Rząd: BACILLALES

Rodzina: STAPHYLOCOCCACEAE

Rodzaj: STAPHYLOCOCCUS

Gatunki: S. aureus (ludzie)

SIG (2007)= grupa S. intermedium (psy)

• S. intermedium (dzikie gołębie)

• S. pseudintermedius (psy)

• S. delphini (hodowlane gołębie)

S. epidermidis (ubikwitarny)

S. hyicus (świnie, IV klasa, bardzo niebezpieczny)

S. schleiferi ssp. coagulans (zapalenie ucha zewnętrznego u psów)

Ziarniaki- płaszczyzny podziału

• Dwoinki

• Łańcuszki

• Grona

• Pakiety

Charakterystyka bakterii:

• Gram +

• Ziarniaki

• Nieregularne skupiska (grona)

• Katalazo +

• Oksydazo –

• Rzęski –

• Endospory –

• Otoczka +/-

• Temp wzrostu 15-45 °C, optymalnie 35-37°C

• Podłoża podstawowe

• Wzrost w obecności =15% NaCl

• Hemoliza (v) -> całkowita (hemoliza β)- mogą rosnąć

->niecałkowita (α)

-> brak (γ)

• Koagulaza- kryterium podziału gronkowca

• Głównie na skórze i w górnych odcinkach układu oddechowego, na błonach śluzowych

• Fermentują cukry

• Niskie temperatury nie eliminują ich, przeżywają przed długi czas

• Wrażliwe na zmiany pH, pH 4,5- 9,3 , ale słabiej w środowisku kwaśnym

• Rosną w warunkach tlenowych (energia z glikolizy, cyklu pentozo-fosforowego i cyklu Krebsa) i beztlenowych (energia zdobywana na drodze fermentacji)

• Wytwarzają barwniki -> karotenoidy w błonach komórkowych, ale są one wytwarzane w specjalnych warunkach: na podłoży podstawowym w temp. Ok. 37°C po 18-24h, ale te same szczepy na podłożach płynnych tracą tę możliwość, podobnie jak na podłożach sztucznych, barwniki te ułatwiają bakteriom przeżycie w fagocytach

• Czynnik kontrolujący żywotność -> 77°C eliminacja drobnoustrojów z przetworów mięsnych

• Odporne na penicylinę -> wytwarzają plazmidy kodujące β- laktamazę

Chorobotwórczość (zmiany ropne)

1. Zmiany skórne- czyraki, ropnie

2. Infekcje ogólne

1. Zapalenia płuc

2. Zapalenie wymienia

3. Zapalenie opon mózgowych

1. Infekcje głębokie

1. Zapalenie wsierdzia (endocarditis)

2. Zapalenie szpiku (osteomielitis)

3. Zapalenie stawów (arthritis)

1. Zatrucia pokarmowe

2. Syndrom szoku septycznego

Czynniki wirulencji

1. Odpowiedzialne za adherencję

1. Białka powierzchniowe

2. Clumping factor

3. Adhezyjny (do kolagenu)

1. Odpowiedzialne ze inwazyjność

1. Toksyny= hemolizyny = cytotoksyny (α, β, γ, δ)

2. Koagulaza

3. Stafylokinaza

4. Inne egzotoksyny (egzoenzymy)

1. Obrona przed układem odpornościowym

1. Otoczka polisacharydowa

2. Białko A

3. Leukocydyna

1. Odpowiedzialne za objawy chorobowe

1. Czynniki z grupy III

2. Α- toksyna

3. Toksyny eksfoliatywne (ET)

• Wybitna odporność na stosowane leki- gen MEC- A- odpowiedz na metycylinę oraz gen wielooporności MRSA (na metycylinę) oraz MSSA (wrażliwe na metycylinę)

Patogeneza infekcji (proces złożony)

1. Adherencja zarazka do komórek gospodarza

1. Białka powierzchniowe łączą się z:

Fibronektyna

laminina matrix kom gosp

1. Clumping factor (białko wiążące fibrynę/ fibrynogen)= przyleganie do skrzepu krwi i uszkodzonych tkanek

2. Adhezyny: szczepy odpowiedzialne za: osteomyelitis i athritis (kolagen)

1. Inwazyjność:

1. Białka wydzielane do środowiska (na ogół)

2. Cytotoksyny (hemolizyny)- uszkadzają błonę komórkową:

- α, β, γ, δ toksyna

- koagulaza (wydz. na zew) i clumping factor (przylega do skrzepów i tak jest przenoszony)

- stafylokinaza i inne enzymy

1. α- toksyna

- wiąże się z: monocytami, limfocytami, płytkami krwi, komórkami nabłonka naczyń (fosfatydylocholina, chalesterol błony komórkowej)

- efekty:

1. tunele o średnicy 1-2 nm w błonie cytoplazmatycznej

2. wypływ K⁺, H₂O

3. unikanie Na ⁺, Ca²⁺ -> obrzęk -> śmierć komórki

4. wydzielanie cytokin prozapalnych -> szok septyczny (ostre infekcje)

5. martwice skóry

6. działanie neurotoksyn

1. β- toksyna

1. β- hemolizyna= sfingomielinaza C

2. stacjonarna faza wzrostu

3. S. aureus izolowany od zwierząt

4. Aktywność fosfolipazy C w obecności Mg ²⁺

5. Powinowactwo do : sfingomiliny i fosfatydylocholiny

6. wrażliwe erytrocyty owcy (dużo sfingomiliny)

1. δ- toksyna

1. Mechanizm działania nieznany

2. Uszkadza błonę komórkową ssaków

3. Działanie: Hemolityczne

Cytotoksyczne

Dermatonerkotycznie

Letalnie (zwierzęta laboratoryjne- duże dawki)

1. Fosfolipidy hamują aktywność toksyn

2. Wytwarzanie: 97% S. aureus

≈50-70% szczepy kolaguazoujemne

1. Aktywuje neutrofile i monocyty

1. γ- toksyna

   1. hemolizyna= leukotoksyna+ leukocydyna -> toksyna dwuskładnikowa:

Leukotoksyna: szczepy S. aureus (≈100%)

Liza: erytrocytów, neutrofili, makrofagów

Podłoże bez agaru

Leukocydyna: 2-3% szczepów

Brak hemolizy

Uszkadza neutrofile i makrofagi

Działa prozapalnie (degranulacja neutrofili)

• koagulaza i clumping factor

• białko egzogenne

• działanie: koagulaza + protrombina ->stafylotrombina (proteaza)

• fibrynogen pod wpływem stafylotrombiny przechodzi w fibrynę

• marker identyfikujący S. aureus to koagulaza

• clumping factor: związany z powierzchnią komórki

• stafylokinaza

• plazminogen stafylokinaza plazmina

• Plazmina liza fibryny rozpuszczenie skrzepów włóknika i rozprzestrzenianie się zarazka

• Inne enzymy (egzoenzymy)

• Proteazy

• Hialuronidazy

• Lipazy

• Dezoksyrybonukleazy (DNA -azy)

• Enzymy rozkładające antybakteryjne lipidy

• Obrona przed układem odpornościowym gospodarza

  1. Otoczka polisacharydowa (pseudootoczka)

     1. Ekspresja podczas infekcji

     2. Szczepy powodujące mastitis u bydła

     3. Maskuje antygenową „obcość”

  2. Białko A

     1. Oporność na fagocytozę

  3. Leukocydyna

     1. Liza komórek polimorfonuklearnych

     2. Odczyn zapalny (degranulacja)

• Czynniki odpowiedzialne za objawy chorobowe

1. Czynniki ułatwiające inwazję

2. α- toksyna

3. toksyny pyrogenne-> superantygeny

• Superantygeny- powodują gwałtowne wydzielanie substancji obronnych organizmu w bardzo dużych ilościach, przez co organizm daje tak dużą odpowiedź, że prowadzi to do samowyniszczenia

1. toksyna syndromu szoku toksycznego (TSST- 1)- przechodzi przez błony śluzowe, łatwo rozprzestrzenia się w organizmie (18% przypadków śmierć noworodków, *0% syndrom Kawasaki) spadek ciśnienia, utrata świadomości, śpiączka, śmierć.

2. enterotoksyna SE

• 6 typów antygenowych

• Termostabilna (100°C/ 30 minut)

• Oporna na enzymy trawienne

Miejsce wytwarzania

Poza organizmem w organizmie

Zatrucia pokarmowe (intoksykacja) syndrom szoku toksycznego (superantygeny)

Enterotoksyna oddziaływuje na układ pokarmowy, na enterocyty. Działa podobnie do neurotoksyny, bo ma zakończenia nerwowe w układzie pokarmowym i przez nerw błędny wywołuje nudności, wymioty. Są to objawy przy zatruciu gronkowcem, może być też gorączka, objawy mogą występować już po 30 minutach od zakażenia, ale po 24h ustępują -> samowyleczenie. Toksyna A i D jest wytwarzana w fazie logarytmicznej, a B i C pod koniec fazy logarytmicznej i na początku stacjonarnej. Typ B toksyny działa inaczej: powoduje odczyny ALERGICZNE

1. Toksyny eksfoliatywne (EF)

• Dermonekrotoksyna

• Rozszczepienie desmosomów w naskórku

• Rozwarstwienie skóry

• powstanie pęcherzy

• Całkowita utrata naskórka u koni

Najważniejsze zagrożenie zakażeniem gronkowców jest w:

1. Żywności wielokrotnie przetwarzanej poddawanej:

• Obróbce termicznej

• Wyjaławianiu

• Wysokiemu ciśnieniu

Gdyż ginie pozostała biota i gronkowce bardzo szybko się namnażają

1. Żywności fermentowanej

• Sery

• Salami

Po pH tu zmienia się łagodnie i gronkowce mogą się rozmnażać

1. Produkty suszone

• Mleko w proszku

• Makarony

• Produkty piekarnicze

Rozpoznanie:

1. Infekcje- wykrywanie i identyfikacja zarazka

1. Cechy morfologiczne (G+, ziarniaki, grona)

2. Próba na koagulazę

3. Typowanie fagowe

1. Intoksykacja (zatrucie pokarmowe)- wykrywanie toksyny

1. Podstawowym elementem przy wykrywaniu gronkowców to trzeba znaleźć powyżej 10⁶/ 1g żywności- wtedy zatrucie

Posiew na podłoże podstawowe lub wzbogacone (gdy określamy też właściwości hemolizujące)

Przynależność gatunkowa

Kolonie: 2-3 mm, białe lub żółte, błyszczące, wypukłe lub płaskie

Wykrywanie obecności bakterii G+

Test na koagulazę

Podłoża różnicujące

1. Czepmana- w warunkach beztlenowych, aby próba była wiarygodna, rozkład mannitolu gdy są gronkowce to żółta barwa podłoża się pojawia

2. Barda Parkera- podłoże agarowe m.in. z chlorkiem litu, komórki gronkowców dają kolonie: czarne lub metaliczne lub czubek czarny a obwódka biała

Różnicowanie gatunkowe gronkowców:

Testy/ gatunek	S. aureus	S. intermedius	S. hyicus	S. epidermidis
Koagulazę	+	+	+/-	-
Hemoliza β	+	+	-	-
Pigment	+	-	-	-
Maltoza- ferm. kwaśna	+	-	-	+
Mannitol- ferm. W war beztl	+	+/-	-	-
Białko A	+	-	-	-

PACIORKOWCE

Typ: FIRMICUTES

Klasa: BACILLI

Rząd: LACTOBACILLALES

Rodzina: STREPTOCOCCACEACE

Rodzaje: STREPTOCOCCUS

Gatunki: S. pyogenes

S. agalactiae

S. dysagalactiae subsp. dysagalactiae

S. dysagalactiae subsp. equisimus

S. equi subsp. equi

S. equi subsp. zooepidermicus

PODZIAŁY:

1. Ze względu na właściwości hemolityczne:

1. Grupa α- hemoliza α- bakterie wytwarzają α- hemolizynę, która uszkadza krwinki i działa destrukcyjnie na hemoglobinę, która przechodzi w methemoglobinę i zazielenia kolonie (szarozielone)

2. Grupa β- hemoliza β- bakterie wytwarzają β- hemolizynę, która całkowicie niszczy hemoglobinę i wokół koloni jest zupełne przejaśnienie agaru

3. Grupa γ- hemoliza γ- bez właściwości hemolitycznych

1. Według Shermana- dotyczy objawów klinicznych

Paciorkowce podzielono na 4 grupy:

1. Ropne

2. Kałowe- zaburzenia jelitowe

3. Mlekowe- atakują gruczoł mlekowy

4. Zieleniejące- z α- hemolizyną

1. Według Róży Lancefield- paciorkowce posiadają wspólny antygen nieco różniący się, znajdujący się pod warstwą mureiny i mający charakter węglowodanu C. Opracowała metodę ekstrakcji tego antygenu, dlatego posiadamy surowice. Ekstrakcja- wyizolowany paciorkowiec hoduje się w bulionie w 37◦ przez 24h, wirujemy, a do badań bierzemy osad.

I osad: w 1 ml HCl, gotujemy w łaźni przez 15 minut, neutralizujemy ługiem do pH obojętnego i wirujemy, w supernatancie znajdują się antygeny

II osad: osad zawieszamy w 0,5 ml NaCl i autoklaw ujemy 15 minut w 121 ◦C. Wirujemy i supernatant do badań.

Wszystkie grupy mają swoje surowice, test precypitacji pierścieniowej- dajemy surowice i nawarstwiamy danym wyciągiem, do 30 minut pierścień, który określa do jakiej grupy należy paciorkowiec

1. S. pyogenes- najbardziej złośliwy ze wszystkich

2. S. agalactiae- atakuje przeżuwacze

3. S. equi subsp. equi- zołzy u koni

S. equi subsp. zooepidermicus- stany ropne i poronienia u klaczy

S. dysagalactiae subsp. dysagalactiae

S. dysagalactiae subsp. equisimilis

1. S. bovis- zmiany u bydła I świń

S. suis

1. S. uberis- posiada antygen grupowy

2. S. canis- zmiany ropne u psów

O- S. pneumoniae- zapalenia płuc

1. Podział filogenetyczny biorąc pod uwagę zmiany sekwencji 16Sr RNA- najmniej zmian tu zachodzi

Paciorkowce podzielono na 7 grup:

1. Ropne – grupy A, B, C, E, G

2. anginosus- przedstawicie: S. anginosus, odpowiedzialne za zapalenie gardła

3. mitis- dają łagodne objawy, przedstawiciel: S. mitis, też S. pneumoniae

4. salivarius- wszystkie atakujące jamę ustną

5. bovis- atakujące bydło, przedstawiciel S. bovis

6. mutans- przedstawiciel: S. mutans, zmiany ropne, ale łagodniejsze

7. poza- te które trudno dopasować np. S. suis, S. ovis

Grupy od 2-7 są zieleniejące, dają hemolizę α

CHARAKTERYSTYKA:

• G+

• Ziarniaki

• Wielkości do 1 um

• Występują w łańcuszkach- długich i krótkich szczególnie z hodowli bulionowych (S. pnaumoniae- parami)

• Otoczki +

• Rzęski –

• Warunki tlenowa, ale dodatek CO₂ poprawia wzrost

• Do izolacji podłoża wzbogacone, najlepiej w krew (pozwala określić właściwości hemolityczne), też wyciąg mózgowo- sercowy

CZYNNIKI WIRULENCJI

• Prawie wszystkie dotyczą S. pyrogenes

1. Białko M

• Białko powierzchniowe

• Zbudowane z 2 łańcuchów polipeptydowych

• Koduje je gen Emm

• Wyróżnia się 139 typów antygenowych białka M co jest złe, bo zakażenie jednym typem jest też drugim

• Strukturalnie podobne do białek fibrylarnych ssaków np. miozyny

• występuje w mięśniach, też sercowym stąd infekcje po zakażeniu- zapalenie mięśnia sercowego

• Ma właściwości antyfagocytarne i antykomplementarne

1. Otoczka

• Najczęściej hialuronowa

• Zbudowana z kwasu glukuronowego i N

• Kontroluje jej obecność operon HAS składający się z 3 genów- has A, B, C

Gen A- odpowiedzialny jest za syntezę syntetazy hialuronowej

Gen B- odpowiedzialny za syntezę dehydrogenazy glukuronowej

Gen C- odpowiada za syntezę pyro fosforylazy glukozy

• Kwas glukuronowy podobny jest do kwasu hialuronowego ssaków

• S. agalactiae- z kwasu sjalowego, glukozy, galaktozy, glukozaminy

• Dzięki otoczkom właściwości antyfagocytarne

1. Proteina F

• Adhezyjna

• Wiąże się z fibronektyną- jest to białko chroniące komórki makroorganizmu, powierzchowne

1. Pirogenne egzotoksyny SPE

• Toksyny: A, B, C, F

• Działają jak superantygeny- łączą się z MHC klasy II na powierzchni komórek, przyłączają się do receptorów limfocytów T, powodując ich nieswoistą proliferację i wytwarzanie cytokin, które działają prozapalnie i pirogennie. Geny warunkujące wytwarzanie tych toksyn przenoszone są na transpozonach (ruchome fragmenty DNA).

• T 12 bakteriofag włącza się w chromosom

• Szkarlatyna- S. pyrogenes- toksyny A i C, uszkadzają śródbłonek naczyń włosowatych. Objawy- wybroczyny

• Toksyna B- ulega proteolizie, powstaje proteinaza cysteiny, która również rozkłada fibronektynę

• Toksyna F- niezbadana

1. Streptolizyny O i S

• O- ma charakter antygenowy, w budowie jest podobna do tetanolizyny, do cereolizyny, do listeriozyny, wiąże się z cholesterolem błon komórkowych erytrocytów, tworzą się kanaliki- co prowadzi do uszkodzenia. Odpowiada za gorączki reumatoidalne jako objaw po zakażeniu. Indukuje powstanie przeciwciał przeciwstreptolizynowych- test ASO

• S- nie jest antygenem, ale ma właściwości β- hemolizyny i tak uszkadza krwinki

1. Fibrynolizyny/ streptokinazy A i B

• Działają na plazminogen, powstaje proteaza plazminy, która rozkłada fibrynę, powoduje, że są rozpuszczalne skrzepy i bakterie łatwiej rozprzestrzeniają się w organizmie

1. Peptydaza C5a

• Rozkłada fragmenty C5a

1. Hialuronidaza

• Czynnik rozprzestrzeniania- wpływa na kwas hialuronidowy w tkance łącznej

1. Nukleazy A, B, C, D

• Depolimeryzują DNA znajdujący się w ropie co wpływa na zmniejszenie lepkości ropy i ułatwia rozprzestrzenianie bakterii

1. Neuraminidazy/ sialidazy

• Działają na kwas sjalowy- czynnik kolonizacyjny

1. Czynnik zmętniający OF

• Wiąże fibronektynę

1. Białko CFB

• Czynnik CAMP

• O charakterze cytolizyny i aktywności hemolitycznej

1. Kwas LTA- lipotejcholowy

• Czynnik adhezyjny

Diagnostyka

1. Przesyłamy do badania: wysięk, ropę, mleko, mocz, zmiany skórne, wyskrobiny. Szybki transport, nie dopuścić do wysuszenia próbek bo są wrażliwe na zmiany

2. Rozmaz z badanych materiałów- płyny odwirować- osad- barwienie Gramma- kuliste do 1 um bakterie G+, ułożone w łańcuszki. Na agarze łańcuszki mniejsze, a na bulionie większe

3. Badanie hodowlane

• Na agarze z krwią

• Podłoże Edwardsa- wybiórczo różnicujące z fioletem krystalicznym, związkami galu, eskuliną i cykliną żelaza. Wyhamowuje wzrost innych bakterii i pozwala określić jaki paciorkowiec- ze względu na eskulinę. W 37 ◦/ 24 h. rosą drobne kolonie, im większa otoczka tym kolonie bardziej rozlane

1. Badanie mikroskopowe- ziarniaki G+, do 1 um wielkości

2. Testy biochemiczne

• Katalaza –

• Es kulina S. uberis rozkłada + czerwone zabarwienie

• Test CAMP- tylko S. agalactiae wynik dodatni, strefa zupełnej hemolizy

• Test aglutynacji lateksowej- mieszamy surowicę odpornościową z lateksem dodajemy bakterie i dochodzi do aglutynacji, przeciwciała opłaszczone lateksem wiążą się z antygenami

Różnicowanie paciorkowców, które powodują mastitis

• test CAMP + dla S. agalactiae

Rodzina: ENTEROCOCCACEAE

Rodzaj: ENTEROCOCCUS

Gatunek: E. faecalis

E. faecium

E. gallinarum

E. casseli flavus

Charakterystyka

• paciorkowce, kiedyś należały do grupy D

• ziarniaki G+

• okrągłe lub owalne- wtedy powyżej 1 um

• tworzą krótkie łańcuszki

• mogą występować parami lub pojedynczo

• warunki tlenowe, dodatek CO₂ polepsza wzrost

• kolonie- niewielkie, 1-2 um

• rosną na agarze zwykłym, ale lepiej na agarze z krwią

• są α- hemolityczne

• S. faecum z krwią króliczą, końską lub ludzką- β- hemoliza, a na baraniej z α- hemolizą

• 5-6% NaCl rosną

• Temperatura 10-45 ◦C z optimum 35◦C

• Hydrolizują eskulinę na podłożu BE – żółć- eskulina z dodatkiem 40% soli żółci

• Rzęski – ( z wyjątkiem E. gallinarum, S. casseli flavus)

• Otoczki +

• Test PYR służy do różnicowania rodzajów Enterococcus i Streptococcus. Wykrywany jest w nim enzym L-pyrolidonyloaryloamidaza – wytwarzany tylko przez niektóre z nich. Odszczepiany jest β-naftylamid z substratu. Uwolniony związek z barwnikiem diazowym tworzy kompleks o barwie różowo-czerwonej.

• Enterococci jako jedyne + w teście PYR ! (S. pyrogenes + w teście PYR jako wyjątek)

• Test LAP- aminopeptydaza leucyny- wytwarza enzym, który rozkłada naftylamid leucyny

Czynniki wirulencji:

1. Białka adhezyjne

• Białka agregacyjne, kodowane przez plazmidy lub wyspy patogenności (znajdujące się na chromosomie)

• Białka o charakterze adhezyjny- ułatwia kolonizację i wnikanie do makrofagów organizmu

1. Toksyna o aktywności hemolitycznej podobna do streptolizyny O

2. Enzym proteolityczne tj. żelatynaza czy proteaza serynowa, mają właściwości adhezyjne, zwiększają przyczepność bakterii do nabłonka dróg moczowych

Enterococci- patogeny szpitalne, normalnie bytujące w jelicie grubym (10⁷/ 1 g kału), przy immunosupresji (antybiotyki, spadek odporności) to przedostają się do krwi i atakują narządy głównie nerki.

Są to bakterie, które nabywają cechy zjadliwości- kodowane przez bakteriofagi, przenoszą geny oporności na antybiotyki-> śmierć

Diagnostyka

1. Mocz, krew- bakteriemia, ropa, tkanki przy zgonie

2. Badanie mikroskopowe- rozmaz barwiony Gramma- owalne- koko pałeczki- pojedyncze, w parach lub krótkie łańcuszki

3. Przy temperaturze 35◦C- podłoża zwykłe lub wzbogacone

4. Kolonie do 2 um, preparat bezpośredni

5. Testy biochemiczne

• Katalaza - (pojawiają się szczepy wytwarzające)

• Na podłożu BE rozkładają eskulinę

• Można podzielić na 5 grup pod wpływem rozkładu mannitolu i sorbozy oraz hydrolizy argininy:

Grupa 1- rozkłada oba, nie hydrolizuje argininy

Grupa 2- rozkłada mannitol, nie rozkłada sorbitolu, hydrolizuje argininę

Grupa 3- nie rozkłada obu, hydrolizuje argininę

Grupa 4-nie rozkłada cukrów, nie hydrolizuje argininy

Grupa 5- rozkłada mannitol, nie rozkłada sorbitolu, nie hydrolizuje argininy

1. Testy Becton- Dickinsen

E. casseli flavus- żółte kolonie na agarze z krwią

Różnicowanie Enterococcus i Streptococcus

	Enterococcus	Streptococcus
Makromorfologia	Występują pojedynczo, parami lub jako krótkie łańcuszki	Łańcuszki długie i krótkie, tylko S. pneumoniae parami
Oporność na wankomycynę	Oporne	Wrażliwe
Rozkład es kuliny na podłożu BE	+	-
Test PYR	+	- (ale S. pyrogenes +)
Test LAP	+	+
6,5% NaCl	+	-
Wzrost 10◦C	+	-
Wzrost 45◦C	+	-
Rodzaj hemolizy	Głównie α	α, β, γ