Kwasy nukleinowe część II

Replikacja DNA (Procaryota): uczestniczy w niej ok. 20 białek wzajemnie oddziałujących w skomplikowany skoordynowany sposób.

Polimeraza DNA I katalizuje dodawanie jednostek deoksyrybonukleotydów do końca 3’

(DNA)n reszt + DTP=>(DNA)n+1 + PPi (pirofosforan)

Reakcja tworzenia się wiązania fosfodiestrowego jest napędzana energią z hydrolizy PPi. Polimeraza jest egzonukleazą 3’ do 5’, katalizuje hydrolizę nukleotydów (błędy), zwiększa wierność replikacji, sprawdza wynik każdego przyłączenia nukleotydu; egzonukleaza 5’ do 3’: usuwanie starterów

Polimeraza DNA potrzebuje do syntezy łańcucha DNA:

-Wszystkich czterech aktywowanych prekursorów

-Jonów Mg

-odcinka startowego (primera)

-matrycy DNA- jedno lub dwuniciowego

Polimeraza DNA II i III –katalizują syntezę DNA, wymagają odcinka startowego, synteza zachodzi od 5’ do 3’, posiadają aktywność egzonukleazową 3’ do 5’

DNA III syntetyzuje większość nowego DNA, polimeraza DNA I usuwa startery i uzupełnia przerwy, DNA II współdziała podczas naprawy, lecz nie jest potrzebna do replikacji.

Cząsteczka DNA utrzymuje kolisty kształt, synteza nowego DNA jest ściśle związana rozwijaniem się rodzicielskiego DNA, nici nie rozplatają się zupełnie, miejsce jednoczesnego rozwijania i syntezy DNA to widełki replikacyjne.

Za rozplatanie odpowiedzialna jest helikaza- potrzebna jest energia w postaci ATP. Kiedy nici DNA rozplatają się, w innych częściach cząsteczek powstają dodatkowe skręty.

Topoizomerazy- przecinają cząsteczkę DNA w miejscu dodatkowych naprężenń, a następnie ponownie je łączą, aby ochronić je przed nadmiernym skręceniem.

Sekwencja o długości 245 pz, zawiera tandemowy szereg trzech 13-nukleotydowych odcinków o niemal identycznej sekwencji. Każdy z nich rozpoczyna się od GATC, łączenie się bialka DNAa z czterema miejscami na oriC rozpoczyna rozplatanie matrycowego DNA, do białka DNAa przyłącza się DNAb, a potem DNAc (wyginają i otwierają podwójną helisę).

Przejściowe utrzymanie struktury jednoniciowej- przyłączanie białek wiążących jednoniciowy DNA (SSB); startery syntetyzowane są przez prymazy (wyspecjalizowana polimeraza RNA), komplementarne do łańcucha matrycy DNA, usuwane w końcowej fazie replikacji przez polimerazę DNA I.

Reakcja wydłużania łańcucha- holoenzym polimerazy DNA III, bardzo duża procesywność, potencjał katalityczny i wierność przepisywania, 1000 nukleotydów na 1 sekundę, wiele tysięcy wiązań fosfodiestrowych bez oddysocjowania od matrycy. Reakcja ta zachodzi w wyniku nukleofilowego ataku gr. –OH 3’ primera na atom fosforu tri fosforanu, położonego najbliżej deoksyrybozy. Tworzy się wiązanie fosfodiestrowe i uwolniony zostaje pirofosforan.

Elongacja w kierunku 5’ do 3’. Jedna nić syntetyzowana w sposób ciągły, polimeraza DNA II w postaci krótkich fragmentów Okazaki, które są połączone ze sobą przez ligazę tworząc nić potomną, nieciągła synteza nici opóźnionej pozwala na polimeryzację w kierunku 5’ do 3’ na poziomie nukleotydów. Jest to możliwe dzięki tworzenia pętli przez matrycę do syntezy nici opóźnionej, matryca może przesuwać się przez miejsce polimerazowe w tym samym kierunku co nić wiodąca. Polimeraza DNA III uwalnia matrycę nici opóźnionej, tworzy się nowa pętla i prymasa może syntetyzować krótki odcinek RNA, służący jako starter.

Polimeraza katalizuje tworzenie wiązania tylko wtedy, gdy zasada przyłączania nukleotydu jest komplementarna, korygowanie pomyłek przez eliminacje nukleotydów niedopasowanych do matrycy- replikacja przebiega bardzo wiernie (błąd- 10 do potęgi ósmej)

Replikacja (Eucaryota):

Polimeraza DNA- pięć lizoform: alfa, beta, gamma, sigma i epsilon.

Wspólne właściwości katalityczne, mnogość miejsc inicjacji

Miejsca inicjacji : sekwencje replikujące się autonomiczne- ARS,

Rozpoznawane przez kompleks 8 białek, białka powodujące powstawanie widełek replikacyjnych.

Białko stabilizujące pojedynczą nić DNA- białko replikacyjne A-RPA;

-główna rola w replikacji- alfa, sigma

-synteza startera- alfa

-naprawa DNA- beta i epsilon

-replikacja mitochondrialnego DNA- gamma

Inny mechanizm łączenia fragmentów Okazaki, liniowy charakter chromosomów eukariotycznych, polimeraza DNA nie replikuje nici opóźnionej do końca, usuwanie startera RNA z nici opóźnionej powoduje powstawanie potomnej cząsteczki DNA z niekompletnym końcem 3’ (każda kolejna replikacja-coraz krótsza cząsteczka potomna)

„osłonki” na końcach chromosomów- telomery zawierają setki telomerowi powtórzonych sekwencji 7-nukleotydowych. Jedna nić (z końca 3’) jest bogata w guaninę, a nić komplementarna w cytozynę, nie zawiera genów kodujących białka, komórka traci przy każdym podziale niewielką część DNA telomerowego, może nadal dzielić się określoną ilość razy.

Telomeraza- występują zazwyczaj w komórkach, które mają zdolność do nieograniczonej liczby podziałów- pierwotniaki, komórki rakowe. U ludzi i innych ssaków jest aktywna głównie w komórkach linii płciowych, zwiększone skracanie się telomerów ze starzeniem się komórek i apoptozy. Liczba podziałów, jakie komórka może odbyć, zależy od wieku dawcy. Zainfekowane komórki produkują aktywną telomerazę, która istotnie wydłuża telomery, odbywały znacznie więcej podziałów.

Typy mutacji:

-substytucja- 1 para zasad zamiast innej

-delecja- 1 lub większa ilość par zasad(usunięcie)

-inwersja- 1 lub większa ilość par zasad(wstawienie)

Najczęściej zachodzi substytucja (2 rodzaje)

-tranzycja- podstawienie 1 pary puryny w miejsce innej lub 1 pirymidyny w miejsce innej.

-transwersja- zamiana pirymidyny w purynę lub odwrotnie

Do DNA mogą być wbudowywane analogi zasad, prowadzi do powstania tranzycji na skutek odmiennego parowania się zasad w kolejnym cyklu replikacyjnym.

5-bromouracyl= analog tyminy (para z adeniną lub guaniną, co prowadzi do AT<->CG)

2-aminopuryna= analog adeniny (para z tyminą lub cytozyną, co prowadzi do tranzycji AT<->GC)

Uszkodzenia DNA na skutek działa czynników fizycznych (promieniowe nadfioletowe i jonizujące) i chemicznych, mechanizmy naprawy DNA, strata informacji z jednej nici może być odtworzona na podstawie drugiej.

Mechanizmy- np. usuwanie dimerów pirymidynowych, które powstają pod wpływem promieniowania UV. Naprawa-działanie specyficznych enzymów lub rozdział fotochemiczny,

Mutacje w genach naprawczych DNA-zespół dziedzicznie uwarunkowanych predyspozycji do rozwoju nowotworów człowieka- Xeroderma pigmentosum, dziedziczny rak okrężnicy i odbytnicy- rzadko występująca choroba skóry, dziedziczona autosomalnie recesywnie. Szczególna wrażliwość na światło słoneczne i nadfioletowe, skóra staje się sucha, powieki pokryte bliznami, wrzodzieje rogówka->rak skóry (śmierć przed 30 rokiem życia), światło UV- powstawanie dimerów tymidynowych w ludzkim DNA. Nie jest usuwana połowa dimerów pirymidynowych- u chorych (uszkodzenie ekscynukleazy, która hydrolizuje szkielet fosfo-cukrowy DNA w pobliżu dimeru).

Większość DNA mieści się w jądrze komórkowym. DNA jest silnie związana z małymi, zasadowymi białkami czyli histonami.

Histony- niewielka masa cząsteczkowa, bogate w argininę i lizynę- właściwości kationowe.

DNA + histony= chromatyna

5 typów: H1, H2A, H2B, H3 i H4

Sekwencje aminokwasów w H3 i H4 w prawie wszystkich roślinach i zwierzętach.

Histon H1- większy od pozostałych i bardziej zasadowy.

Chromosom: tworzenie DNA, niewielka ilość RNA, białka histonowe i niehistonowe. Histon tworzy koraliki czyli nukleosomy, większość DNA jest owinięta.

Rdzeń tworzą histony po dwa: H2A, H2B, H3 i H4

H1 tworzy oktamer.

Następny poziom kondensacji to tworzenie kolejnej helisy tzw. Solenoid o średnicy około 30 nm.

1 obrót solenoidu= 6 nukleosomów