Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.

W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę, a następnie przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji.

W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:

• chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników

• chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot).

• chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym.

W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:

• TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;

• chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;

• chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;

• chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;

• chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziałują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.

W zależności od parametrów procesu:

• HPLC - high performance/pressure liquid chromatography, wysokosprawna/ciśnieniowa chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem;

• FPLC - fast protein/performance liquid chromatography - szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia;

• UPLC - ultra performance liquid chromatography, ultrasprawna chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej. Działa na wyższych ciśnieniach i mniejszych przepływach, a kolumny mają mniejsze ziarno (1,7 - 1,8 μm). Pozwala uzyskiwać krótsze czasy retencji i wyższe rozdzielczości. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Waters.

• GPC - Gel Permeation Chromatography - chromatografia żelowa - odmiana kolumnowej chromatografii cieczowej. Polega na rozdziale składników mieszaniny na sitach molekularnych ze względu na ich wielkość (masę). Stosowana m.in. do określania średnich mas cząsteczkowych polimerów

Chromatografia cieczowa - rodzaj chemicznej techniki analitycznej - chromatografia, w której eluentem jest ciecz, zwykle jakiś rozpuszczalnik. Istotą każdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, co w pewnym sensie przypomina filtrację. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszaninę a złożem jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej a inne wolniej.

Istnieje bardzo wiele rodzajów chromatografii cieczowej, które można podzielić na trzy ogólne rodzaje:

• chromatografia cienkowarstwowa - w której złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest nałożone na płytkę szklaną lub plastikową w postaci cienkiej, sprasowanej formy. Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże

• chromatografia kolumnowa - w które złoże umieszcza się w kolumnie, po czym przez kolumnę przepuszcza się roztwór analizowanej mieszaniny - jej szczególnym przypadkiem jest HPLC

• elektroforeza - która w zasadzie jest formą chromatografii cienkowarstwowej, w której jednak najpierw nasącza się złoże mieszaniną, a rozdział następuje na skutek działania pola elektrycznego

Chromatografia gazowa to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą nośną jest gaz (najczęściej hel, argon, coraz rzadziej wodór). Technika ta umożliwia procentowe ustalenie składu mieszanin związków chemicznych, w których występuje ich nawet kilkaset. Stosując klasyczną detekcję umożliwia przybliżoną identyfikację składników mieszaniny, pełną identyfikację z detektorem masowym.

Chromatografia gazowa jest najczęściej stosowaną metodą do szybkiej analizy złożonych mieszanin związków chemicznych oraz oceny czystości tych związków, zarówno w przemyśle jak i w rozmaitych laboratoriach. Chromatografię gazową stosuje się m.in. w:

• przemyśle petrochemicznym - np. do oceny składu chemicznego produkowanej benzyny;

• ochronie środowiska - do oceny stopnia zanieczyszczenia, gleby, powietrza i wody;

• kryminalistyce - np. do analizy źródła pochodzenia narkotyków na podstawie składu zawartych w nich zanieczyszczeń;

• kontroli antydopingowej - gdzie aparaty GC-MS (Gas chromatography - mass spectrometry) stanowią podstawową metodę wykrywania niedozwolonych substancji w krwi, pocie, moczu i ekstrakcie z włosów sportowców.

• w przemyśle spożywczym - do badania składu surowców i produktów żywnościowych oraz do wykrywania zafałszowań żywności

Zaletą chromatografii gazowej jest możliwość użycia bardzo niewielkiej próbki analizowanej substancji - od nawet 0,01 µl do maksymalnie 100 µl.

TLC (ang. thin layer chromatography) - cienkowarstwowa chromatografia cieczowa - technika analityczna (rzadziej preparatywna), służąca do identyfikacji oraz oczyszczania mieszanin związków chemicznych.

Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza stacjonarna o właściwościach sorpcyjnych (silikażel, tlenek glinu, rzadziej celuloza lub ziemia okrzemkowa) jest umieszczona jako cienka (do 0.01-2 mm) warstwa na płytce szklanej, aluminiowej lub wykonanej z tworzywa sztucznego.

Substancje rozdzielane nanosi się punktowo przy dolnej krawędzi płytki, po czym płytkę umieszcza się w komorze chromatograficznej zanurzonej na kilka milimetrów w eluencie, tak by naniesione substancje nie zostały zanurzone. Eluent stopniowo wspina się po płytce dzięki zjawisku kapilarnemu. Powoduje to przemieszczanie się rozdzielanych substancji ku górze. Prędkość ruchu poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki rozdział jest zakończony.

Zależnie od swojej natury fizykochemicznej - składniki rozdzielanej mieszaniny docierają w tym czasie na różną wysokość płytki (współczynnik Rf), a równomierność rozmieszczenia plam substancji można charakteryzować ilościowo tzw. funkcjami CRF (chromatographic response functions). W przypadku, gdy substancje nie są naturalnie barwne, ich obecność można stwierdzić używając, zależnie od ich właściwości, światła UV, roztworów wywołujących (w których płytka jest zanurzana lub nimi spryskiwana - reagują one specyficznie i barwnie z rozdzielanymi substancjami) lub innych metod (np. wywoływanie w parach jodu, piroliza).

W preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej stosuje się zazwyczaj grubsze warstwy fazy stałej (1 - 2 mm), a rozdzielone związki chemiczne zeskrobuje się z płytki razem ze złożem, po czym wymywa się je za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika.

Chromatografia bibułowa to rodzaj chemicznej techniki analitycznej, podtyp chromatografii cieczowej, w której fazę rozdzielczą stanowi specjalna bibuła o wysokiej czystości i określonych parametrach.

Technika ta bywa też stosowana do oczyszczania i identyfikacji mieszanin związków chemicznych.

Mechanizm i techniki frakcjonowania

Prędkość ruchu poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny jest uzależniona od oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi tworzącymi analizowaną próbkę, a fazą rozdzielczą i rozpuszczalnikiem zwanym w tym przypadku eluentem.

Substancje rozdzielane nakrapia się punktowo przy dolnej krawędzi bibuły, po czym umieszcza się ją w komorze chromatograficznej zanurzoną na kilka milimetrów w eluencie, tak by nakropione substancje nie zostały zanurzone. Dzięki zjawisku występowania sił kapilarnych eluent stopniowo wznosi się po bibule ciągnąc za sobą z różną prędkością związki chemiczne tworzące analizowaną mieszaninę. Gdy czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi bibuły rozdział jest zakończony.

Ten etap analizy nazywany jest rozwijaniem chromatogramu. Dzięki różnicy prędkości wędrówki rozdzielanych związków chemicznych w momencie zakończenia analizy znajdują się one na bibule na różnych wysokościach względem czoła eluentu.

Ze względu na kierunek przepływu eluentu przez bibułę chromatografię bibułową dzieli się na:

• wstępującą - prowadzoną w sposób opisany powyżej, tzn z eluentem wędrującym po bibule z dołu do góry

• zstępującą - w której bibuła jest nasączana od góry a eluent wędruje z góry do dołu; tego rodzaju chromatografia wymaga specjalnej konstrukcji komory chromatograficznej.

Wywoływanie chromatogramu i chromatografia preparatywna

Po zakończonym etapie rozwijania, gdy przebiegał on prawidłowo, rozdzielone związki tworzą na bibule obszary o kształtach zbliżonych do łez. Gdy rozdzielanie związki są barwne obszary te można bezpośrednio obserwować w świetle widzialnym lub przy innej długości fali, którą analizowane związki absorbują. W przypadku aromatycznych związków organicznych jest to najczęściej światło UV. Gdy związki nie są barwne działa się na chromatogram odpowiednimi odczynnikami, które reagują z analizowanymi związkami nadając im przy tym barwę. Najczęściej stosowanym odczynnikiem wywołującym są pary jodu.

W celu odzyskania rozdzielonych związków chemicznych można je wymyć z określonego fragmentu bibuły. Jest to jednak dość uciążliwie i współcześnie raczej nie stosowane. Do preparatywnego rozdzielania związków stosuje się raczej chromatografię cienkowarstwową (TLC), lub preparatywną chromatografię kolumnową.

Chromatografia kolumnowa - jedna z metod chromatograficznych. Polega na rozdzieleniu mieszanin poprzez wprowadzenie jej na stałą fazę stacjonarną umieszczoną w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej na składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej, wprowadzanej z odpowiedniego zbiornika lub dolewanej bezpośrednio na kolumnę. Przepływ fazy ruchomej może być grawitacyjny lub wymuszony przez niewielkie nadciśnienie wprowadzanego eluentu (uzyskiwane np. za pomocą pompy perystaltycznej lub sprężonego gazu), lub przez niewielkie podciśnienie u wylotu kolumny (uzyskiwane np. za pomocą pompki wodnej).

W zależności od wielkości kolumn i ilości rozdzielanego materiału chromatografia kolumnowa może być wykonywana w skali analitycznej, laboratoryjnej (półpreparatywnej, preparatywnej) i przemysłowej.

HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna chromatografia cieczowa) – to technika analityczna a także preparatywna, stosowana do badania czystości, oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych.

Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka, jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku, zależnym od właściwości substancji i zastosowanego układu (czasem stosuje się fazę ruchomą) i w formie roztworu o znanym stężeniu i objętości jest kierowana na kolumnę, która wypełniona jest specjalnym złożem porowatym lub żelowym. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej) pełni odpowiednio dobrana mieszanina (tzw. eluencie). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. W zależności od zastosowanego układu można wyróżnić kilka mechanizmów retencji, np. te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) a słabiej z fazą ruchomą, przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej ze złożem a silniej z fazą ruchomą przepływają szybciej. W pewnych specyficznych układach HPLC mechanizmy retencji są jednak bardziej złożone.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. Wysokie ciśnienie w układzie HPLC wynika z budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar), uziarnienia wypełnienia kolumn (kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej stosowanego w aplikacji(od ułamków ml/min do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii preparatywnej). Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC dzięki czemu uzyskujemy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eluenta i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczesnych aparatów i kolumn HPLC są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Początkowo, stosowano normalny układ faz (NP), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (Np. układ: żel krzemionkowy – heksan). Obecnie najczęściej stosuje się odwrócony układ faz (RP – układ faz odwróconych), w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. układ: żel krzemionkowy z chemicznie modyfikowaną powierzchnią (grupy oktadecylosilanowe, oktylosilanowe, diole, podstawniki modyfikowane i inne, bardziej złożone) – mieszanina metanolu, acetonitrylu, wody, specjalnie dobranych buforów itp. Układy RP mają bardziej trwałe wypełnia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej a przede wszystkim cechują się inną selektywnością niż układy NP co wykorzystuje się w analizie próbek o dużej rozpiętości polarności komponentów.

Aparaty HPLC składają się zwykle z:

• zbiornika na eluenty, bufory, odpowiednie roztwory płuczące itp.

• automatycznego odgazowywacza, który usuwa gazy rozpuszczone w eluentach (przy chromatografii gradientowej po zmieszaniu składników często następuje samorzutne odgazowanie, przez co w strumieniu eluenta pojawiają się pęcherzyki powietrza mogące silnie zakłócać proces rozdziału na kolumnie i detekcji wymywanych składników)

• zaworów proporcjonujących, w których faza ruchoma osiąga zadany skład, co ma szczególne znaczenie w analizach gradientowych (tzw. gradient niskociśnieniowy, gdyż mieszanie składników eluenta następuje przed pompą, czyli w obszarze niskiego ciśnienia). Drugim typem jest tzw. gradient wysokociśnieniowy, gdzie najczęściej stosuje dwie identyczne pompy dla obu mieszanych składników eluentu (obie pompy zintegrowane są w jednej obudowie), mieszanie następuje za pompami, czyli w obszarze wysokiego ciśnienia. Układ z zaworami proporcjonującymi zazwyczaj umożliwia mieszanie większej ilości roztworów (najczęściej 4, podczas gdy układ wysokociśnieniowy najczęściej 2), w zamian układ wysokociśnieniowy umożliwia znacznie szybszą zmianę składu eluenta (dzięki znacznie mniejszej objętości układu między mieszaczem a kolumną).

• pomp zapewniających odpowiednie parametry przepływu eluenta w układzie. Pompa zazwyczaj zintegrowana jest w jednej obudowie z mieszaczem (wspomniany wcześniej układ nisko, lub wysokociśnieniowy).

• nastrzykiwacza (iniektora) umożliwiającego wprowadzanie analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu (często zautomatyzowany autosampler)

• odpowiednich filtrów, jeśli aplikacja tego wymaga

• prekolumny, która usuwa z eluenta zanieczyszczenie mechaniczne, które mogłyby zniszczyć wypełnienie kolumn.

  • najczęściej stosuje się wypełnienie identycznym lub porównywalne z właściwą kolumną do rozdziału

• kolumny (kolumn) z odpowiednim wypełnieniem

  • żel krzemionkowy lub jego modyfikację polarnymi grupami (faza normalna, NP)

  • żel krzemionkowy modyfikowany grupami o niskiej polarności (faza odwrócona, RP), najczęściej grupami oktadecylowymi, C18

  • wypełnienia polimerowe – bardzo odporne chemicznie, umożliwiają prace w całym zakresie pH, ale ustępują jak na razie możliwościom rozdzielczym wypełnień opartych na żelu krzemionkowym

• termostatu kolumn (pracującego w zakresie najczęściej od 5 do 80 °C)

• detektora – którym może być przepływowy spektrofotometr UV-VIS lub fluorescencyjny, spektrometr mas, laserowy spektrometr rozproszeniowy lub amperometr

• zbiornika na zużyty eluent lub w przypadku aparatów preparatywnych, kolektora frakcji (systemu naczyń zmienianych automatycznie po upływie zadanego czasu lub sterowanego sygnałami z detektora).

Chromatogram złożonej mieszaniny (perfumy) otrzymany techniką HPLC

W typowym, analitycznym aparacie HPLC, analiza jednej próbki trwa od kilku do kilkudziesięciu minut. Kolumny HPLC mają przeciętnie długość od 3 do 25 cm (bywają jednak kolumny o długości 30 cm lub większej) i przekrój wewnętrzny rzędu kilku milimetrów i mogą być czasem zestawiane w układy o określonej zdolności rozdzielczej. W czasie jednej analizy zużywa się od kilku do kilkudziesięciu mililitrów eluenta. Jako eluent stosuje się rozmaite rozpuszczalniki organiczne (metanol, chlorek metylenu, THF, toluen, etanol, acetonitryl, rozmaite bufory i inne.) Analizowana próbka ma zwykle objętość od 1 do 200 µl w analitycznej HPLC, a w preparatywnej do kilkudziesięciu mililitrów.

Do analiz bardzo małych ilości związków chemicznych stosuje się chromatografy typu nanoHPLC. Kolumny tych chromatografów mają średnicę kilkudziesięciu µm i długość od kilkunastu do kilkudziesięciu cm. Chromatografy nanoHPLC pracują przy szybkości przepływu eluenta rzędu kilkuset nl na minutę. Analiza próbki trwa kilkadziesiąt do kilkuset minut. Chromatografy nanoHPLC charakteryzują się bardzo dużą rozdzielczością kosztem mniejszej powtarzalności uzyskanych wyników.

Aparaty do preparatywnej HPLC posiadają kolumny o znacznie większych przekrojach od aparatów do analitycznej HPLC (rzędu kilku do kilkudziesięciu centymetrów), co umożliwia rozdzielanie na nich większych objętości analizowanych substancji – rzędu kilku ml lub więcej. Budowa pomp układów preparatywnych zasadniczo rożni się od aparatu analitycznego co wynika ze stosowania większych przepływów fazy ruchomej.

Szczególnym przypadkiem HPLC jest SEC (size exlusion chromatography) zwany również GPC (gel permeation chromatoraphy). Techniki te są oparte na porowatych wypełnieniach żelowych, w których rozdział następuje nie wskutek powinowactwa chemicznego analizowanych związków do wypełnienia, lecz wskutek zatrzymywania cząsteczek analizowanej mieszaniny przez pory fazy stacjonarnej. Przez kolumny SEC szybciej przechodzą związki o większej masie cząsteczkowej, a wolniej o mniejszej. Jest to metoda stosowana do oznaczania średnich mas cząsteczkowych polimerów i ich polidyspersji.

Chromatografię cieczową (zwłaszcza analityczną) można realizować w kilku rożnych wariantach:

• chromatografia par jonowych (stosowane są dodatki związków powierzchniowoczynnych)

• chromatografia jonowymienna (wypełnienia o właściwościach wymieniaczy jonowych)

• rozdziały enancjoselektywne z odpowiednio dobranym wypełnieniem kolumny i/lub składem fazy ruchomej

Wszystkie wymienione rodzaje chromatografii można realizować w układzie analizy gradientowej, w których skład fazy ruchomej jest zmienny w czasie analizy (wzrost siły elucyjnej w układzie w przypadku analiz w odwróconej fazie, zmiana siły jonowej w przypadku chromatografii jonowymiennej).

Coraz częściej stosuje się tak zwaną ultrasprawną chromatografię UPLC (ang. Ultra Performance Liquid Chromatography). W tym przypadku stosuje się krótsze (kilka cm, zazwyczaj nie więcej niż 10 cm) kolumny o mniejszej średnicy wewnętrznej rzędu 1-2 mm, oraz z mniejszym uziarnieniem złoża w kolumnie (2-3 µm zamiast powszechnie używanych 5 µm). Dzięki mniejszym ziarnom złoża rośnie stopień ich upakowania, a tym samym powierzchnia ziaren w jednostce objętości, czego efektem jest zwiększenie sprawności kolumny (w praktyce kolumny UPLC są kilka razy krótsze od tych w HPLC, ale ich sprawność wyrażona ilością półek teoretycznych na kolumnę jest zazwyczaj taka sama). Rozdział mieszaniny prowadzi się przy zwiększonym liniowym przepływie fazy ruchomej, co w połączeniu z bardziej upakowanym złożem powoduje zwiększenie ciśnienia, dochodzącego nawet do 1000 atm. Całkowity przepływ fazy ruchomej jest jednak mniejszy ze względu na dużo mniejszą średnicę kolumny i krótszy czas analizy (dzięki znacznemu skróceniu kolumny). Największymi zaletami UPLC jest znaczne zredukowanie ilości fazy ruchomej użytej do analizy i skrócenie jej czasu.