1.    Inhibitor, tok postepowania przy oznaczaniu wpływu inhibitora na szybkość reakcji.
2.    Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji (graficznie)

Wykrywanie i oznaczanie enzymów nie polega na pomiarze ich stężenia, tylko określeniu ich aktywności. Miarą aktywności enzymu mogą być dowolnie obrane jednostki aktywności wyznaczane w ściśle określonych warunkach. Podstawą jest pomiar początkowej szybkości reakcji enzymatycznej, która w warunkach optymalnych (nadmiar substratu, stałe stężenie enzymu) jest wielkością stałą, a wykres szybkości w czasie odpowiada linii prostej (reakcja zerowego rzędu). W miarę przebiegu reakcji jej szybkość spada i dlatego wyznacza się szybkość początkową V₀ dokonując pomiaru po możliwie najkrótszym czasie inkubacji enzymu z substratem. Szybkość reakcji jest proporcjonalna do ilości enzymu i może służyć do pomiaru jego zawartości w próbce.

Doświadczenie:

Sacharoza + bufor octanowy o pH 5.0 + inwertaza [miesz. inkubacyjna 4 stężenia enzymu]

1 cm 3 natychmiast do K (odczynnik salicylowy)

Mieszaninę inkubacyjną do łaźni 30 st. C 4, 8, 12 minut.

Wrząca łaźnia wodna 5 min, dodać wodę destylowaną i zmierzyć A₅₄₀ według prób kontrolnych.

Wykres A₅₄₀ od czasu 4, 8, 12 minut dla każdego rozcieńczenia enzymu (100x 200x 400x 800x) oddzielnie oraz wykres A₅₄₀ od stopnia rozcieńczenia enzymu dla jednego wybranego czasu.

A₅₄₀

0 800x 400x 200x 100x rozcieńczenie enzymu

Wraz ze wzrostem stężenia enzymu (mniejsze rozcieńczenie) szybkość reakcji enzymatycznej rośnie.

3.    Szybkość początkowa reakcji, charakterystyka i wyliczanie przy krótszych czasach.

V₀ Szybkość początkowa reakcji enzymatycznej jest podstawa do okreslenia aktywności enzymu. Okreslenie aktywnosci enzymu służy do wykrywania i oznaczania enzymów. W warunkach optymalnych (nadmiar substraty, stałe stężenie enzymu) V₀ jest wielkością stałą, jej wykres w czasie jest linia prosta –reakcja zerowego rzędu. W miarę przerbiegu reakcji jej szybkość spada i dlatego wyznacza się V₀ dokonujac pomiaru po mozliwie najkrótszym czasie inkubacji enzymu z substratem. Szybkosc reakcji jest proporcjonalna do ilości enzymu i może służyć do pomiaru jego zawartości w probce. Można ja wyznaczyc graficznie z wykresu przyrostu produktów lub ubytku substratu reakcji (np. dla lipazy ilości uwolnionych kwasow tluszczowych mikromole, dla inwertazy ilość rozłożonego substratu A₅₄₀ ) od czasu. V₀= tgα czyli Iles mikromoli kw tłuszczowych/czas lub A₅₄₀/czas.

4.    Definicja i wykres Km.

Stała Michaelisa Km – stężenie substratu przy którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej. Wyraża powinowactwo enzymu do substratu, im powinowactwo większe, tym Km mniejsze.

k₁ k₃

E+S ES E+P (enzym+substrat->kompleks es->enzym+produkt)

k₂

k₂+k₃ Km

k₁

1/V

V_max

V_max/2

Km -1/Km 1/[S]

v= Vmax*[S]/Km+[S] Lineweavera-Burka: 1/v= Km/Vmax*1/[S] + 1/Vmax

5.    Hydroliza sacharozy- wykrywanie produktów hydrolizy, tok postępowania.

6.    Podaj wartości optymalnego pH dla: lipazy trzustkowej, trypsyny i pepsyny.

Lipaza trzustkowa 7.0, temp. 35-37 st. C.

Trypsyna 7.5-8.0

Pepsyna 1.5-2 przy 5 znacznie słabnie, przy 6 denaturacja

7.    Standardowa międzynarodowa jednostka aktywności enzymu- def.
8.    Izolowanie inwertazy z drożdży.

10 g drożdży piekarskich rozetrzeć w moździerzu porcelanowym z piaskiem i octanem etylu. Podczas ucierania dodawać wodę destylowaną. Mieszaninę odstawić na 20 minut od czau do czasu mieszając. Odwirować osad (3000 obrotów/min, 10 min). Zdekantować supernatant do zlewki, odmierzyć pipetą 10 cm3 i wlać wolno kroplami do zlewki z alkoholem stale mieszanym na mieszadle. Gdy wytrąci się białko – odwirować osad (3000 obr, 10 min) supernatant odrzucic, a osad zawiesić w wodzie destylowanej i odwirować w probówkach Eppendorfa (12000 obr, 10 min). Otrzymany supernatant tanowi roztwór enzymu.

9.    izolowanie trypsyny z trzustki.

Swieza trzustke wieprzowa oczyścić z tluszczu, zemlec. zważyć 50 g zmielonej trzustki, rozetrzec ja w moździerzu z piaskiem. przenieść to do kolby stozkowej, dodac 45% etanol. Kobe pozostawic przez 3 doby w temp. pokojowej. Po tym czasie wyciag przenieść do probowek wirówkowych, zrównoważyć i odwirowac osad przy Obr. 3000/min przez 10 min. otrzymany supernatant zawiera trypsyne, chymotrypsyne, α-amylaze i lipaze. (przech w lodowce).

10.    Izolowanie pepsyny i pepsynogenu z błony śluzowej  żołądka świni.

Pepsyna. Oddzielic śluzówke zoladka swini, zemlec, odważyć 50 g do zlewki i zalac 0,4% HCl. zlewke wstawic do termostatu nastawionego na 38 st C. po 24 h wyciag przenieść do probowek wirówkowych, zrównoważyć i odwirowac osad 3000/min 10 min. otrzymany supernatant zawiera pepsyne.

pepsynogen. drobno posiekana śluzówkę zoladka swini odważyć do zlewki, zalac glicerolem aby była cala pokryta. odstawic na 24 h w temp pokojowej. wyciag przenieść do probowek wirówkowych, zrównoważyć, odwirowac osad 3000/min 10 min. otrzymany supernatant zawiera pepsynogen.

11.    Hydroliza tłuszczu mleka za pomocą lipazy trzustkowej.
12.    Wpływ pH substratu na aktywność trypsyny-  oznaczenie spektrofotometryczne

Optymalne pH trypsyny 7.5-8.0. Trypsyna to endopeptydaza, specyficzność działania –katalizuje rozpad wiazan utworzonych z udzialem lizyny lub argininy.

Kazeina rozkładana trypsyną daje produkty rozpuszczalne w kwasie trojchlorooctowym w których zawartość aminokwasow tyrozyny i tryptofanu oznacza się przez pomiar absorbancji w spektrofotometrze przy
13.    Wpływ pH substratu na aktywność trypsyny-  oznaczenie kolorymetryczne (zasada metody Folina)
14.    Glukoamylaza- wystepowanie, działanie.
15.    Syropy glukozowe- otrzymywanie i zastosowanie.
16.    Wpływ stężenia jonów wodorowych na występowanie enzymu w formie aktywnej (punkt izoelektryczny, wykres).
17.    Lipaza trzustkowa-( informacje teoretyczne ze wstępu do ćwiczeń.)
18.    Pepsyna i pepsynogen- (informacje teoretyczne ze wstepu do ćwiczeń).

Pepsyna

1. Scharakteryzować poznane enzymy proteolityczne.
2. Scharakteryzować poznane lipazy.
3. Scharakteryzować glikozydazy ze szczególnym uwzględnieniem amylaz i inwertaz.
4. Podać z uzasadnieniem WSZYSTKIE podstawowe warunki prawidłowego oznaczania aktywności enzymatycznej  (z kinetyki)
5. Przedstawić sposoby umożliwiające otrzymanie enzymów przystosowanych do syntezy żywności strukturyzowanej.