Ekspresja i inżynieria genów białek mleka - Metody inżynierii genetycznej w hodowli zwierząt

WPROWADZENIE

• Gruczoł mlekowy jest gruczołem pęcherzykowo-cewkowym pochodzenia skórnego

• Prenatalny rozwój gruczołu mlekowego kontrolowany jest przez czynniki genetyczne i hormonalne (na tym etapie ustala się potencjalna użytkowość mleczna)

• Postnatalny wzrost gruczołu mlekowego jest regulowany przede wszystkim przez hormony jajników, przedniej części przysadki, kory nadnerczy

• Pod ich wpływem układ przewodów ulega silnemu rozgałęzieniu, na końcach rozgałęzień rozwijają się pęcherzyki mleczne

• U podstawy jednowarstwowych pęcherzyków znajduje się warstwa kurczliwych komórek mięśniowo-nabłonkowych

• Grupa pęcherzyków tworzy tzw. zraziki, te tworzą zrazy, zrazy - ćwiartki, a 4 ćwiartki stanowią wymię (u krowy)

• Wzrost gruczołu mlekowego od urodzenia do momentu osiągnięcia dojrzałości płciowej jest powolny

• Aktywny wzrost rozpoczyna się wystąpienia regularnych cykli płciowych. Pełny stopień rozwojowy osiągany jest na początku pierwszej laktacji

• Zapoczątkowanie biosyntezy składników mleka określa się mianem laktogenezy, utrzymanie laktacji - laktopoezy

Proces tworzenia gruczołu mlekowego przebiega pod kontrolą:

1. estrogenów (rozwój przewodów mlecznych)

2. progesteronu (rozwój pęcherzyków)

3. hormonu wzrostu (GHR, IGF-I)

4. prolaktyny (rozwój i sekrecja pęcherzyków mlecznych)

5. insuliny

6. trójjodotyroniny

7. kortykotropiny (ACTH)

Laktogeneza przebiega pod kontrolą:

1. Prolaktyny - zapoczątkowanie laktacji i sekrecji mleka

2. Tyreoliberyny - pobudzanie sekrecji prolaktyny

3. Progesteronu - główny inhibitor laktogenezy

4. Glikokortykoidów - kontrolują i regulują aktywność kilku kluczowych enzymów biorących udział w syntezie składników mleka

5. Insuliny - pobudza syntezę mRNA białek mleka

6. Hormon wzrostu - działanie ma charakter pośredni i polega na zwiększaniu transportu substancji odżywczych do komórek gruczołu mlekowego

7. Insulinopodobnych czynników wzrostu (IGF-I, IGF-II)

Ekspresja genów białek mleka in vivo

• Podczas ciąży następuje wzrost syntezy różnych typów RNA

• Wzrost syntezy rRNA i tRNA służy rozbudowaniu aparatu biosyntezy białka komórek wydzielniczych i przygotowaniu do syntezy olbrzymich ilości białek mleka

• Synteza mRNA ma miejsce na długo przed podjęciem syntezy i sekrecji białek mleka (wzrasta w czasie ciąży, szczyt w czasie laktacji)

• W gruczole mlecznym mRNA białek mleka stanowi około 90% całej puli informacyjnego RNA

• Liczba cząsteczek kazeinowego mRNA wzrasta około 4000 razy (osiąga poziom 80 tysięcy cząsteczek na komórkę nabłonka wydzielniczego)

• Zawartość kazeinowego mRNA w gruczole mlecznym szczura znacznie maleje po odsadzeniu młodych

• W gruczole mlecznym szczura opisano zróżnicowany poziom ekspresji białek mleka w trakcie ciąży i laktacji; ilość mRNA kazein w gruczole mlecznym wzrasta między 5 dniem ciąży a 15 laktacji

• Zawartość mRNA α-laktoalbuminy jest niewielka w czasie ciąży, wzrasta istotnie w trakcie laktacji

• w gruczole mlecznym krowy znaczny wzrost stężenia mRNA kazeiny α_S1 obserwuje się na 2 dni przed porodem (w przeciwieństwie do innych kazein i LALBA)

• porównanie zawartości mRNA głównych białek mleka w gruczole mlecznym krowy wykazało 3-4 krotny pomiędzy 8 miesiącem ciąży a pełną laktacją

• zawartość mRNA kazein α_S1 i β w komórkach laktującej krowy jest około 4-krotnie większa niż zawartość mRNA kazein α_S2 i κ (znajduje to odzwierciedlenie w składzie frakcji białkowych mleka krowiego)

• w trakcie zasuszania zawartość mRNA kazein zmniejsza się znacznie, choć nie jednakowo; 72 godziny po ostatnim doju mRNA kazeiny α_S1 obniża się o połowę, natomiast mRNA kazeiny κ spada do 16%

• akumulacja mRNA β-laktoglobuliny rozpoczyna się już 5 miesiącu ciąży, wzrastając w czasie dalszej ciąży i laktacji

• mRNA laktoferyny, małe w czasie ciąży i laktacji, wzrasta w trakcie inwolucji gruczołu mlecznego

Mechanizm działania hormonów na ekspresję genów białek mleka

• Prolaktyna zwiększa tempo transkrypcji genów kazein i stabilizuje mRNA. W obecności PRL, insuliny i kortyzolu trwałość mRNA kazeinowego wzrasta 4-krotnie

• Insulina stymuluje transkrypcję genu kazeiny β, ma jednak niewielki wpływ na trwałość kazeinowego mRNA (w przeciwieństwie do glikokortykoidów mających niewielki wpływ na tempo transkrypcji - zwiększają one natomiast 20-krotnie czas półtrwania kazeinowego mRNA)

• obecność lamininy w podłożu hodowlanym zwiększa 2-krotnie tempo transkrypcji kazeiny α i 4-krotnie trwałość kazeinowego mRNA

• działanie GH na ekspresję genów białek mleka jest niejasne, zachodzi prawdopodobnie za pośrednictwem IGF (obecność receptorów w gruczole). Wykazano, że IGF-I stymuluje in vitro syntezę mRNA i akumulację kazeiny β

• Hormony steroidowe (kortyzol i progesteron) działają poprzez wewnątrzkomórkowe receptory (wiążące się bezpośrednio z sekwencjami regulacyjnymi w genach)

• obecność takich sekwencji (GRE i PRE ang. glucocorticoid/progesterone response element) stwierdzono w promotorach wszystkich poznanych genów białek mleka

• hormony białkowe (GH, PRL) działają poprzez receptory ulokowane w błonie komórkowej (liczne receptory PRL w błonie komórkowej nabłonka wydzielniczego)

• działanie hormonów białkowych zakłada istnienie wewnątrzkomórkowego przekaźnika(-ów)

• Inhibitor syntezy spermidyny (MGBG) obniża znacznie zależną od PRL akumulację kazeinowego mRNA w eksplantatach gruczołu mlecznego szczura (dodanie spermidyny nie przywraca jednak akumulacji kazeinowego mRNA do normalnego poziomu)

• dodanie cyklicznego GMP (cGMP) do podłoża hodowlanego stymuluje 2-3 krotnie akumulację mRNA (efekt około 10-krotnie mniejszy niż PRL)

• Cykliczny AMP (cAMP), stymulujący podziały komórek gruczołu mlecznego, wpływa raczej hamująco na różnicowanie nabłonka wydzielniczego. W gruczole mlecznym szczura i królika cAMP (prostaglandyny, wazopresyna, oksytocyna) nie naśladują in vitro działania PRL na ekspresję genów kazein), podobnie jak EGF (czynnik wzrostu naskórka)

• Elementy cytoszkieletu pełnią istotną rolę w regulacji ekspresji genów białek mleka, szczególnie w przekazywaniu sygnału PRL do wnętrza komórki. Inhibitor filamentów aktynowych (cytochalazyna D) hamuje in vitro syntezę i akumulację mRNA kazein

• Oubaina (inhibitor transportu przez błony komórkowe jonów K⁺/Na⁺) i amiloryd (K⁺/H⁺) blokują działanie PRL na ekspresję genów kazein królika

• Estry forbolowe (TPA i PMA), stymulujące lub hamujące w komórce aktywność kinazy białkowej C hamują ekspresję PRL. Podobnie działają inne inhibitory kinazy białkowej C - sfingozyna, staurosporyna, fosfolipaza A₂,

• jednym z mechanizmów regulacji ekspresji jest metylacja reszt cytozynowych (silna metylacja =mniejsza aktywność). Wykazano wyższy stopień metylacji genu κ-kazeiny szczura w okresie ciąży niż w trakcie laktacji

Sekwencje regulacyjne w promotorach genów białek mleka

• inne podejście badania molekularnych mechanizmów ekspresji genów białek mleka polega na poszukiwaniu sekwencji regulacyjnych w ich promotorach

• analiza komputerowa sekwencji promotorów genów kazein i białek serwatki wykazała obecność kilku sekwencji homologicznych, typowych dla genów białek mleka (po raz pierwszy przeprowadzona przez Yu-Lee i wsp. 1986)

• Yu-Lee i wsp. zidentyfikowali 6 konserwatywnych sekwencji w regionach regulatorowych końców 5’ genów kazein α, β i γ szczura

• analiza większej grupy genów kazein oraz α-laktoalbuminy pozwoliła zidentyfikować 30-nukleotydowej sekwencji poprzedzającej o około 100 pz miejsce inicjacji transkrypcji (tzw. milk box). Stopień homologii tej powszechnej dla genów białek mleka sekwencji waha się od 65 do 80%). W obrębie sekwencji milk box wiążą się białka jądrowe.

• ukierunkowana mutageneza genu kazeiny β w obrębie milk box (-110 do -140) spowodowała wzrost ekspresji genu (zapoczątkowanie transkrypcji genu kazeiny może być związane z uwolnieniem czynników represorowych)

• Malewski i Zwierzchowski (1995) badając promotor genu β-kazeiny szczura (2096 pz) wykazali istnienie 150 sekwencji potencjalnie wiążących 56 różnych czynników transkrypcyjnych (co najmniej 20 może uczestniczyć w regulacji ekspresji przez hormony i ich mediatory)

Czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję genów białek mleka

• analiza teoretyczna oraz identyfikacja potencjalnych sekwencji regulacyjnych w promotorach genów nie świadczy jednoznacznie, że uczestniczą one w regulacji ekspresji genów (dowodem jest wiązanie białek regulacyjnych ze swoistymi sekwencjami promotorów genów)

• badania takie zapoczątkowali Luboń i Hennighausen (1988) wykorzystując fakt wolniejszej migracji kompleksu DNA-BIAŁKO niż nagiego DNA. Autorzy badali wiązanie białek jądrowych z promotorami genów kwaśnego białka serwatki (WAP) i α-laktoalbuminy.

• metodą tą wykazano (w promotorze szczurzej α-laktoalbuminy) istnienie dwóch miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego NF1. Ponadto wykazano obecność 5 miejsc wiązania czynnika NF1 w genie owczej β-laktoglobuliny

• analiza promotora genu WAP szczura wykazała obecność tzw. miejsc superwrażliwych na DNazę-I w pozycjach -150 i -800. W miejscu dystalnym wykazano sekwencje wiążące czynniki transkrypcyjne z rodziny CTF/NF1 (niezbędnych w czasie laktacji)

• innym powszechnie występującym czynnikiem transkrypcyjnym, który wiąże się z promotorami genów białek mleka jest czynnik Oct1 (4 miejsca w genie α_S2 kazeiny bydła w pozycjach -480, -260, -210, -50).

• wiązanie czynnika Oct1 z regionem promotora -48 do -55 jest pozytywnie skorelowane z poziomem ekspresji genu β kazeiny. W regionie tym wiąże się prawdopodobnie inny czynnik transkrypcyjny: C/EPB

• opisano także białka regulujące transkrypcję, swoiste dla gruczołu mlecznego (MPBF, MGF, MAF i PMF)

MGF (Mammary Gland-specific Nuclear Factor)

• najlepiej poznany czynnik specyficzny dla gruczołu mlecznego; po raz pierwszy zlokalizowany w promotorze β-kazeiny szczura, następnie w genach różnych kazein myszy, królika, bydła

• MGF wiąże się z dwoma regionami mysiego promotora β-kazeiny w pozycji -80 do -100 i -130 dp -150 (związanie z 1-szych z tych miejsc jest niezbędne do hormonalnej indukcji ekspresji genu)

• w promotorze α_S2 kazeiny bydła występuje w regionie -85 do -95; oczyszczone białko MGF ma masę cząsteczkową od 84-96 kDa

PMF (Pregnancy-specific Mammary Nuclear Factor)

• PMF pełni funkcje represora ekspresji genów białek mleka, pośrednicząc w hamującym działaniu progesteronu na transkrypcję β-kazeiny

• wiąże się w dwóch miejscach promotora β-kazeiny w pozycjach od –9 do +4 i od –364 do –349; czynnik pojawia się w gruczole mlecznym myszy ciężarnych, zanika podczas laktacji

MPBF/STAT5A (Milk Protein Binding Factor)

• wiąże się w 3 miejscach w promotorze owczego genu β-laktoglobuliny (mutacja w tym regionie powoduje znaczne obniżenie ekspresji (pełni więc rolę aktywatora)

• do ujawnienia aktywności tego czynnika niezbędna jest fosforylacja reszt tyrozynowych

• wykazano eksperymentalnie wiązanie tego czynnika do promotora genu WAP; znaleziono sekwencje wiążące MPBF w promotorach genów kazein bydła, świński morskiej, szczura

MAF(Mammary-Cell Activating Factor)

• sekwencje wiążącą specyficzny dla gruczołu mlecznego czynnik MAF wykryto w regionach regulacyjnych retrowirusa MMTV (transformacja nowotworowa)

• czynnik ten odpowiedzialny jest za tkankowo-specyficzną ekspresję genów

Glikokortykoidy

• są jednymi z ważniejszych regulatorów ekspresji genów białek mleka

• w komórkach gruczołu mlecznego występują swoiste receptory dla glikokortykoidów (ich stężenie zmienia się w trakcie ciąży i laktacji)

• przypuszcza się, że działanie hormonów steroidowych na ekspresję genów może zachodzić pośrednio, z udziałem innych czynników transkrypcyjnych

• liczne sekwencje potencjalnie wiążące receptor glikokortykoidowy (GR) znaleziono w obszarze od -231 do -71 promotora mysiego genu WAP oraz -250 do -79 promotora genu kazeiny β

Czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję genów białek mleka

• czynnikiem wpływającym na ekspresję genów białek mleka jest także struktura chromatyny

• zidentyfikowana wiele białek posiadających zdolność „rozluźniania” chromatyny (wzajemne oddziaływania białko/białko)

• w stanie aktywnym istnieje współdziałanie pomiędzy białkami STAT5, GR, C/EBP

• w stanie nieaktywnym (represja) współdziałają białka LIP (ang. liver-enriched inhibitory protein) i YY1 - białko odwracające proces acetylacji histonów; następuje represja transkrypcji.

Prolaktyna

• Głównym hormonem wpływającym na ekspresję genów białek mleka jest prolaktyna (zbudowana ze 197-199 aminokwasów)

• PRL Odgrywa kluczową rolę w zapoczątkowaniu i podtrzymywaniu laktacji, odpowiada za syntezę głównych składników mleka (białek, laktozy i tłuszczów)

• Gen prolaktyny (PRL) ulega ekspresji głównie w przysadce mózgowej oraz w gruczole mlecznym (mRNA genu PRL są obecne również poza laktacją)

• W regulację ekspresji genu PRL zaangażowany jest czynnik transkrypcyjny Pit-1. W części promotorowej genu PRL zlokalizowano miejsca wiązania dla Pit-1 (2 w części proksymalnej promotora oraz jedno w części dystalnej - w obrębie wzmacniacza transkrypcji - w pozycji -1580/-1720)

• Prolaktyna wpływa na ekspresję genów poprzez receptory ulokowane na powierzchni komórek

• Ten mechanizm działania zakłada istnienie wewnątrzkomórkowego przekaźnika lub przekaźników

• Prolaktyna, główny hormon laktogenny, stymuluje wszystkie etapy ekspresji genów białek mleka

• Gen PRL zbudowany jest z pięciu eksonów, przedzielonych czterema intronami; obejmuje 10 kpz (u bydła leży na chromosomie 23). W genie PRL bydła wykazano istnienie kilku miejsc polimorficznych

• opisano RFLP/AvaII (insercja / delecja 200 pz) - badania nad wpływem tego polimorfizmu na cechy użytkowe bydła mlecznego wykazały, że bardziej pożądany w doskonaleniu cech mleczności wydaje się być allel delecyjny (1,15 kpz) niż insercyjny (1,35 kpz)

• w części promotorowej genu prolaktyny wykryto cztery allele (technika PCR-SSCP) - u bydła HF: B, C, i D oraz allel A - w populacji bydła australijskiego

• w nowszych badaniach (Klauzińska, 2001) wykazała istnienie pojedynczych substytucji w części promotorowej genu PRL (w miejscu potencjalnego wiązania czynnika transkrypcyjnego C/EBP), wskazując, że genotyp PRL nie ma bezpośredniego wpływu na poziom prolaktyny w krwi obwodowej, ale we współdziałaniu z innymi czynnikami (poziom podstawowy hormonu), istotnie modyfikuje sposób jego uwalniania do krwi

• innym miejscem polimorficznym w genie PRL jest ekson III (substytucja A→G w kodonie dla aminokwasu 103) - miejsce polimorficzne dla enzymu RsaI

• Chung (1996) - osobniki AA produkowały więcej mleka o wyższej procentowej zawartości tłuszczu niż osobniki o genotypie BB. Dla kontrastu, Chrenek (1999) nie wykazali (Brown Swiss) istotnego wpływu genotypu PRL/RsaI na mleczność

• Dybus (2001) - najwyższa wydajność mleka, tłuszczu i białka: PRL/RsaI (AB), najwyższa % zawartość białka: PRL/RsaI (AA).

• Brym i wsp. (2005) najwyższa wydajność mleka u krów o genotypie AB, krowy o genotypie BB - najwyższa zawartość tłuszczu (%) w mleku

Hormon wzrostu

• Hormon wzrostu to białko o masie 22-kDa wydzielane przez część gruczołową przysadki mózgowej. Składa się ze 190/191 aminokwasów (alanina/fenyloalanina na N-końcu; alternatywne przekształcanie białka prekursorowego w czasie wydzielania). Inna opisana różnorodność bGH to substytucja leucyna/walina w pozycji 127 białka.

• Uwalnianie somatotropiny z przysadki mózgowej regulowane jest przez somatoliberynę (wzmożona sekrecja) oraz somatostatynę (działanie hamujące)

• Jedną z głównych funkcji GH jest regulacja postnatalnego wzrostu kręgowców za pośrednictwem IGF-I. W czasie laktacji sekrecja GH z przysadki mózgowej jest wzmożona. Przypuszcza się, że bGH może zwiększać ilość lub aktywność komórek gruczołu mlecznego (powodując wzrost całkowitej syntezy mleka)

• Podawanie egzogennego GH powoduje zwiększenie mleczności krów od 10 do 45%, wzrost całkowitego mRNA w gruczole mlecznym (w tym dwóch enzymów zaangażowanych w przemiany tłuszczowe: karboksylazy acetylo-CoA i syntazy kwasów tłuszczowych)

• Egzogenny GH zmienia ekspresję genu kodującego białko transportujące glukozę, ułatwiając dostarczanie tego składnika do gruczołu mlecznego.

• Istotną rolę w utrzymywaniu prawidłowej laktacji wywierają hormony tarczycy; krowy w czasie laktacji często wykazują niedoczynność tarczycy (zmniejszona koncentracja jodotyronin oraz wyższa koncentracja tyreoliberyny)

• Przypuszcza się, że bGH z alaniną na N-końcu (191 aa) i leucyną-127 bardziej pobudza wydzielanie IGF-I niż inne warianty bST.

• Obecna wiedza o biologii laktacji wskazuje na to, iż genetycznie lepsze zwierzęta różnią się od zwierząt mniej wydajnych głównie w regulacji wykorzystania składników pokarmowych, a kluczową rolę w wykorzystaniu tych składników pełni GH. Prowadzona przez wiele lat selekcja w kierunku zwiększenia wydajności mleka krów doprowadziła do równoczesnego zwiększenia zawartości bGH w surowicy krwi.

• Gen hormonu wzrostu bydła zlokalizowano (przy zastosowaniu hybrydyzacji in situ) w chromosomie 19. Zbudowany jest on z pięciu eksonów, które przedzielone są czterema intronami.

• Krowy mleczne otrzymujące rbST-V₁₂₇ wykazywały większy przyrost wydajności mleka (2kg/dzień) niż rbST z leucyną₁₂₇ (genotyp bST może wywoływać zmienność w poziomie mleczności; allel V₁₂₇ wyższa produkcja mleka)

• Aminokwas 127 zlokalizowany jest na końcu trzeciej α-helisy (region pomiędzy 120 a 140 aminokwasem bST wykazuje działanie laktogenne i somatogenne). Chociaż region ten nie bierze bezpośredniego udziału w wiązaniu bGH z receptorem, jednak oddziaływania pomiędzy czterema α-helisami wpływają na strukturę przestrzenną cząsteczki białkowej.

Polimorfizm genu hormon wzrostu bydła

• w bydlęcym genie GH zlokalizowano istnienie wielu miejsc polimorficznych. W części promotorowej wykryto istnienie sześciu substytucji oraz jedną w pierwszym intronie (niektóre z miejsc polimorficznych pokrywają się z potencjalnymi miejscami wiązania czynników transkrypcyjnych). Ponadto, w części promotorowej genu GH (9 nukleotydów od kasety TATAAA) wykryto ponadto delecję ^-35AAG^-33 (polimorfizm ten obserwowano dotychczas u ras mięsnych).

• wcześniejsze badania (metoda RFLP) ujawniły polimorfizm dla enzymów BglI, BamHI, EcoRI, PstI, PvuII i TaqI (we wszystkich przypadkach spowodowany był insercją/delecją fragmentu DNA długości 1 kpz w regionie 3’ genu)

• zastosowanie hybrydyzacji Southerna (z sondą cDNA bGH ) wykazało istnienie miejsca polimorficznego dla enzymu MspI. Polimorfizm ten zlokalizowano w III intronie w pozycji 1547 (tranzycja C→T albo insercja tyminy i transwersja C→G)

• Lucy i wsp. (1991) wykazali istnienie miejsca polimorficznego w V eksonie bGH (zamiana nukleotydów C→G w pozycji 2141 genu - zamiana kodonu CTG na GTG - substytucja leucyny przez walinę w produkcie białkowym.

• W innych badaniach opisano inny polimorfizm w V eksonie w pozycji 2241 (transwersja A→C). Substytucja nie powoduje zmiany aminokwasu w bST; zmieniona sekwencja nukleotydowa umożliwia oznaczanie polimorfizmu metodą PCR-RFLP (enzym restrykcyjny DdeI). Ponadto, w części 3’ genu GH w pozycji 2637 wykryto polimorfizm dla enzymu restrykcyjnego HaeIII)

• W populacji bydła japońskiego wykazano istnienie dodatkowego miejsca polimorficznego C→T w 172 kodonie genu (zamiana treoniny na metioninę w białku)

• Lucy i wsp. (1993) krowy HF o genotypie LL produkowały więcej mleka niż osobniki LV

• Lee i wsp. (1996) wykazali, że selekcja w kierunku wysokiej wydajności nie spowodowała zmian we frekwencjach alleli GH^L i GH^V. Wartość genetyczna selekcjonowanych krów była negatywnie skorelowana z występowaniem wariantu GH^V (wytłumaczeniem obserwowanych różnic pomiędzy osobnikami o genotypach Leu₁₂₇/Val₁₂₇ jest prawdopodobieństwo istnienia sprzężenia z wariantem Leu₁₂₇ innych genów odpowiedzialnych za wzrost ilości wytwarzanego przez krowy mleka)

• Sabour i wsp. (1997) sugerują, że allel GH^V jest bardziej pożądanym allelem tego genu w doskonaleniu cech użytkowości mlecznej w zakresie ilości oraz składu mleka

• Chrenek i wsp. (1999) w badaniach na krowach Brown Swiss wykazali wyższą zawartość tłuszczu (4,77%) i białka (3,55%) u krów LL w porównaniu do krów VV (4,41% i 3,37%).

• Dybus (2002) wykazał, że krowy LL produkowały więcej mleka, tłuszczu i białka niż LV.

• Hoj i wsp. (1993), Falaki i wsp. (1996), Dybus (2001) wykazali wyższe frekwencje wariantu MspI(-) genu GH u krów o wysokiej zawartości tłuszczu w mleku

• Lagziel i wsp. (1996, 1999) wykazali, że allel MspI(-) warunkuje wyższą wydajność oraz procentową zawartość białka w mleku krów HF

• przeciwstawne wyniki prezentował Yao i wsp. 1996 , wskazując na wariant MspI(+), jako bardziej pożądany w doskonaleniu cech użytkowości mlecznej bydła

Czynnik transkrypcyjny Pit-1 (POUF1)

• czynnik transkrypcyjny Pit-1 należy do rodziny czynników transkrypcyjnych POU (Pit, Oct, Unc) regulujących rozwój ssaków; geny należące do tej rodziny posiadają fragment kodujący powstawanie domeny POU (rejonu wiązania DNA)

• białko Pit-1 posiada masę cząsteczkową około 33 kDa, łączy się ze specyficznymi sekwencjami w częściach promotorowych genów wpływając na ich transkrypcję.

• Pit-1 aktywuje ekspresję genów prolaktyny (PRL) oraz hormonu wzrostu (GH), a także wpływa na różnicowanie oraz proliferację komórek przysadki mózgowej

• w czasie rozwoju ekspresja genu PIT1 poprzedza ekspresję genów GH i PRL w komórkach somatotropowych i laktotropowych, i wydaje się być głównym aktywatorem ekspresji genów prolaktyny i hormonu wzrostu w tych typach komórek

• zahamowanie syntezy czynnika Pit-1 prowadzi do znacznego obniżenia poziomu PRL i GH oraz drastycznego spadku proliferacji linii komórkowych syntetyzujących prolaktynę i somatotropinę

• wykazano, że tkankowo-specyficzny czynnik transkrypcyjny Pit-1 zdolny jest do wzmacniania ekspresji genów zaangażowanych w inicjację cyklu komórkowego, co mogłoby wskazywać na to, iż mechanizm ten pozwala na zwiększanie proliferacji komórek somatotropowych i laktotropowych

• w badaniach Chung i wsp. (1998) zaobserwowano zwiększony poziom mRNA genu PIT1 w odpowiedzi na podawanie GHRH (rola we wczesnej ekspresji genu hormonu wzrostu

• gen PIT1 zlokalizowano w regionie centromerowym chromosomu 1 bydła, pomiędzy markerami TGLA57 i RM95

• w genie PIT1 zidentyfikowano polimorfizm RLFP/HinfI (mutacja punktowa G→A w szóstym eksonie genu). Mutacja nie powoduje substytucji aminokwasu w produkcie białkowym (wykryto ponadto polimorfizm w V intronie – SSCP)

• wpływ polimorfizmu genu PIT1 na cechy użytkowe bydła jest słabo udokumentowany (Renaville i wsp. (1997) wskazywał, że PIT1^A wpływał na podwyższenie wydajności mleka i białka, obniżenie procentowej zawartości tłuszczu w mleku krów, jak również istotnie wpływał na zwiększenie wymiarów ciała krów)

• Zwierzchowski et al. (2003) showed that both genotypes with allele A at the PIT1 locus positively affected all milk production traits studied. The AB genotype was superior for the milk yield and for daily yield of all milk components, while genotype AA was shown to positively affect their concentrations

• Dybus i wsp. (2004) nie wykazali wpływu polimorfizmu genu PIT1 na cechy uzytkowości mlecznej bydła czarno-białego

Somatoliberyna (GHRH, GRF)

• GHRH jest hormonem podwzgórzowym, który stymuluje syntezę oraz sekrecję przysadkowego GH (za pośrednictwem receptorów GHRHR obecnych na somatotropach)

• sekwencja aminokwasowa GHRH człowieka jest zbliżona do GHRH świni (93% homologia), bydła (88%) i owcy (86%). Wyizolowane z podwzgórza bydlęce białko GHRH składa się z 44 aminokwasów

• wykazano, że GHRH wpływa na regulację ekspresji genu GHRHR w przysadce mózgowej, powoduje wzrost stężenia endogennego GH w surowicy krwi bydła, zwiększając średnie oraz pulsacyjne uwalnianie bST (zwiększając produkcyjność mleczną krów

• podawanie rGHRH powoduje wzrost mRNA i białek enzymów kluczowych w przemianach tłuszczowych (karboksylazy acetylo-CoA i syntazy kwasów tłuszczowych), przy jednoczesnym obniżeniu ich zawartości w tkance tłuszczowej

• gen GHRH człowieka składa się z pięciu eksonów obejmując około 10 kpz; bydlęcy gen GHRH zlokalizowano w chromosomie 13

• Moody i wsp. (1995) wykazali istnienie RFLP/HaeIII bydlęcego genu GHRH; autorzy zasugerowali korzystny wpływ rzadkiego allelu A na cechy mleczności bydła HF

• Dybus (2001) wykazał wpływ polimorfizmu GHRH/HaeIII na % zawartość tłuszczu w mleku krów czarno-białych (4,5% genotyp AA / 4,0% genotyp BB)

• podobne tendencje zaobserwowano u rasy Jersey (Dybus i wsp. 2005 w druku)