GENY BIAŁEK MLEKA - BUDOWA, LOKALIZACJA, EWOLUCJA

INFORMACJE PODSTAWOWE

• główne składniki białkowe mleka krów to kazeiny (αS1, αS2, β, κ)

• występują one w połączeniu z fosforanem wapnia w postaci koloidowych cząsteczek (miceli)

• hydroliza miceli przez chymozynę (podpuszczkę) prowadzi do destabilizacji miceli i powstania strątu kazeinowego (razem ze sporą ilością tłuszczu i b.serwatki)

• strąt jest półproduktem w procesie wytwarzania serów

• mleko kozy i owcy zawiera identyczne kazeiny do krowich, natomiast innych gatunków ssaków zawiera kazeiny, które na podstawie właściwości można zaliczyć do jednej z grup kazein krowich

• w mleku gryzoni jedną z głównych frakcji jest kazeina γ (u myszy wykazano aż 9 różnych typów kazein)

• w mleku człowieka ilość kazein jest niższa niż w mleku przeżuwaczy (α w śladowych ilościach), główną frakcją jest kazeina β

• serwatka mleka przeżuwaczy składa głównie się z β-laktoglobuliny oraz α-laktoalbuminy

• α-laktoalbumina z galaktozylotransferazą tworzą kompleks syntazy laktozowej (synteza laktozy z glukozy i UDP-galaktozy)

• β-laktoglobulina uczestniczy w transporcie witaminy A i innych niskocząsteczkowych związków występujących w mleku

• w mleku gryzoni, człowieka, świni i wielu innych gatunków ssaków β-laktoglobulina nie występuje

• u myszy, szczura i królika głównym składnikiem białkowym serwatki jest tzw. kwaśne białko serwatki (WAP, ang. whey acid protein)

SKŁAD BIAŁEK MLEKA PRZEŻUWACZY, KRÓLIKA I CZŁOWIEKA

Białko	Krowa	Koza	Owca	Człowiek	Królik
kazeina αS1	+	+	+	ślady	+
kazeina αS2	+	+	+	?	?
kazeina β	+	+	+	+	+
kazeina κ	+	+	+	+	+
WAP	-	-	-	-	+
β-laktoglobulina	+	+	+	-	-
α-laktoalbumina	+	+	+	+	+
Stężenie białka, g/l	34	29	55	10	136

OGÓLNA BUDOWA GENÓW BIAŁEK MLEKA

• ogromny postęp w poznawaniu struktury i sekwencji genów kazein i innych białek mleka nastąpił w ostatnich 20 latach

• wszystkie poznane dotychczas geny białek mleka mają budowę kanoniczną, typową dla eukariotycznych genów klasy II

• transkrybowane są przy udziale RNA polimerazy II

• ich sekwencje kodujące (eksony) rozdzielone są (czasami bardzo długimi) intronami

• miejsca inicjacji transkrypcji poprzedzone są długimi sekwencjami flankującymi końca 5’

• sekwencja TATA (mniej lub bardziej typowa) występuje zawsze w odległości około 30 par zasad od miejsca inicjacji transkrypcji

• geny białek mleka zawierają sekwencje kodujące miejsca składania mRNA

• na końcu 3’ występuje sekwencja AATAAA (kodująca sygnał poliadenylacji mRNA), po niej występują powtarzające się sekwencje GT (koniec transkrypcji)

• w części proksymalnej genu występują sekwencje wiążące czynniki aktywujące lub represorowe (czynniki transkrypcyjne i receptory hormonalne)

INFORMACYJNY RNA (mRNA) GENÓW BIAŁEK MLEKA

• budowa typowa dla mRNA organizmów eukariotycznych

• na końcu 5’ posiada czapeczkę (cap) utworzoną przez 7-metylocytozynę

• chroni ona przed degradacją mRNA przez nukleazy i ułatwia tworzenie kompleksu inicjującego translację z podjednostką 40S rybosomu, Met-tRNA i czynnikami inicjującymi

• większość mRNA białek mleka posiada typowy sygnał poliA, wyjątkiem są mRNA kazeinowe królika (20-25% całkowitej puli) - bardzo krótkie sygnały poliA lub ich całkowity brak

• długość mRNA różnych białek mleka waha się od 549 nt (WAP królika) do 1349 (kazeina α szczura)

• mRNA białek mleka (podobnie jak innych białek sekrecyjnych) zawiera informację dla peptydu sygnałowego (około 20-aminokwasowy fragment), który jest odłączany przed wydzieleniem z komórki

• otwarta ramka odczytu (część mRNA kodująca aminokwasy) stanowi 60-70% długości mRNA

• fragmenty nie podlegające translacji: 30-40 nt na końcu 5’ i około 180 nt na końcu 3’

LOKALIZACJA GENÓW KAZEIN (LOCUS KAZEINOWY)

Locus kazeinowy bydła/kozy. Zaznaczono rozmieszczenie genów kazein α_S1, α_S2, β i κ na chromosomie 6.

• Mysz – geny kazein α, β, γ zlokalizowano na chromosomie 5

• Królik - geny kazein α, β zlokalizowano na chromosomie 12

• Owca – geny kazein α_S1, α_S2, β, γ zlokalizowano na chromosomie 6

Geny kazein występują w organizmach prawdopodobnie w postaci jednej kopii (nie wykazano istnienia dodatkowych aktywnych genów lub pseudogenów w genomach ssaków)

BUDOWA GENÓW KAZEIN

1/ GEN β-KAZEINY BYDŁA

2/ GEN -KAZEINY BYDŁA

1/ GEN S1 –KAZEINY BYDŁA

1/ GEN S2 –KAZEINY BYDŁA

EWOLUCJA GENÓW KAZEIN

• analiza sekwencji nukleotydowych genów kazein wskazuje na wysoki stopień zróżnicowania ewolucyjnego

• wskazuje się na wspólne pochodzenie genów tzw. kazein wrażliwych na wapń (α_S1, α_S2, β)

• funkcje biologiczne kazein są dość luźno związane z ich strukturą I-rzędową

• trzy obszary genów kazeinowych – niekodujące fragmenty końca 5’, regiony kodujące peptyd sygnałowy i regiony kodujące miejsca fosforylacji – mają budowę bardziej zachowawczą

• stopień homologii pomiędzy tymi regionami u różnych gatunków zwierząt jest bardzo wysoki, wskazując na wspólne pochodzenie genów kazein

• międzygatunkowe różnice w długości i sekwencji genów kazein dotyczą w większym stopniu intronów niż eksonów

• różnice długości intronów wynikają głównie z występowania w niektórych genach kazein długich sekwencji powtórzonych

• w genie α_S2-kazeiny krowy sekwencje powtórzone stanowią 14% długości genu

• rodzina genów kazeinowych powstała w procesie ewolucji przez duplikację genu pierwotnego zawierającego sekwencje kodujące dla peptydu sygnałowego oraz miejsc fosforylacji białka (tzw. bloki fosfoserynowe)

• dwa fragmenty kodujące w genie α_S2-kazeiny bydła (eksony 7-11 i 12-16) powstały przez duplikację jednego fragmentu DNA

• bydlęcy gen α_S1-kazeiny jest bliżej „spokrewniony” z genem β-kazeiny niż α_S2

• przypuszcza się, że geny obu kazein α_S1 i β mogły powstać przez wewnętrzną duplikację fragmentów DNA

• gen κ-kazeiny nie wydaje się być spokrewniony z genami pozostałych kazein

• κ-kazeina ewolucyjnie wydaje się być powiązana z rodziną genów fibrynogenu, gdyż podobnie do kazeiny kappa ich częściowa hydroliza prowadzi do powstania strątu białkowego

POLIMORFIZM GENÓW BIAŁEK MLEKA – REGION 5’

• analiza komputerowa sekwencji części promotorowych genów białek mleka wykazała istnienie wielu potencjalnych miejsc wiązania czynników regulujących ich ekspresję (m.in. MGF/STAT5A1, MAF2, MPBF3, AP1, CREB, CTF/NF1, OCT1, GR, HSE)

• działanie niektórych czynników w regulacji ekspresji genów białek mleka potwierdzono eksperymentalnie

• większość sekwencji regulatorowych zlokalizowano w części proksymalnej promotorów w odległości około 200-250 pz od miejsca startu transkrypcji

• element regulacyjny BCE1 genu β-kazeiny zlokalizowano w odległości 1500 pz od miejsca startu transkrypcji

• opisano istnienie wielu miejsc polimorficznych w części 5’ genów białek mleka, niektóre z nich mogą występować w obrębie sekwencji regulatorowych

• polimorfizm w obrębie tych sekwencji może różnicować ekspresję genów białek mleka wpływając na cechy fizjologiczne (fenotypowe) zwierząt

POLIMORFIZM GENÓW KAZEIN (REGION 5’)

Gen	Gatunek	Długość genu (5’)	Typ / lokalizacja polimorfizmu	Metoda analizy
αS2	Bydło	18483 (2509)	10 substytucji nukleotydowych w regionie od -1150 do +118 genu	PCR-RFLP Sekwencjonowanie
αS1	Bydło	17508 (2131)	15 substytucji, 2 delecje/ insercje (region od -1145 do +100)	PCR-RFLP Sekwencjonowanie
αS1	Bydło		fragment genu długości 218 pz,(region od +3 do -215)	SSCP
αS1	Bydło		substytucja A/G w pozycji -175 genu	RFLP
β	Bydło	8498 (1722)	10 substytucji nukleotydowych, 1 insercja / delecja (od -1049 do +88)	PCR-RFLP Sekwencjonowanie
β	Bydło		delecja T w pozycji -516	Sekwencjonowanie
β	Koza	9006 (1001)	substytucja A/G w pozycji -161	RFLP, Sekwencjonowanie
κ	Bydło	13000 (2167)	15 substytucji nukleotydowych , (od -1028 do +59)	RFLP, Sekwencjonowanie
κ	Bydło		fragment długości 241 pz w regionie 5’	RFLP

POLIMORFIZM GENU -KAZEINY BYDŁA

• u bydła wykryto dwa główne warianty genetyczne κ-kazeiny (A i B)

• wariant A charakteryzuje się występowaniem Thr(ACC) i Asp(GAT) w pozycjach 136 i 148, podczas gdy allel B - Ile(ATC) i Ala (GCT)

• różnice te mogą być wykrywane dzięki obecności lub braku miejsca restrykcyjnego dla enzymu HindIII (dodatkowo zniesione zostaje miejsce dla enzymu HinfI w przypadku allelu B dla pozycji 148)

• allel B genu κ-kazeiny ma korzystniejszy wpływ na jakość mleka ras europejskich bydła – krótszy czas reakcji na obecność podpuszczki

• sery produkowane z mleka krów BB charakteryzują się wyższą zawartością białka, wyższą wydajnością i lepszą jakością niż te z mleka krów AA i AB

• mleko krów HF o genotypie BB zawiera (średnio) 0.13% białka więcej

• w regionie 5’ genu κ-kazeiny wykazano istnienie kilkunastu mutacji, jednakże brak jak na razie szczegółowych opracowań w literaturze na temat ich wpływu na cechy mleczności bydła

• Kamiński donosi, że dla polimorfizmu PCR/RFLP-DdeI zlokalizowanego w części 5’ genu istnieje możliwość doskonalenia % zawartości białka w mleku

GENY BIAŁEK SERWATKI

• główne białka serwatki to β-laktoglobulina, α-laktoalbumina i WAP

• geny b. serwatki są krótsze i mniej skomplikowane w budowie niż geny kazein

• geny β-laktoglobuliny owcy i bydła mają podobną strukturę, co wskazuje na wspólne pochodzenie ewolucyjne

• geny α-laktoalbuminy są ewolucyjnie zbliżone, składają się z 4 eksonów

• wskazano na podobieństwo pomiędzy genami α-laktoalbuminy i lizozymu szczura (pochodzenie od wspólnego genu przodka)

• lokalizacja chromosomowa: gen α-laktoalbuminy: bydło 5, owca 3, człowiek 12

• u bydła i owcy wykazano obecność kilku pseudogenów α-laktoalbuminy

• lokalizacja chromosomowa: gen β-laktoglobuliny: bydło i koza 11, owca 3

• w genomie kozy i owcy wykazano istnienie pseudogenów β-laktoglobuliny

POLIMORFIZM GENÓW SERWATKI α-LAKTOALBUMINA

• α-laktoalbumina jest niezbędna w biosyntezie laktozy w gruczole mlecznym, dlatego jest brana pod uwagę jako potencjalny marker cech mleczności u bydła

• u ras europejskich gen α-laktoalbuminy jest raczej monomorficzny, poza regionem 5’

• w przypadku substytucji A/G w pozycji +15 wykazano, że krowy z allelem A miały wyższą wydajność mleka, tłuszczu i białka, allel B wpływał na wyższą procentową zawartość białka i tłuszczu w mleku (prawdopodobnie istnieją różnice w poziomie mRNA)

• Voelker i wsp. wykazali istnienie drugiej mutacji ściśle sprzężonej z mutacją +15, opisaną jako A/G w pozycji -1689

POLIMORFIZM GENÓW SERWATKI β-LAKTOGLOBULINA

• β-laktoglobulina występuje w mleku wielu gatunków, głównie przeżuwaczy, nie występuje u gryzoni, królika i wielbłąda (jest tam zastąpiona przez WAP)

• u bydła poznano 12 wariantów polimorficznych, ale 2 najczęściej występujące (A i B) wiąże się z różnicami w wydajności i składzie białka mleka

• mutacje te opisano jako Asp64 (GAT) / Gly (GGT) and Val118 (GTC) / Ala (GCC)

• allel B wpływał na wyższą zawartość kazein i tłuszczu w mleku krów, natomiast krowy HF o genotypie AA charakteryzowały się wyższą zawartością białka ogólnego i białek serwatki niż osobniki o pozostałych genotypach

• Kamiński i Zabolewicz wykazali zależności pomiędzy polimorfizmem regionu 5’ genu a cechami mleczności krów typując region promotorowy jako marker % zawartości białka w mleku krów