logarytmiczna – stały czas generacji; najszybszy wzrost; do zmian w podłożu; komórki fizjologicznie identyczne; wzrost zrównoważony – jednakowe zmiany składu chemicznego

• Faza stacjonarna – stała liczba komórek – równowaga; spada dynamika anabolizmu, w ostatnich chwilach degradują białka, rybosomy, wszystkie rezerwy zapasowe

• Faza zamierania – spada liczba komórek; spory; cysty, ciała olbrzymie – w pożywce nie ma już nic, komórki giną z powodu toksyn i braku substancji odżywczych

DIAUKSJA – WZROST DWUFAZOWY – PODWÓJNY CYKL WZROSTU

Wymaga indukcji enzymów umożliwiających wykorzystanie nowego źródła węgla dostarczonego do podłoża

Wzrost dwufazowy obserwowany jest przy mieszaninie substratów. Najpierw wytwarzane są enzymy do trawienia np. glukozy, dopiero gdy stężenie glukozy spadnie do zera rozpoczyna się syntetyzowanie enzymu rozkładającego np. sorbitol i znowu mamy wzrost logarytmiczny dopóki on się nie skończy w pożywce

OZNACZANIE LICZBY MIKROORGANIZMÓW W OKREŚLONEJ OBJĘTOŚCI (INOCULUM)

Liczbę mikroorganizmów wyznacza się najczęściej dla hodowli synchronicznych – populacja komórek dzieląca się w tym samym czasie (temperatura, składniki odżywcze, światło, filtry)

1. Wyznaczanie całkowitej liczby komórek mikroskopowo – liczy się zarówno komórki żywe i martwe – próbkę dzieli się na kwadraty i liczy w nich komórki, następnie wydziela się średnią. Nie powinno się brać pod uwagę kwadratów stykających się by uzyskać jak najwiarygodniejszy wynik

2. Wyznaczanie liczby żywych komórek – metoda płytkowa szeregu rozcieńczeń

PRZEDŁUŻANIE HODOWLI – HODOWLE CIĄGŁE – UKŁAD OTWARTY

1. Chemostat – w nim prowadzi się hodowle, jest ciągle napowietrzany, gdyż napowietrzanie sprawia, że metabolity i pożywka są równo rozmieszczone, podobnie stężenie tlenu – nie da się rozróżnić faz jak dla stacjonarnego

2. Turbidostat – stała gęstość optyczna hodowli – ciężej jest utrzymać hodowlę o stałej gęstości optycznej, dlatego jest stosowany rzadziej

KONTROLA WZROSTU MIKROORGANIZMÓW

Sterylność – brak wszelkich form mikroorganizmów

Aseptyczność – brak organizmów zakażających i czynników infekcyjnych

Wzrost bakterii można kontrolować poprzez:

• Filtrowanie

• Zabijanie (czynniki bakteriobójcze) – przeprowadzają lizę komórek

• Zahamowanie wzrostu, reprodukcji (czynniki bakteriostatyczne) – po ich usunięciu hodowla ma szansę na normalny rozwój, bo tylko hamują podziały a nie niszczą komórki

Filtry membranowe – pory są mniejsze niż średnica bakterii, bakterie zostają na filtrze:

• Celuloza – octan celulozy

• Prasowana ziemia okrzemkowa

• Syntetyczne polimery: nylon, nitroceluloza – obecnie najpowszechniej stosowany

TEORIA STERYLIZACJI – ZABIJANIE MIKROORGANIZMÓW

Wynikiem sterylizacji jest zamieranie expotencjalne

Skuteczność zależy od:

1. Czasu ekspozycji

2. Gatunku

3. Liczebności populacji

4. Typu czynnika

Szczepy diagnostyczne: Bacillus stearothermophilus; Clostridum – za ich pomocą sprawdza się skuteczność sterylizacji, wkłada się je do rzeczy, które się sterylizuje, a potem, jeżeli na bibułce zawierającej spory coś rośnie, to sterylizacja źle poszła

Czynnik	Warunki	Zastosowanie
Temperatura - Suche powietrze	160st./3h 180/2h	szkło laboratoryjne suszarki
Temperatura - Wilgotne powietrze	121st/15 1,5atm	Podłoża, autoklaw
Temperatura - wilgotne powietrze Pasteryzacja Tyndalizacja	62st/30’ 71,7st/15’’ - flash 3x pasteryzacja	podłoża żywność, których walory mogłyby ulec zmianie w wyższej temperaturze do przetrwalników
Filtracja	pory: 00,5-02mikom	substancje płynne, które nie mogą być podgrzewane
Promieniowanie UV		sterylizacja gazów, powierzchni
Promieniowanie γ		zabezpieczenie żywności

ZAHAMOWANIE WZROSTU:

1. Związki nieselektywne – syntetyczne – hamują wszystko – syntetyzowane w laboratorium

• Anyseptyki – hamują wzrost lub zabijają na powierzchniach żywych tkanek

• Dezynfektanty – na przedmiotach martwych

1. Związki selektywne – antybiotyki – hamują tylko wybrane mikroorganizmy – zazwyczaj pochodzenia naturalnego

DZIAŁANIE ZWIĄZKÓW CHEMICZNYCH (linia ciągła – komórki żywe, linia przerywana – wszystkie komórki)

ANYTSEPTYKI I DEZYNFEKANTY

1. ALKOHOLE – denaturują białka, rozpuszczają lipidy – antyseptyki skóra – spory i wirusy oporne (np. etanol – wysoki koszt, izopropanol)

2. Aldehydy – alkilują: -NH2, -SH, -COOH – dezynfektanty zabijają spory – toksyczne

3. Halogenowce – dezaktywują białka, reagują z Tyr, czynniki silnie utleniające – antyseptyk, skóra, oczyszczanie wody, żywności – barwią skórę, poprzez reakcję z wodą stają się toksyczne (np. jodyna, betadyna (roztwór jodu w detergencie), chlor)

4. Metale ciężkie – chronią przed grzybami, glonami, strącanie białek, reakcja z –SH – glono-, grzybobójcze, antyseptyki do oczu oraz dezynfektanty – toksyczne ( w postaci soli np. CuSO4, AgNO2, chlorki rtęci)

5. Gazy – reagują z wieloma składnikami komórek, alkilują związki organiczne – dodatki do żywności, soków, sterylizacja substancji wrażliwych na temperaturę, dobra penetracja, sporobójcze – drażniące oczy, układ oddechowy, palne, potencjalne kancerogeny (np. tlenek siarki(IV), tlenek etylenu, propiolactone)

6. Detergenty kationowe (z długim łańcuchem węglowodorowym, czwartorzędowe aminy) – niszczą błony cytoplazmatyczne – antyseptyki- skóra dezynfektanty – łatwo inaktywowane- niskie pH, związki organiczne, fosfolipidy (aktywne tylko w okolicach pH neutralnego)

7. Fenole – denaturacja białek, niszczą błony cytoplazmatyczne – dezynfektanty w wysokich stężeniach, dodatki do mydeł w niskich stężeniach (setne procenta) – bardzo toksyczne

METRIOLAT – ANTYSEPTYK – TIOSALICYLANRTĘCIOWY

Związek, który jest stosowany w postaci soli sodowej, jest to również pochodna fenolu

HEKSACHLOROFENOL

Bardzo toksyczny związek. Toksyczność 1/1000000 1PPM Staphylococci

WYZNACZANIE SKUTECZNOŚCI DZIAŁANIE DEZYNFEKTANTÓW

TEST FENOLOWY; WSPÓŁCZYNNIK FENOLOWY

MODEL Staphylococcus aureus – bo bardzo odporny na wszelkie dezynfektanty

Roztwór bakterii pobiera się do dwóch probówek. W jednej dodatkowo roztwór fenolowy, w drugim dezynfektant. Po pewnym czasie nie jesteśmy w stanie ocenić, czy bakterie w danych probówkach bakterie wyrosły, czy nie. Dlatego z każdej probówki wykonuje się posiew na osobną szalkę i dopiero się sprawdza. Porównuje się wartość, dla której nie obserwowano wzrostu w teście fenolowym.

ANTYBIOTYKI – HAMOWANIE WZROSTU; ZABIJANIE

Antyseptyki i dezynfektanty działały powierzchniowo. Do związków działających selektywnie należą antybiotyki. Mają one działanie albo bakteriostatyczne, albo bakteriobójcze.

W 1941 Fleming odkrył penicylinę, ale nigdy nie użył jej klinicznie. Dopiero Florey i Chain wyizolowali penicylinę i testowali ją na myszach. Z izolacją penicyliny był problem, ponieważ uważano, że czynnikiem bakteriobójczym był enzym lizozym. Dopiero potem okazało się, że nie jest to enzym, a związek chemiczny. Aleksander Fleming w 1945 otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny, razem z Howardem Floreym i Ernstem Chainem. Dodatkowo Flemingowi zawdzięczamy odkrycie lizozymu.

ANTYBIOTYK NAURALNY – produkowany przez jeden mikroorganizm by zabić lub zahamować wzrost innego. Substancje, które eliminują konkurentów do zasobów pokarmowych.

Selektywność działania obejmuje unikalne struktury i procesy charakterystyczne wyłącznie dla mikroorganizmów. (czyli do czegoś, co nie występuje w naszym organizmie) – założenie, nie zawsze da się to zrobić

INDEKS TERAPEUTYCZNY LEKU – minimalna dawka, która jest toksyczna dla gospodarza podzielona przez minimalną dawkę terapeutyczną

Spektrum działania, można określić poprzez antybiogram – pozwala na określenie, które bakterie są wrażliwe na działanie antybiotyku i w jakim stężeniu musi on być użyty; powinno się najpierw zrobić antybiogram, dopiero podawać antybiotyk:

1. Szerokie

2. Wąskie – najczęściej, działają na jeden gatunek lub rodzaj bakterii (np. na bakterie o strukturze ściany komórkowej Gramm dodatniej, a ujemnej już nie)

TYP DZIAŁANIA:

1. Inhibitory syntezy ściany komórkowej – idealny cel, bo komórki zwierzęce nie posiadają ściany komórkowej

2. Biosyntezy białek- może być toksyczny również dla organizmu eukariotycznego

3. Biosyntezy DNA – jak wyżej

4. Zaburzające struktury i funkcje błon cytoplazmatycznych – jak wyżej

INHIBITORY SYNTEZY ŚCIANY KOMÓRKOWEJ

Skutek – autoliza komórek – bo brak ściany prowadzi do lizy komórek, można powiedzieć, że są też bakteriolityczne

• PENICYLINY – β – laktamy – inhibicja enzymów syntezy ściany komórkowej

Cel: G(+); Spirochetae; niektóre ziarniaki G(-)

Obrona – penicylinaza – beta – laktamaza Staphylococcus; G(-) – bardzo często mikroorganizmy mają systemy obronne, syntetyzują enzym hydrolizujący antybiotyk, naturalny mechanizm obronny

Penicillium chrosogenum, Penicillium notatum – grzyby, które syntetyzują penicylinę

• Penicylina G – naturalny produkt, wiele wad: wrażliwy na kwasy żołądkowe, nie może być podawany doustnie; jest źle tolerowany przez bardzo wielu ludzi, wywołuje reakcję, która może prowadzić do śmierci

• Penicyliny semisyntetyczne – modyfikacje penicyliny pochodzenia naturalnego, półsyntetyczne

• Penicylina V – podstawiony tlen obok CH2, już jest odporna na kwasy, można podawać doustnie

• Ampicillin – centrum aktywnym wciąż jest betalaktan, jest aktywne w stosunku do tych samych bakterii, ma dodatkową grupę aminową; szerokie spektrum działania, odporna na kwasy, zatem można podawać doustnie

• Methicillin – brak grupy CH2, wprowadzone do pierścienia dwie grupy CH3, odporna na penicylinazę

• Oxacillin – odporna na kwasy, odporna na penicylinazę

• Cefalosporyny

Cephalosporium – grzyb – cefalosporyna C- pierwszy wyizolowany antybiotyk

Wrażliwe na cefalosporynazę – też beta – laktanaza

• Pierwsza generacja cefalosporyn – stosowana przeciwko ziarniakom G(+), także Staphylococcus aureus – dwa rodzaje Cephalexin i Cephalothin; Pierwsza generacja cefalosporyn ulegała hydrolizie przez beta-laktamazę z pałeczek G(-)

• Druga generacja – stosowana przeciwko: Porteus, Enterobacter, Citrobacter; Stracił wrażliwość na cefalosporynazę. Część w nawiasie pochodzi z naturalnego źródła (Cefamandole, Cefoxitin)

• Trzecia generacja – bardzo ważne antybiotyki, jako jedne z niewielu mogą osiągać płyn mózgowo – rdzeniowy i likwidować zapalenia opon mózgowych wywoływanych bakteryjnie przez pałeczki G(-) – Cefotaxime, Cefoperazone – oporne na enzym cefalosporynazę

• Czwarta generacja –

• Thienamycyna – beta-laktam – Streptomyces catley – też beta laktan, ale zupełnie innego pochodzenia (bakteryjnego, czyli prokariotycznego a nie eukariotycznego, jak u wcześniejszych)

Pochodna: IMIPENEM – odporny na beta-laktamazy, penicylinazy, cefalosporynazy

Inhibitory bata-laktamaz: Streptomyces clavuligenes – Inihibitor kompetycyjny – kwas klawulinowy przy antybiotykach, dzięki niemu antybiotyk jest skuteczny, bo znosi działania hydrolityczne beta-laktamazy

• Vancomycyna – glikopeptyd – Streptomyces (pochodzenia prokariotycznego) blokuje sieciowanie ściany komórkowej, wąskie spektrum: ziarniaki G(+)

• Bacitracyna – peptydowy – Bacillus licheniformis (pochodzenie prokariotyczne) – zewnętrzne stosowanie, głównie ziarniaki G(+)

INHIBITORY BIOSYNTEZY BIAŁEK

• Bakteriostatyki – nie ma skuteczności od razu po podaniu, wymaga czasu

• Trwale wiążą podjednostkę 50s rybosomów – podjednostka charakterystyczna dla organizmów prokariotycznych

• Może się zdarzyć, że będą toksycznie wpływać na komórki eukariotyczne,

• Streptomyces sp.

1. Chloramphenicol

2. Makrolidy – erytromycyna

AMINOGLIGOZYDY – BAKTERIOBÓJCZE

Wpływają na wydłużanie łańcucha polipeptydowego:

1. Streptocycyna; wiąże 30s i białko Streptomyces grisens

2. Gentamycyna Micromonospora purpurea – zupełnie inny niż beta-laktan

3. Kanamycyna Streptomyces kanamyceticus

4. Syntetyczne – obecnie najszersze spektrum, stosowane są pod kontrolą lekarza, klinicznie

• Tobramycyna

• Amikacyna

Tetracykliny – Streptomyces sp. – wpływają na biosyntezę białek, wysoka toksyczność (wywołują ogólne złe samopoczucie, nudności), inicjacja biosyntezy białek – silnie wiążą się z białkami; szerokie spektrum działania

ANTYBIOTYKI WPŁYWAJĄCE NA BŁONY KOMÓRKOWE

Polimyksyna B – bacillus poplymyxa (prokariotyczny organizm) – wysoka toksyczność, łączy się z fosfolipidami. Cel: G(-); Pseudomonas aeruginosa

ANTYBIOTYKI WPŁYWAJĄCE NA BIOSYNTEZĘ RNA

Rifampina – Streptymces mediterranei (pochodzenia prokariotycznego) – hamuje biosyntezę bakteryjnego RNA – może być skuteczna w stosunku do bakterii, a dla eukariotycznego bezpieczna (synteza RNA w jądrze)

SYNTETYCZNE CHEMIOTERAPEUTRYKI SULFONOWE – SULFONOAMIDY

Najstarszy znany antybiotyk – stosowany już podczas II Wojny Światowej.

Kwas paraaminobenzoesowy jest kluczowy przy syntezie kwasu foliowego B9 (witaminy B9). Te leki będą skuteczne w stosunku do bakterii, które same sobie nie mogą jej syntetyzować

SYNTETYCZNE LEKI SULFONOWE. SZLAK SYNTEZY KWASU FOLIOWEGO

Paraaminosulfonamid – stosowano w czasie I Wojny Światowej

Te związki działają na wszystkie organizmy, które muszą dostarczać jakoś witaminę B9. Zawsze są to związki sulfonowe

INNE ZWIĄZKI SYNTETYCZNE

1. Inhibitory biosyntezy kwasu foliowego – nie oparte o strukturę sulfonoamidu. (np. kwas paraaminosalicylowy, trimethoprim- bardzo skuteczny związek stosowany zewnętrznie)

2. Przeciw Mycobacterium sp. – hamują syntezę kwasu mykolowego (np. isoniazid, ethambutol)

3. Hamuje replikację DNA u bakterii (np. quinolon- jego część aktywna, analog kwas azotowych, wbudowywany w miejsce zasad azotowych). U bakterii DNA wyeksponowany – znajduje się w cytoplazmie. U eukariotów znajduje się w jądrze, co stanowi barierę

ANTYBIOTYKI SKIEROWANE PRZECIWKO GRZYBOM

Bardzo ciężko stworzyć taki, aby był też bezpieczny dla człowieka, ponieważ są to organizmy eukariotyczne, mają podobne struktury związane z biosyntezą białek, DNA.

1. Nystatyna – Streptomyces noursei – nie jest wchłaniana w układzie pokarmowym, działa w układzie moczo-płciowym, podaje się razem z antybiotykiem przeciw bakteriom, żeby utrzymać w równowadze populacje grzybów i bakterii

2. Amphoterycyna B – Streptomyces nodosus

3. Griseofulvin – Penicillium griseofulvum

WRAŻLIWOŚĆ NA CZYNNIKI ANTYBAKTERYJNE

MIC – minimalne, efektywne – inhibitorowe stężenie czynnika

MLC – minimalna dawka śmiertelna (stężenie) – letalna

1. Metoda dyfuzyjna – bibułki nasiąknięte antybiotykami; dyfunduje on z krążka, im dalej od niego tym mniejsze stężenie antybiotyku. Umieszcza się je na podłożu z posiewem bakterii. Na jednej płytce umieszcza się kilka różnych antybiotyków i obserwuje, który antybiotyk działa bakteriobójczo. Dzięki temu wykonuje się antybiogram. Może być też ten sam antybiotyk, a inne stężenia.

2. Metoda rozcieńczeń – wyznaczanie MIC – wyjściowa hodowla drobnoustrojów do kilku probówek. Pozwala wyznaczyć stężenie, ale mamy tylko jeden antybiotyk. Po 24h kontaktu bakterii z antybiotykiem – posiew na płytkę i sprawdzamy, gdzie jest wzrost bakterii.

3. Metoda łączona – test dyfuzyjny w połączeniu z testem rozcieńczeń

OBSERWACJE MIKROORGANIZMÓW

PREPARATY MIKROSKOPOWE

1. Przyżyciowe – bezpośrednio z hodowli, nie musimy niczego przygotowywać

2. Barwione (utrwalone) – aby móc go wykonać, trzeba zakotwiczyć bakterie na szkiełku podstawowym (utrwalanie), bo nakłada się barwnik, a potem się usuwa, spłukując go (gdyby bakterie nie były utrwalone, zostały by spłukane)

• Pozytywne – zabarwieniu ulega komórka bakteryjna

• Negatywne – barwienie tła, na którym znajdują się drobnoustroje, najczęściej na ciemnym tle

• Złożone – najczęściej jest to barwienie diagnostyczne, przynosi pewne informacje o klasyfikacji drobnoustrojów, pozwala odróżnić grupy bakterii; trzeba użyć najczęściej więcej niż jednego barwnika

• Proste – jednym barwnikiem; może pozwolić obserwować kształt (barwnik wnika do wewnątrz komórki); pozwala też obserwować struktury zewnętrzne (rzęski i wici)

UTRWALANIE PREPARATÓW

1. Utrwalanie temperaturowe – ogrzewa się preparat od dołu (z przeciwnej strony od tej gdzie znajdują się bakterie), następnie się spłukuje

BARWIENIE POZYTYWNE PROSTE

- używa się fiolet krystaliczny – niezależnie od tego czy gram + czy gram –

BARWIENIE NEGATYWNE

- komórki żywe barwnika nie przyjmują, komórki martwe mogą czasami się wybarwić

PRZYKŁADY BARWIENIA ZŁOŻONEGO (RÓŻNICUJĄCEGO)

RÓŻNICUJĄCE BARWIENIE GRAMA – podstawowe pierwsze barwienie diagnostyczne, daje informacje o biochemicznej strukturze ściany komórkowej bakterii

Procedura	G(-)	G(+)
Utrwalenie płomieniem, barwienie fioletem krystalicznym – 1min	Odbarwiają się	Odbarwiają się
Płyn Lugola – 1min – utrwala barwnik, chemicznie wiąże się z barwnikiem	Wciąż jest zabarwione, ale zostanie wymyte	Pozwala na zatrzymanie barwnika tylko dla G(+)
Przemycie alkoholem odbarwienie G(-)	Cały barwnik znika	Barwnik pozostaje
Barwnik kontrastowy dobarwienie G(-) – etap, który tylko ułatwia obserwację, najczęściej barwnik bardzo jasno różowy, najczęściej jest to fuksyna	Lekkie zabarwienie	Mocne zabarwienie

WIELKOŚĆ BAKTERII [mikrometry]

Małe bakterie:

Bdellovbrie bacteriovorus 0,2-0,5 x 0,5-1,4

Bordetella pertussis 0,2-0,5 x 0,5-1,0

Coxiella burnetii 0,2-0,4 x 0,4-1,0

Treponema pallidum

Średnich rozmiarów – do 5 mikrometrów

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Duże bakterie – 5 do 100 mikrometrów

KSZTAŁTY BAKTERII

1. Cylindryczne – pałeczki, laseczki

2. Ziarniaki – owalne łańcuszki, dwoinki, czworaczki (tetracoccus), pakietowce (sześcianki) – po podziale zostają połączone, nie oddzielają się od siebie

3. Śrubowce – formy największe, olbrzymie bakterii, ale występują też małe (zawierają wić, wić peryplamatyczną)

BAKTERIE WŁAŚCIWE – WIELKOŚĆ I FORMA

Eubacteriae

JAK TWORZA SIĘ SKUPISKA?

Podział poprzeczny – Bacillus subtilis – odrębne organizmy, które pozostają w skupisku po podziale dzięki wydzielaniu pochodnych węglowodanów

PROMIENIOWCE – WIELKOŚĆ I FORMA – ACRINOMYCETALES

• Początkowo były klasyfikowane jako grzyby, jednak okazało się, że są to organizmy prokariotyczne

• Cechy: Nieregularne, pałeczkowate człony i rozgałęzienia

• Najbardziej patogenne są z rodzaju Nocardia, drugim ważnym z punktu widzenia biotechnologicznego jest Streptomyces – bakterie, przypominające pleśnie, widoczne gołym okiem, tworzą skupiska pojedynczych organizmów – to nie są pseudotkanki, wywołuje różne choroby

• Promieniowce bardzo trudno hodować. Czasami rosną do 20 dni, zanim masa się powiększy i to nieznacząco. Oznacza to, że te szczepy mają bardzo długi czas generacji.

SINICE – WIELKOŚĆ I FORMA – CYJANOBACTERIE

• Zróżnicowane kolonie – długie nitki złożone z wielu komórek

• Wytwarzają chloroplasty i są zdolne do fotosyntezy.

• Występuje polimorfizm – trudno je zaliczyć do jednej rodziny (stąd początkowe problemy z ich klasyfikacją – początkowo do glonów)

• Ważna w biotechnologii spirulina – wykorzystuje się ją, jako źródło białka SCP (drugim organizmem jego pozyskiwania są drożdże), jego źródłem jest organizm jednokomórkowy

• Kolejnym ważnym szczepem jest Oscillatoria

BAKTERIE POCHEWKOWE – WIELKOŚĆ I FORMA – CHLAMYDOBACTERIE

• Również odrębne organizmy, wytwarzane wewnątrz poliwęglanowej struktury, zwanej pochewką, mogą przyjmować różne kształty

• Chlamydie – często wywołują choroby, zwłaszcza układu oddechowego, również układu krwionośnego – długi okres zakażenia do wytworzenia przeciwciał, często można zakazić się w krajach tropikalnych

BAKTERIE SIARKOWE – WIELKOŚC I FORMA

• Mają zdolność do fotosyntezy beztlenowej – zewnętrzny donor pary elektronowej to siarkowodór

• Chromatiaceae – purpurowe bakterie siarkowe, pleomorfizm – różne kształty

• Beggiatoaceae – bakterie siarkowe, nitki zbudowane z kubicznych komórek (krętki, pochewki – różne formy)

BAKTERIE STYLISKOWE – WODNE – FORMA I KSZTAŁT

• Osiadły tryb życia – zakotwiczone do dna zbiornika wodnego

• Stadium „larwalne” – odrywa się i pływa, dopiero potem wytwarza łodyżkę, którą się zakotwicza w dnie

KRĘTKI – FORMA I KSZTAŁT – SPIROCHAETEAE

• Wśród nich największe bakterie (do 100 mikrometrów)

• W większości przypadków nie można ich hodować poza organizmem gospodarza, są patogenne i żyją w tkankach

• Krętki są odstępstwem od postulatów Kocha

BAKTERIE SŁUZOWE – KSZTAŁT I FORMA, PLEOMORFIZM – MYXOBACTERIALES

• Ciała owocowe – bakterie wytwarzają dużą ilość śluzu, w którym przemieszczają się za pomocą rzęsek do jednego, ściśle określonego miejsca, wydzielają związki chemiczne, wabiące bakterie, dzięki czemu tworzą się ciała owocowe – w nich znajduje się wiele milionów komórek bakteryjnych

• Cecha charakterystyczna – zdolność do ruchu ślizgowego – poruszają się bardzo szybko – dzięki wytwarzaniu śluzu

BAKTERIE AMEBOIDALNE – KSZTAŁT I FORMA – HYPHOMICROBIALES

• Połączenia utworzone z wyrostków cytoplazmatycznych – komórki tworzą skupiska, łączą się za pomocą wypustek – łącznikiem są substancje węglowodanowe oraz wypustka cytoplazmatyczna

MYKOPLAZMY – FORMA I KSZTAŁT – MYCOPLASMATALES

• Wyłącznie patogeny, pleomroficzne, tworza ciała olbrzymie – można obserwować je pod niewielkim powiększeniem mikroskopu świetlnego

• Bardzo długo nie traktowano ich jako odrębne organizmy, bardzo trudne do sklasyfikowania, przez dużą ilość wypustek

• Charakterystyka powstała niedawno

• Wywołują choroby układu oddechowego

RIKETSJE – FORMA I KSZTAŁT

• Żyją tylko w komórkach gospodarza (komórkach zwierzęcych)

• Tych bakterii nie możemy obserwować pod mikroskopem świetlnym – powiększenie większe niż 100 krotne

BUDOWA BAKTERII

SCHEMAT BUDOWY KOMÓRKI PROCARYOTA

BUDOWA I SKŁAD CHEMICZNY BAKTERII

• Woda do 87% mokrej masy – bardzo istotny składnik, komórki bardzo wrażliwe na wysychanie – istotną sprawą higieny jest wycieranie wszystkiego do sucha – woda to źródło rozwoju mikroflory

• Bakterie wykształciły mechanizmy obronne – niektóre wytwarzają przetrwalniki – niewrażliwe na temperatury 100 i więcej stopni Celsjusza

• Bardzo podobny skład chemiczny do komórek eukariotycznych

• Węgiel – ok 60%

• azot – ok 10%

• popiół – ok 10%

• białka – 60%

• rybosomów – do 10%

• kwasy rybonukleinowe RNA – do 20%

• DNA – do 3%

• Wielocukry – do 10%

• Lipidy – ok 10% (od 3 do 23) – znaczne zróżnicowanie

• U bakterii brak metylocytozyny – zmodyfikowana chemicznie cytozyna z grupą metylową (zwierzęta 6%, rośliny 30%)

• Występuje metyloaminoadenina (2,4% w stosunku do adeniny)

Cecha diagnostyczna bakterii – DNA: A+T/C+G

• Można sekwencjonować DNA, ale można zrobić coś prostszego (w przypadku DNA wyizolowanie jest prostsze, można hydrolizować i frakcjonować w prosty sposób, i można określić stosunek adeniny i tyminy do cytozyny i guaniny), sekwencjonowanie jest znacznie trudniejsze

• W przypadku niektórych bakterii ta wartość jest ściśle zdefiniowane – brak tolerancji – w niektórych przypadkach zatem daje nam możliwość zakwalifikowanie do określonego rodzaju

INNE CECHY DNA:

• Nie związane z histonami

• Występują małe białka: HU – Escherichia, Hbs – Bacillus brak jednego uniwersalnego białka, różne w zależności od struktury bakterii

• Kationy: Ca2+ ; Mg2+

• Polikationy organiczne – odróżniają organizmy prokariotyczne od eukariotycznych – odróżniająca cecha

• Generalnie kationy neutralizują ujemnie naładowaną nić DNA, w przypadku prokariotów cząsteczka DNA występują w cytoplazmie, nie jest odizolowana od cytoplazmy, zatem musi być zneutralizowana

• Polikationy to: spermina, spermidyna, putrescyna; - polikationy zawierają dużą ilość grup aminowych – które łatwo ulegają uprotonowaniu

ROLA WITAMIN U BAKTERII

• Witaminy w przypadku bakterii pełnią taką samą funkcję jak u organizmów eukariotycznych

• Najczęściej tworzą grupy prostetyczne enzymów

• Nie wiadomo kto pierwszy zażywa witamin w przypadku infekcji bakteryjnej – czy ludzie, czy bakterie

POZOSTAŁE SKŁADNIKI CHEMICZNE

1. Cukry charakterystyczne dla bakterii polimery:

Granuloza, glikogen bakteryjny – materiały zapasowe, polimery glukozy, glukoza w różny sposób zmodyfikowana

Budulcowe – ściana komórkowa:

Lewany – polimery fruktozy

Mannany – polimery mannazy

1. Lipidy, ciała tłuszczowe (woski – bardzo dużo u prątków; estry fitoglicerolu, kwas tuberkulostearynowy (kwas tłuszczowy stearynowy zestryfikowany określonym ..), was fitonowy)

Brak steroli (tylko u sinic, bakterii zdolnych do fotosyntezy i pasożytniczych Mycoplasamtales)

Brak wielokrotnych wiązań nienasyconych – tylko i wyłącznie nasycone tłuszcze

Polimer kwasu hydroksymasłowego - materiał zapasowy, rezerwuar energii i szkieletów węglowych

OTOCZKI I ŚLUZY ZEWNĘTRZNE

• Nie wchodzą w skład ściany komórkowej – nie jest to ich trwały element

• OTOCZKI BAKTERYJNE: grube, gęste, szczelne – nie można ich usunąć z komórek bakteryjnych, skład zależny od klasy bakterii

• ŚLUZY BAKTERYJNE: rzadsze, mogą oddysocjować – można je usunąć bez szkody dla komórki bakteryjnej, w zależności od środowiska, głównie węglowodany

• BUDOWA OTOCZEK:

• Polisacharydy: glukoza, ramnoza, aminocukry;

• Kwas 2-ketodeoksygalaktynowy, kwas uronowy, pirogronowy, octowy i inne organiczne

• Polipeptydy: poliglumatiniany – jako składnik dodatkowy, głównie u Bacillus anthracis, b. subtilis

Rola otoczek – czasami warunkują patogenność, odporność na fagocytozę (nie mogą być fagocytowane przez białe krwinki krwi)

Streptococcus – te które wytwarzają otoczki są patogenne

ŚLUZY BAKTERYJNE:

• Ochrona przed czynnikami środowiskowymi, tworzenie skupisk, czasami warunkowanie ruchu ślizgowego

• (gallitonella ferruginea, Flexibacter, Cytophaga, Beggaitoa – tworza filamenty – trichomer – ruch wokół osi; niektóre sinice; Myxobacteriae – w kierunku ciał owocowych)

STUKTURA ŚLUZÓW

• Polisacharydowa – glikokaliks wydzielany na zewnątrz – mieszanina polimerów polisacharydów, które stanowią heteropolimery, niejednorodne polimery, każdy polimer posiada inne jednostki monomeryczne, w obrębie jednego polimeru też mogą być różne monomery

• Substancje bardzo lepkie – umożliwiają przemieszczanie bakterii oraz tworzenie ciał owocowych (tworzenie skupisk bakterii)

POCHEWKI BAKTERYJNE

Zewnętrzne rurkowate osłonki, głównie heteropolisacharydy: glukoza, kwas glukuronowy, galaktoza, fruktoza

CHARAKTERYSTYCZNE DLA:

• Bakterii nitkowatych – sphaerotilus natons, leptothrix ochracea

• Acetobacter aceti – celulozowa, skórzasta osłonka – mycoderma aceti (pseudoskóra, bardzo twarda, trudna do usunięcia)

• Sarcina ventriculi, lampropedia hyalina – celuloza jako spoiwo agregatów komórek