Mikrobiologia przemysłowa

Ćwiczenie nr 7. - Izolacja bakterii glebowych

Procedura izolacji

Materiały: płyn fizjologiczny, próbki gleby, płytki z AO, sterylne probówki, płytki z podłożem selekcyjnym dla promieniowców

1. Zawiesić grudkę gleby w 5 ml płynu fizjologicznego.

2. Dokładnie zamieszać. Pozostawić do opadnięcia osadu.

3. Wykonać rozcieńczenia płynu znad osadu w zakresie do 10^-3.

4. Z rozcieńczeń 10^-2 i 10^-3 wykonać równolegle posiewy dywanowe na płytki z AO oraz na płytki z podłożem selekcyjnym.

5. Inkubować w 28°C przez 7 dni.

6. Po inkubacji wykonać posiewy redukcyjne wybranych szczepów aby pozyskać czyste kultury

7. Po 7 dniowej inkubacji czyste kultury przenieść na skosy.

8. W razie konieczności (kultura mieszana) wykonać kolejne pasaże na płytki z AO aż do uzyskania czystej kultury.

9. Każda para powinna dysponować dwoma różnymi izolantami glebowymi i utrzymywać je przy życiu! Skosy z czystymi kulturami oraz charakterystyka izolantów będzie niezbędna do zaliczenia przedmiotu !

Charakterystyka izolantów glebowych

Opisać morfologię kolonii izolantów:

Określić kształt kolonii, kolor, przejrzystość

Określić wzniesienie nad powierzchnie pożywki (profil)

Określić brzeg kolonii, wielkość kolonii

Inne cechy określane makroskopowo.

Wykonać barwienie Grama

Materiały: hodowle płynne szczepów bakteryjnych, 0,5% roztwór fioletu krystalicznego, płyn Lugola, fuksyna, alkohol etylowy, woda destylowana, szkiełka: przedmiotowe i nakrywkowe.

1. przygotować rozmazy hodowli izolantów bakteryjnych

2. barwić roztworem fioletu krystalicznego przez około 3 minuty

3. spłukać preparat woda destylowaną

4. zalać preparat płynem Lugola na około 3 minuty

5. spłukać wodą destylowaną

6. zalać preparat alkoholem etylowym na około 30 s, w celu odbarwienia

7. spłukać wodą destylowaną

8. barwić fuksyną przez 15 s

9. spłukać woda destylowaną

10. wysuszyć

11. oglądać pod mikroskopem, przy powiększeniu max 40 razy

Określenie zdolności izolantów do amonifikacji.

Materiały: kolby z podłożem z mocznikiem (mocznik (20g), K₂HPO₄ (1g), CaCl₂ x 6 H₂O (0.1 g), MgSO₄ x 7H₂O (0.3g), NaCl (0.1g), FeCl₃ x 6H₂O (0.01g), wyciąg z mięsa wołowego (5g), H₂O dest. (1000ml)), odczynnika Nesslera

1. Dwie probówki zawierające po 5 ml podłoża z mocznikiem, zaszczepić izolantami glebowymi.

2. Inkubować w 37ºC przez 7 dni.

3. Po inkubacji sprawdzić ilość wydzielającego się amoniaku przy użyciu odczynnika Nesslera (natężenie barwy zależy od stężenia amoniaku).

Badanie zdolność do produkcji antybiotyków przez izolanty

Materiały: hodowle bulionowe szczepów testowych (Serratia marcescens, Bacillus subtilis), płytki z hodowlami izolantów (przygotowane na wcześniejszych zajęciach), płytki z podłożem Miller-Hintona

1. Na płytki z podłożem MH posiać mikroorganizmy testowe wykorzystując metodę posiewu dywanowego. Odstawić na 10 min.

2. Z płytek z izolantami glebowymi wyciąć sterylnym skalpelem dyski o średnicy ok 1 cm i ustawić pionowo na płytkach z mikroorganizmami testowymi.

3. Inkubować w 28°C przez 7 dni.

4. Obserwować strefy zahamowania wzrostu.

Zaplanować kiedy wylać skosy i kiedy posiew dywanowy podłoże selekcyjne !