Rozpoznanie laboratoryjne, wykrywanie w produktach spożywczych bakterii z rodzaju Staphylococcus

• Ziarenkowce gram +

• Tworzą groniaste skupiska ( kiść winogron), w produktach żywnościowych najczęściej w postaci dwoinek

• Względne beztlenowce, ale preferują warunki tlenowe

• Szybki wzrost na podłożach wzbogaconych, możliwy wzrost na podłożach wybiórczo – namnażających

Podział gronkowców:

• A. koagulazo - dodatnie np. Sareus

• B. koagulazo –ujemne ( CNS – coagulazo- negativ Staphylococcus )

• Oporne na nowobiocynę np. S. Saprophytiasm S. sciuri )

Występują w powietrzu i glebie.

Skóra błony śluzowe ( S. aureus – nosicielstwo głównie nosogardziel )

Produkty żywnościowe

Mogą wywoływać infekcje

Najczęstsze źródła S. areus:

• Kremy, bita smietana, lody, budynie

• Mleko, sery, śmietana

• Sałatki ziemniaczano- jajeczne

• Konserwy rybne

• Gotowane mięso spożyte po dłuższym czasie od jego przygotowania.

Do zanieczyszczenia produktów spożywczych dochodzi przeważnie po obróbce termicznej na skutek bezpośredniego kontaktu z pracownikami – nosicielami S. aureus lub poprzez narzędzia. Źródłem zakażenia są osoby ze zmianami ropnymi na skórze z ostrymi nieżytami górnych dróg oddechowych. Innym źródłem jest surowiec spożywczy.

Zatrucia gronkowcem – intoksykacja

• Wywołane przez enterotoksyny gronkowcowe SE - wytwarza je ok. 50 – 70 % szczepów S. areus.

• 7 typów antygenowych enterotoksyny ( A, B, C1, C2, D,E,F )

Enterotoksyny

• Jednołańcuchowe polipeptydy tworzone w zakresie temp 10 – 45 stopni i pH >5

• Odpowiednie na działanie enzymów trawiennych ( nie ulegają inaktywacji w soku żołądkowym )

• Odporne na działania niskiej i wysokiej temperatury ( nie ulegają inaktywacji pod wpływem pasteryzacji i gotowania, pieczenia, rozkładowi ulegają w temp. 100 stopni po 30 min)

• Obecność w środkach spożywczych- sole peklujących nie zapobiegają rozwojowi S. areus i produkcji enterotoksyn.

• Najdogodniejsze warunki do produkcji enterotoksyn są wtedy gdy zanieczyszczony został gotowy produkt, który następnie przechowywano w > 10 stopni.

Zachorowanie- głównie w miesiącu letnim, czas inkubacji 2 – 6h

Objawy zatrucia

• Kurczowe bóle brzucha ( nadbrzusza)

• Gorączka

• Nudności, wymioty, biegunka ( krótkotrwała)

Choroba ustępuje samoistnie po 24 – 48 h po właściwym nawodnieniu.

Wykrywanie w żywności

I Namnażanie selektywne

W przypadku produktów o niskim poziomie zanieczyszczenia gronkowcami lub występowanie komórek uszkodzonych)

• Określa ilość badanej próby, wprowadzić do podłoża płynnego Giollitti i Cantoni

(zawiera NaCl, LiCl, mannitol, telluryn potasu. )

II Różnicowanie

Z probówki, w której nastąpiło zaczernienie podłoża lub wytworzył się na dnie szaroczarny osad, należy pobrać materiał i przesiać na podłoże stałe ( Baird- Parkera (B-P ) lub pożywkę (B-P z plazmą króliczą i fibrynogenem ( RFP) )

Podłoże Baird- Parkera z chlorkiem litorym i tellurynem potasu.

Drobne czarne lub szare kolonie otoczone ( kolonie typowe ) lub nie ( kolonie nietypowe) przezroczystą strefą.

III Potwierdzenie

• Posiew wybranych kolonii do bulionu mózgowo-sercowego

• Wykonanie probówkowego testu na obecność koagulazy ( dodane do hodowli bulionowej plazmy króliczej, wynik + to ścięcie i utworzenie skrzepu po 24 h inkubacji)

• Zastosowanie pożywki B-P z RFP umożliwia bezpośrednie wykrycie gronkowców koagulazo- dodatnich, które rosną w postaci: drobnych czarnych, szarych, lub białych kolonii otoczonych strefą zmętnienia.

Oznaczanie liczby

• Metoda płytkowa: posiew w 2 powtórzeniach zawiesiny wyjściowej badanej próbki lub jej 10-krotnych rozcieńczeń na podłoże B-P ( posiew powierzchniowy ) lub B-P z RFP ( posiew metodą zalewową)

• Inkubacja po – 24-48h

• Badania potwierdzające zdolność wytwarzania koagulazy ( dla kolonii p-B-P)

UWAGA!

Podłoże Chapmana

• Nie nadaje się np. do badania solanek i produktów solonych zawierających liczne bakterie holofilne, które rozwijają się na tym podłożu i mogą zakłócać wzrost gronkowców.

• Może okazać się zbyt mało selektywne również przy badaniu produktów zawierających liczną mikroflorę saprofityczną ( np. mięso mielone, befsztyk tatarski, niektóre sałatki )

Agar z krwią

• do posiewu produktów niezbyt silnie zakażonych różnorodną mikroflorą mieszaną

• Wzrost innych drobnoustrojów może całkowicie zahamować wzrost gronkowców

S. areus – hemoliza beta i gama

S. Epidermidis – hemoliza gama

Inne metody potwierdzenia S. aureus

• Wytwarzanie koagulazy (+) S. areus

Koagulacja związana ( CF- clumping factory) wykrywa testem szkiełkowym z użyciem osocza krwi ludzkiej lub króliczej.

• Koagulacja wolna

Wykrywa w teście probówkowym.

• Beztlenowa fermentacja mannitolu( Hugh- Leifsona z mannitolem) + areus.

• Wytwarzania fosfotazy- + dla areus ale także niektóre S. epidermidis.

W produktach żywnościowych często obok gronkowców są Micrococcus spp. Dobrze rosnących na podłożach o zwiększonej zawartości NaCl i są morfologicznie podobne do gronkowców.

Testy różnicujące gronkowce od mikrokoków

• Tolerancja tlenu- posiew na podłoża tlenowe i beztlenowe mikrokoki wyłącznie tlenowe

• Oznaczanie wrażliwości na furazolidon gronkowce wrażliwe, mikrokoki oporne.

• Oznaczanie oksydazy cytochromowej u drobnoustrojów bezltenowych, mikrokoki

• Wrażliwość na lizostafine i lizozym + Staphylococcus

Sposoby kontrolowania zagrożenia

• Właściwa higiena

• Temperatura odpowiednia obróbki termicznej

• Personel okresowo poddanych badaniom

• Przechowywanie surowców i produktów w warunkach uniemożliwiających produkcje toksyn

Charakterystyka podłoża Chapmana

Wybiórczo- różnicujące, w którym czynnikiem wybiórczym jest 7,5 % NaCl, różnicującym mannitol, podłoże służące do izolacji gronkowców, które można różnicować na podłożu ,mannitolo dodatnim czyli rozkład mannitolu i mannitolu ujemnego, rozkład mannitolu widoczny jest w postaci żółtego zabarwienia podłoża i żółtych kolonii, + S.areus, pozostałe nie zmieniają zabarwienia podłoża bo są mannitolo ujemne.