Bulion jest mieszaniną peptonu (produktu enzymatycznej hydrolizy białek), wyciągu mięsnego (ekstraktu zawierającego m.in. zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ciśnienia osmotycznego. Na bulionie dobrze rosną mikroorganizmy o średnich wymaganiach pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojów żyjących w środowiskach ubogich w pokarm (glebowych i wodnych), jest on zbyt bogatą pożywką, hamującą ich rozwój. Z kolei dla bardzo wymagających bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi być wzbogacony, np. o krew lub wyciąg drożdżowy. Tego typu pożywki określa się mianem wzbogaconych
Agar jest mieszaniną dwóch polisacharydów: agarozy i agaropektyny, które są polimerami galaktozy. Jest on wytwarzany przez pewne glony morskie z grupy krasnorostów, jako składnik ich ścian komórkowych. Produkuje się go w postaci proszku lub granulek. Po wymieszaniu z wodą i podgrzaniu do temp. 95-980C agar rozpuszcza się, a w trakcie schładzania zachowuje swoją płynną konsystencję do temperatury ok. 45-480C, kiedy krzepnie przechodząc w galaretowaty żel. Sam agar (tzw. agar-agar) nie jest pożywką dla większości bakterii, gdyż nie potrafią go rozkładać. Jest on używany wyłącznie do zestalania pożywek płynnych (w ilości 1,5-2 %). Dodany do bulionu odżywczego tworzy tzw. agar odżywczy, w skrócie MPA.
ZE WZGLĘDU NA WYMAGANIA ODŻYWCZE DROBNOUSTROJÓW
Pożywki proste zaspokajają niskie i średnie wymagania pokarmowe mikroorganizmów. Należą tu m.in. bulion i agar odżywczy. Stanowią one podstawę dla innych, bardziej złożonych pożywek.
Pożywki wzbogacone stosuje się do hodowli bardziej wymagających drobnoustrojów chorobotwórczych (np. paciorkowców i gronkowców), przystosowanych do życia w bogatym w substancje odżywcze środowisku wnętrza organizmu żywiciela. Czynnikiem wzbogacającym może być odwłókniona krew (często barania), wyciągi z narządów zwierzęcych, np. wątroby, wyciąg z drożdży, hydrolizat kazeiny – głównego białka mleka i inne.
Pożywki wybiórczo-namnażające są często pożywkami płynnymi i umożliwiają nie tylko wyosobnienie określonego drobnoustroju (który zwykle występuje w znikomej ilości), ale też namnożenie go do dużej biomasy umożliwiającej dalsze badania (np. identyfikacyjne). Przykładem może być podłoże z kwaśnym selenianem sodowym, stosowane do izolacji pałeczek Salmonella np. z produktów żywnościowych lub gleby (selenian jest tu czynnikiem hamującym wzrost drobnoustrojów gramdodatnich, a zwłaszcza ziarniaków).
Pożywki wybiórczo-różnicujące umożliwiają nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom, ale też pozwalają je zróżnicować. Przykładem może być pożywka Endo, często stosowana w sanitarnych badaniach środowiska. Pozwala ona rosnąć jedynie bakteriom gramujemnym, czyli jest dla nich wybiórcza (obecność w podłożu fuksyny hamuje rozwój bakterii gramdodatnich), ale też umożliwia zróżnicowanie wyrosłych bakterii na zdolne, i nie zdolne do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru powstaje bowiem aldehyd octowy, który daje czerwone zabarwienie po połączeniu się z fuksyną (dotąd bezbarwną, bo zredukowaną przez siarczyn sodu, również dodawany do pożywki). Dlatego bakterie fermentujące laktozę (jak pałeczka okrężnicy) tworzą kolonie koloru czerwonego z metalicznym (tzw. fuksynowym) połyskiem, a nie zdolne do fermentacji – koloru różowego lub bezbarwne.
Podłoża wybiórczo-różnicujące: np.
podłoża do hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: MacConkey, Endo, SS, Levina; podłoża do hodowli maczugowców: podłoże Clauberga z tulerynem potasu
podłoże do hodowli gronkowców: podłoże Champamana
podłoże do hodowli grzybów i pleśni: podłoże Saburoda
Podłoża specjalne: są to podłoża z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych substratów. Służą m.in. do określania cech hodowanych drobnoustrojów np. właściwości fermentacyjnych danego drobnoustroju, lub do wytwarzania specyficznych produktów metabolizmu takich jak: toksyny, antybiotyki itd. Przykładem podłoży specjalnych są pożywki wchodzące w skład tzw. szeregów biochemicznych używanych do identyfikacji bakterii – podłoże Kliglera, podłoże Stuarta (wykrywanie ureazy- Ureaza jest enzymem katalizującym hydrolizę mocznika)
ZE WZGLĘDU NA SKŁAD CHEMICZNY
naturalne – podłoże o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym zawierające wyciągi z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, hydrolizaty białkowe, itp.; M.in. bulion odżywczy, brzeczka, mleko odtłuszczone lub pełne;
syntetyczne – złożone ze związków chemicznych o ściśle określonym i znanym składzie chemicznym (jakościowym i ilościowym);
półsyntetyczne – są częściowo poznane pod względem składu substancji odżywczych, np. podłoże M9 wg Adamsa wzbogacone dodatkiem glukozy i autolizatu drożdży (do hodowli drobnoustrojów Proteus sp. i Escherichia sp.);
ZE WZGLĘDU NA KONSYSTENCJĘ
Pożywki płynne stosowane są zwykle do namnażania w celu otrzymania dużej biomasy komórek i pozyskiwania produktów ich metabolizmu. Przykładem może być bulion odżywczy, jedna z najczęściej używanych pożywek. Bulion jest mieszaniną peptonu (produktu enzymatycznej hydrolizy białek), wyciągu mięsnego (ekstraktu zawierającego m.in. zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ciśnienia osmotycznego. Na bulionie dobrze rosną mikroorganizmy o średnich wymaganiach pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojów żyjących w środowiskach ubogich w pokarm (glebowych i wodnych), jest on zbyt bogatą pożywką, hamującą ich rozwój. Z kolei dla bardzo wymagających bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi być wzbogacony, np. o krew lub wyciąg drożdżowy. Tego typu pożywki określa się mianem wzbogaconych (patrz niżej).
Pożywki stałe stosuje się głównie do izolacji czystych szczepów, przechowywania ich, do badań morfologii kolonii, oraz w badaniach ilościowych (określaniu liczby komórek w próbie). Do zestalania pożywek płynnych używa się głównie agar, a także żelatynę. W przypadku hodowli niektórych bakterii autotroficznych, wrażliwych na większe stężenia związków organicznych, stosuje się żel krzemionkowy, którym zestala się pożywkę mineralną.
Pożywki półpłynne mają konsystencję pośrednią między pożywkami płynnymi a stałymi, i zawierają 0,15-0,2 % agaru. Służą one do badania zdolności ruchu u bakterii.
Po zaszczepieniu słupka z agarem półpłynnym, bakterie zdolne do ruchu będą się przemieszczać i, dzięki małej gęstości agaru, zasiedlą całą objętość pożywki. W efekcie licznych podziałów, po okresie inkubacji powstanie zmętnienie w całej objętości słupka agarowego. W przypadku bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziały komórkowe spowodują jedynie wzrost wzdłuż linii wkłucia.
Wpływ czynników fizyko-chemicznych na drobnoustroje
Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników warunkujących wzrost i procesy
życiowe drobnoustrojów. Działanie na mikroorganizmy może mieć charakter bezpośredni:
wpływając na szybkość wzrostu, aktywność enzymów, skład chemiczny komórek,
wymagania pokarmowe, lub pośredni regulując rozpuszczalność związków
wewnątrzkomórkowych, transport jonów, dyfuzję substancji chemicznych i zmianę
właściwości osmotycznych błon komórkowych. Każdy gatunek mikroorganizmów charakteryzuje się trzema kardynalnymi temperaturami rozwoju: minimalną, optymalną i maksymalną. W temperaturze optymalnej mikroorganizmy rozwijają się najszybciej, natomiast powyżej temperatury maksymalnej i poniżej temperatury minimalnej wzrost mikroorganizmów jest niemożliwy.
Drobnoustroje ze względu na wymagania temperaturowe można podzielić na 4 grupy:
termofile, mezofile, psychrofile, psychrotrofy
1. Drobnoustroje termofilne (termofile - ciepłolubne) – to mikroorganizmy
charakteryzujące się wysoką optymalną temperaturą wzrostu w granicach 45-50ºC,
a niekiedy nawet wyższej od 60ºC. Większość termofili to bakterie gram-dodatnie
przetrwalnikujące np. Bacillus coagulans – przetrwalniki tych bakterii wyróżniają się wysoką ciepłoodpornością.
2. Drobnoustroje mezofile (mezofile – obojętnolubne) – to drobnoustroje rozwijające
się w temperaturach umiarkowanych. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się
zazwyczaj w zakresie od 20 do 45ºC. Wśród mezofili wyróżniamy organizmy
saprofityczne i większość gatunków chorobotwórczych dla człowieka np.
Salmonella sp., Staphylococcus aureus.
3. Drobnoustroje psychrofilne (psychrofile – zimnolubne) – to mikroorganizmy
rosnące już w temperaturach od 0ºC, o temperaturze optymalnej nie wyższej niż 15ºC
i maksymalnej - 20ºC. Wzrost mikroorganizmów psychrofilnych w niskich
temperaturach jest uwarunkowany aktywnością enzymów katalizujących reakcje
metaboliczne w tych temperaturach. Psychrofile znalazły dobre warunki do rozwoju
w regionach podbiegunowych, szczytach gór, jeziorach, morzach i oceanach strefy
umiarkowanej. Do tej grupy mikroorganizmów zaliczamy gatunki bakterii należące
do rodzajów: Alcaligenes, Bacillus, Psudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter.
4. Drobnoustroje psychrotrofowe (psychrotrofy) to mikroorganizmy, które bez
względu na swoje temperatury kardynalne posiadają zdolność rozwoju
w temperaturze ≤7ºC. Do psychrotrofów zaliczamy wszystkie psychrofile i część
mezofili.
Odczyn Dla każdego drobnoustroju wyróżnia się wartość optymalną odczynu, jego minimum i maksimum. Odpowiednie stężenie jonów wodorowych (którego ujemny logarytm oznacza się jako pH) ma poważny wpływ na rozwój komórek. Większość bakterii preferuje odczyn obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 – 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku kwaśnym (pH ok. 5,2 – 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn dość szybko się zmienia, z powodu powstawania produktów przemiany
materii. Aby utrzymać optymalny odczyn, pożywki przygotowuje się na bazie odpowiednich buforów
Ciśnienie osmotyczne Większość drobnoustrojów może rosnąć tylko przy określonym stężeniu soli, w roztworze izotonicznym (stężenie soli na zewnątrz i wewnątrz komórki są sobie równe). Komórki w roztworze hipotonicznym, gdy stężenie soli na zewnątrz komórki jest mniejsze i woda ma tendencje do wnikania do wnętrza, mogą ulec pęknięciu (dzięki ścianie komórkowej udaje im się jednak wytrzymać określony napór wody).
Z tego powodu do rozcieńczania prób w mikrobiologii nie stosuje się wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny - będący 0,85% roztworem NaCl.
W roztworach hipertonicznych (stężenie na zewnątrz jest większe) przeżywalność komórek zależy od zdolności do przeciwstawiania się wypływowi wody i wysuszeniu. Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania większych stężeń soli (do ok. 15%) określane są mianem osmotolerancyjnych (np. gronkowce), natomiast te, które wytrzymują jeszcze wyższe stężenia to tzw. osmofile lub halofile (niektóre archeony).
mutanty żywieniowe, auksotroficzne - mutacje w genie kodującym enzym z jakiegoś szlaku metabolicznego, utrata zdolności do syntezy produktu tego szlaku
Czynniki mutagenne: - promieniowanie jonizujące oraz nadfioletowe, - czynniki chemiczne wpływające na DNA lub proces replikacji DNA, - kwas azotowy III -HN02, który powoduje dezaminację (usuwa grupy NH2) zasad azotowych co prowadzi do zmiany zasad cytozyny na uracyl, itp.. - związki alkilujące (związki mające grupy alikilowe) np. pochodne iperytu. - analogi zasad np. 5 bromouracyl analog tyminy, - barwniki akrydynowe np. proflawina, akryflawina, oranż akrylowy, których działanie polega na deformacji helisy - powodując delecje lub inercje, - alkaloidy - kolchicyna prowadzące do poliploidalności, - czynniki metaboliczne np. deficyt jonów Ca i Mg, - wysoka temperatura, - sole met. ciężkich