Detektor wychwytu elektronów ECD: detektor selektywny. Podstawową częścią detektora jest komora jonizacyjna, w której znajduje się źródło promieniowania β (folia z ⁶³Ni), katoda oraz elektroda zbiorcza- anoda. Gaz nośny (azot lub argon) trafia do komory jonizacyjnej, gdzie jest jonizowany przez cząstki β emitowane ze źródła. Powstałe zgodnie z równaniem: β+N₂→N₂⁺ + e^- jony dodatnie i elektrony są zbierane przez elektrody, W ten sposób tworzy się prąd tła o natężeniu rzędu 10^-8A. Do detektora trafia substancja, która ma powinowactwo do e^-, wyłapuje ona e^- i ładuje się ujemnie. Dochodzi do zaburzenia prądu. Wychwytywanie: M+e^- →M^-. Rekombinacja z dodatnimi jonami gazu nośnego: M^- + N₂⁺→ M + N₂. Następuje spadek prądu tła. ECD jest detektorem selektywnym, charakteryzującym się dużą czułością na halogenozwiązki. Jest bardzo przydatny do oznaczania chloropestycydów. Wykrywalność jest rzędu 10^-14g Cl/cm³ gazu nośnego. Stosowany także do analizy farmaceutyków, gazów trujących, węglowodorów policyklicznych, tlenu, NO_x. Można stosować rozpuszczalniki, na które on nie reaguje i nie ma ich pików na chromatogramie. Nieprzydatny w analizie węglowodorów alifatycznych, estrów, eterów.

Detektor masowy MSD. substancje wprowadza się do komory próżniowej, gdzie jest ona jonizowana. Zjonizowane cząstki rozpadają się na fragmenty, które są segregowane przez analizator masowy wg stosunku masy do ładunku i następnie są zbierane przez kolektor. Na kolektorze fragmenty jonów tworzą sygnały elektryczne proporcjonalne do liczby jonów/ Wszystkie te sygnały są następnie przetwarzane na widmo masowe. Można otrzymać całkowity chromatogram jonowy i widmo masowe (rozpad na fragmenty→odcisk palca tej substancji), będące podstawą do identyfikacji substancji. Widmo masowe jest charakterystyczne dla każdej substancji.

SPECJALNE TECHNIKI W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

Pirolityczna chromatografia gazowa (do związków trudno lotnych: polimery) polega na częściowym lub całkowitym rozkładzie próbki z utworzeniem lotnych produktów rozkładu, które z kolei są rozdzielana metodą GC. Pirolizer połączony jest z dozownikiem, bądź zastępuje dozownik. Rozkład zachodzi w przepływającym gazie nośnym, a produkty rozpadu są bezpośrednio wprowadzane na kolumnę. Stosuje się temp. 400-600⁰C. Otrzymany chromatogram nazywany jest pirogramem (charakterystyczny dla danej próbki, umożliwia to identyfikację nieznanych próbek przez porównanie z pirogramami standardowymi wykonanymi w tych samych warunkach). Metoda odcisku palca, wykorzystywana w kryminalistyce, medycynie sądowej. Rodzaje pirolizerów: piecowe - ogrzewanie el., pirolizery z ogrzewaniem oporowym, indukcyjnym, pirolizery laserowe. Dozownik próbki = cewka indukcyjna, element grzejny z materiału ferromagnetycznego. Pirolityczna chromatografia gazowa umożliwia: badanie mechanizmów reakcji pirolizy substancji, analizę nieznanej substancji poprzez produkty jej pirolizy. Identyfikacja i analiza ilościowa nielotnych substancji metodą pirolityczną jest możliwa, gdy: fragmenty powstające w reakcji pirolizy są charakterystyczne dla danego związku, gdy reakcji pirolizy jest odtwarzalna, gdy proces pirolizy jest szybki i łatwy do przeprowadzenia.

Metoda HEADSPACE - analiza równowagowej fazy gazowej nad roztworem. Służy do oznaczenia składnikach w matrycach trudno lotnych lub nielotnych. Polega ona na analizie gazu (pary) pozostającego w równowadze termodynamicznej nad trudno lotna cieczą lub ciałem stałym w układzie zamkniętym. Podstawą tej metody jest zależność cząstkowego ciśnienia p_i składnika i w fazie gazowej od jego stężenia w ciekłej mieszaninie zgodnie z prawem Raulta: p_i= x_i p_i⁰ , gdzie p_i⁰ - oznacza prężność pary nad czystym składnikiem, a x_i - ułamek molowy składnika i w mieszaninie ciekłej . Prężność p_i jest proporcjonalna do powierzchni piku A_i, a zatem: A_i = kx_i p_i⁰γ_i , gdzie k - współczynnik proporcjonalności, γ_i- współczynnik aktywności odnoszącej się do układów rzeczywistych. Metoda HEADSPACE umożliwia oddzielenie lotnych składników od lepkich lub stałych komponentów próbki, które zakłócałyby przebieg procesu chromat. Temp. od pokojowej do 200⁰C.

Badania w układzie statycznym lub dynamicznym.

Statyczna metoda HEADSPACE - polega na bezpośredniej analizie lotnych substancji w fazie gazowej pozostającej w równowadze z badaną matrycą. Śladowe ilości - zwiększenie czułości przez: termostatowanie w wyższej temperaturze, dodatek soli nieorganicznych do roztworów wodnych, wysalanie odpowiednia zmiana wartości pH, dodatek do rozpuszczalników organicznych.

Dynamiczna metoda HEADSPACE- ciągłe przepuszczanie gazu obojętnego nad powierzchnią próbki i zatrzymywanie wypłukanych w ten sposób substancji lotnych przez adsorpcję lub wymrażanie. Można analizować małe ilości, czułość jest większa. Wada: kłopot z analitami (ogrzewanie, desorpcja),metoda pracochłonna.

Zastosowanie HEADSPACE: w medycynie (oznaczanie subst. toksycznych i alkoholu we krwi), lotne zanieczyszczenia wody i gleby- analiza zanieczyszczeń gleby substancjami ropopochodnymi), analiza polimerów- pozostałości rozpuszczalników w polimerach, monomerów; wydzielanie się lotnych substancji na skutek rozkładu tworzywa, analiza artykułów żywnościowych ( etanol i metanol w napojach alk.), fizykochemiczne parametry substancji.

Analiza chromatograficzna z zastosowaniem derywatyzacji analitów. chromatografia gazowa jest metodą analizy związków lotnych. Wiele substancji, takich jak: cukry, aminokwasy, wyższe kwasy tłuszczowe, steroidy nie spełnia warunku lotności. Dlatego przeprowadza się je w odpowiednie pochodne o zwiększonej lotności. Proces ten określony jest jako derywatyzacja, polega na podstawieniu wodoru w polarnych grupach, takich jak -OH, -COOH, -NH₂ itp., rodnikami organicznymi, a najczęściej grupą trimetylosililową -Si(CH₃)₃ . Do trimetylosililowania używa się różnych związków a m.in. trimetylochlorosilanu (CH₃)₃-Si-Cl, heksametylodisilazanu (CH₃)₃-Si-N=N-Si-(CH₃)₃ lub bis(trimetylosililo)acetamidu. Derywatyzacja dla GC obejmuje także alkilowanie i estryfikację. Można prowadzić derywatyzację w celu zwiększenia czułości detekcji- przez wprowadzenie grup odpowiednich do wykrywania za pomocą czułego detektora.

Jako fazy ciekle zaleca się oleje i żywice silikonowe. Derywatyzację stosuje się tylko wtedy,gdy nie ma innego wyjścia. Są błędy w analizie ilościowej, jest droga i długa.

CHROMATOGRAFIA CIECZOWA- analiza większej ilości związków niż w chromatografii gazowej- 80% wszystkich. Mogą to być ciecze, ciała stałe, nielotne- polimery, nieorganiczne. Warunkiem analizy jest rozpuszczalność związków. Nazwa chromatografia cieczowa obejmuje te metody, w których fazą ruchomą jest ciecz.

Podział: kolumnowa i planarna( rozdział na płaszczyźnie).

ELUAT- wypływa z kolumny, ELUENT- faza ruchoma- wprowadzany na kolumnę.

W zależności od rodzaju fazy stacjonarnej chromatografię cieczową dzielimy na: chromatografię ciecz-ciało stałe, chromatografię ciecz-ciecz, chromatografię jonowymienną, chromatografię żelową, chromatografię powinowactwa.

Zwykła kolumnowa chromatografia cieczowa: daje małe efekty, cechuje się dużym zużyciem fazy ruchomej. Stosuje się ją do rozdziału dużej ilości mieszanin na skalę preparatywną.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC. Podział ze względu na rodzaj fazy stacjonarnej:

-chromatografia adsorpcyjna;

-chromatografia podziałowa- stosuje się fazy chemicznie związane;

-chrom. Jonowymienna- wymieniacze anionowe, kationowe; stosowana do rozdziału kwasów lub zasad;

-chrom. Żelowa (sitowa)- rozdział związków wielkocząsteczkowych (polimery);

1,2- zbiorniki eluentów;3- pompa; 4-manometr; 5-dozownik;6-prekolumna;7-kolumna (może, ale nie musi być w termostacie); 8-termostat;9-przepływomierz;10- detektor;11- kolektor frakcji (zbiera poszczególne frakcje); 12-rejestrator, integrator, komputer. Z 1,2 zasysana jest faza ruchoma, próbka wprowadzana jest do dozownika.

Pompy stosowane w HPLC:

• pompy stałociśnieniowe- gaz sprzężony pod stałym ciśnieniem oddziałuje na eluent ; wymusza stały przepływ. Zaletą tych pomp jest prosta konstrukcja i brak pulsacji ciśnienia, a wadą możliwość niepożądanych zmian przepływu fazy ruchomej spowodowanych zmianą lepkości cieczy wywołanej zmianą temperatury oraz zmiana oporu wypełnienia kolumny.

• Pompy stałoprzepływowe- stały przepływ fazy ruchomej;

1. wyróżniamy pompy z tłokiem posuwisto-zwrotnym (najczęściej z jednym lub dwoma tłokami); wadą ich może być pulsacja cieczy powodująca niestałość linii zerowej (pulsację można zmniejszyć przez zmniejszenie objętości cieczy pompowanej w jednym cyklu tłoka przez zastosowanie cylindrów o małej objętości i zwiększenie prędkości ruchów tłoka lub przez zastosowanie pomp dwutłokowych współdziałających w cyklu przesuniętym o 180^o)

2. pompy strzykawkowe- pracują bezpulsacyjnie, a ich wadą jest stosunkowo mała ilość fazy ruchomej zużywanej w jednym cyklu pracy (może wynosić 250-500cm³), stąd konieczność przerywania procesu w celu napełnienia cylindra rozpuszczalnikiem.

Dozowanie w HPLC.

Dozować w HPLC nie można ręcznie ze wzgl na b. Wysokie ciśnienia występujące w układzie. Stosuje się zawory dozujące z kapilarami (kilka- kilkadziesiąt μl); kierunek przepływu fazy ruchomej zależy od położenia zaworu, może omijać zawór lub przechodzić przez niego. Istnieją dwa typy pętli: zewnętrzna (wymienialna o zmiennej objętości od 0,01 do 0,5 cm³) i wewnętrzna o stałej małej objętości próbek rzędu kilku tysięcznych cm³.Zawory z pętlą umożliwiają wprowadzenie próbek w szerokim zakresie objętości i z dobrą odtwarzalnością.

Kolumny (zachodzi w nich właściwy proces rozdziału). W zależności od wielkości próbki możemy wybrać dla HPLC mikrokolumny, kolumny analityczne i kolumny preparatywne. Do celów analitycznych stosujemy zwykle kolumny analityczne. Są one zdecydowanie krótsze, dł. Ok. 15-20 cm, o średnicy kilku mm (ok. 3-5); wielkość porów wypełnienia 3-7 μm; kolumny są drogie, samodzielnie się ich nie przygotowuje, szybko się zużywają, dlatego stosuje się : prekolumny ( kolumny ochronne)- które montuje się przed kolumną właściwą, jej długość ok. 1-3cm. Działa jak filtr na zanieczyszczenia; przedłuża czas życia kolumny właściwej.

Wypełnienia-o rozmiarach ziaren ok. 5-10 μm, czasami ok. 3 μm. W normalnym układzie faz- faza stacjonarna polarna ( żel krzemionkowy) , czasami stosuje się tlenek glinu. Żel krzemionkowy łatwo absorbuje wodę na swojej powierzchni- dezaktywuje się. W związku z tym fazy ruchome powinny być odwodnione. Czasami specjalnie wcześniej dezaktywuje się powierzchnię żelu krzemionkowego (adsorpcja alkoholu) lub chemicznie, taki żel można stosować do analiz alkoholi, amin, kwasów (b. polarne). Do związków mniej polarnych stosuje się żele niezdeaktywowane.

Modyfikacja żelu krzemionkowego- związana z aktywnymi grupami żelu krzem; modyfik. Się związkami organicznymi ( łańcuchy alkilowe lub łańcuchy alkilowe zakończone grupami funkcyjnymi)- fazy związane- otrzymuje się z nich wypełnienia niepolarne.

Faza oktadecylosilanowa- do analizy homologów.

W przypadku związków, które są izomerami optycznymi (mieszaniny racemiczne), stosujemy wypełnienie z dodatkami związków optycznie czynnych.

Do analizy związków jonowych stosuje się wymieniacze jonowe, a do rozdzielania na zasadzie anionów- wymieniacze anionowe, np. czwartorządowe aminy, stos. do analizy kwasów organicznych. Do rozdzielania na zasadzie wymiany kationów służą wymieniacze kationowe, np. aromatyczne kwasy sulfonowe, stos. do analizy zasad.

Sitowa chromatografia kolumnowa- o rozdziale substancji decydują wymiary rozdzielanych cząsteczek. Wypełnienia kolumn stanowią żele o zdefiniowanych średnicach porów, zbliżonych do rozmiarów cząstek rozdzielanych substancji. Kolumna wypełniona żelem o różnych rozmiarach porów- najmniejsze cząstki analizowanej substancji wnikają do wszystkich porów- ich czas przebywania w kolumnie jest długi; największe cząstki mieszaniny badanej przechodzą przez przestrzenie między wypełnieniem- przebywają w kolumnie krótko.

W konwencjonalnej chromatografii żelowej jako wypełnienia kolumn są stosowane usieciowane żele dekstranowe (sephadexy) i usieciowane żele poli(akryloamidowe). Są to żele pęczniejące w wodzie i dlatego nie można ich stosować w technice HPLC. W wysokociśnieniowej chromatografii żelowej są stosowane żele sztywne, do których zalicza się żele krzemionkowe o dużych średnicach porów, szkło o kontrolowanej porowatości, a także usieciowany polistyren o strukturze makroporowatej.

Temperatura - z reguły zawsze ogrzewa się kolumnę; temperatura odgrywa ważną rolę- podwyższenie temp kolumny- analiza substancji trudno rozpuszczalnych w fazie ruchomej (zwiększa się ich rozpuszczalność). W chrom jonowymiennej im wyższa temperatura tym szybsza wymiana jonowa.

Fazy ruchome - są nimi pojedyncze rozpuszczalniki lub ich 2-3 składnikowe mieszaniny. Skład eluentu może być stały - elucja izokratyczna ; lub może się zmieniać - elucja gradientowa.

Dobór fazy ruchomej:

-rodzaj składników rozdzielanej mieszaniny;

-rodzaj zastosowanego wypełnienia kolumny;

-rodzaj detektora;

-f.ruchoma nie może działać szkodliwie na rozdzielane związki i wypełnienie;

-musi dobrze rozpuszczać analizowaną mieszaninę i umożliwiać detekcję jej składników;

-stosuje się rozpuszczalniki o specjalnej czystości, nie może zawierać śladów powietrza.

Odgazowywanie fazy ruchomej:

1.Ogrzewanie pod chłodnicą zwrotną do temperatury zbliżonej do temperatury wrzenia;

2.Odparowanie za pomocą łaźni ultradźwiękowej;

3.Przepłukiwanie gazem obojętnym

Przy doborze fazy ruchomej należy brać pod uwagę jej siłę elucyjną- oddziaływanie cząstek eluentu z powierzchnią fazy stacjonarnej.

Im większa siła elucji fazy tym ruchomej tym łatwiej wypiera z powierzchni adsorbenta cząsteczki substancji analizowanej.

W normalnym układzie siłę elucji wyznacza polarność fazy stacjonarnej. W odwróconym układzie faz i niepolarnym adsorbencie polarność nie ma wpływu na siłę elucji, wzrasta ona wraz ze wzrostem rozmiarów niepolarnych fragmentów rozpuszczalnika. Im większa polarność tym siła elucji rośnie. W odwróconym układzie faz największą silę elucji mają związki niepolarne, najmniejszą- polarne. W normalnym układzie faz szereg: n- pentan< n- heksan<cykloheksan<cyklopentan, w układzie odwróconym jest odwrotnie.

Oprócz polarności znaczenie ma lepkość rozpuszczalnika-ma on wpływ na wysokość ciśnienia w kolumnie(lepsze są o małej lepkości).W zależności od rodzaju detektora(refraktometryczny)bierzemy pod uwagę in.czynniki- współczynnik załamania światła. UV- graniczna długość fali przy której rozpuszczalnik staje się nieprzezroczysty. Faza ruchoma w chrom. sitowej- powinna być obojętna w stosunku do fazy ruchomej i do wypełnienia kolumny. Zadaniem fazy: transport, znaczenie ma tylko rozpuszczalność, pozostałe właściwości bez znaczenia. PH fazy ruchomej- wpływa na retencję substancji o charakterze jonowym. Dobierając pH można rozdzielać metodą w odwróconym układzie faz kwasy i zasady, pod warunkiem, że przy danym pH zostanie cofnięta ichdysocjacja jonowa RCOOH↔RCOO(-)+ H(+) siła reakcji przesunięta w lewą stronę. Podsumowanie do normalnego i odwróconego układu faz. W normalnym układzie faz stosujemy polarne fazy stacjonarne( żel krzemionkowy),jako ruchome fazy(heksan, izooktan, chloroform, chlorek metylenu) stosowane są rozpuszczalniki o mniejszej polarności; Fazy te muszą być bezwodne. W odwróconym układzie faz: faza stacjonarna jest słabo polarna lub niepolarna (wypełnienia chemicznie związane C18,C8,C2), faza ruchoma jest bardziej polarna(tetrahydrofuran, autonitryl, metanol, woda). Robiąc mieszaniny z wodą ↑ilość wody powoduje wydłużenie tr substancji niepolarnych, a wzrost rozpuszczalnika nieorganicznego powoduje skrócenie tr.

Dobór mieszaniny do rozdziału. W normalnym układzie faz zbyt długi czas retencji można skrócić stosując eluent bardziej polarny, który w tym układzie będzie miał większa siłę elucji. W odwróconym ukł.faz długo tr można skrócić stosując eluent mniej polarny, np.wodny roztwór o mniejszej zawartości metanolu, o większej sile elucji. Zmianę składu rozpuszczalnika stosujemy w elucji gradientowej. W czaise rozdzielania składników jednej próbki skład eluentu zmienia się, a jego siła elucji zwiększa się. Zmiana składu mieszaniny stosowanej jako faza ruchoma może być liniowa lub przebiegać np. skokowo.

Dobór składu fazy ruchomej. Analizę niepolarnych związków np.weglowodorów, ich pochodnych chlorowcowych lub związków zawierających rodniki, czyli związków dobrze rozpuszczalnych się w heksanie, wykonuje się w odwróconym układzie faz. Jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę 0-30%wody w metanolu lub acetonitrylu. Substancje o pośredniej polarności rozpuszczają się w estrach, alkoholu i chloroformie. Mogą oddziaływać z grupami aktywnego żelu krzemionkowego i polarnymi grupami faz związanych. Do ich analizy stosuje się mieszaniny 2-50% organicznego rozpuszczalnika polarnego w rozpuszczalniku niepolarnym, np. w węglowodorze. Jeżeli mamy polarne związki organiczne rozpuszczalne w wodzie, często rozdzielane są w odwróconym układzie faz. Faza ruchoma zawiera2-50% rozpuszczalnika organicznego(metanol, acetonitryl) w wodzie. Jeżeli związki są substancjami jonowymi do fazy ruchomej dodaje się rozwory buforowe, sole, kwasy. Związki jonowe można analizować na wymieniaczach jonowych stosując roztwory buforowe jako eluent.

WYKŁAD 20.01 DETEKTORY W HPLC

Detektory- mierzące właściwości eluatu jako całości-refraktometry; mierzące właściwości rozdzielanej substancji- fotometry. Komórki pomiarowe detektora są bardzo małe 0,01-10μl.

REFRAKTOMETRY- działają na zasadzie pomiaru współczynnika załamania światła eluatu w zależności od stężenia substancji analizowanej ( w nim rozproszonej). Przez jedna komórkę pomiarowa przepływa sam eluent, przez drugą eluat. Im większa różnica załamania światła fazy ruchomej i analizowanej substancji tym większa czułość detektora względem analizowanego związku. Należy odpowiednio dobrać fazę ruchomą, aby współczynnik załamania światła różnił się w stosunku do substancji rozdzielanej. WADA- wrażliwość na zmiany T i ciśnienia- nie nadaje się do elucji gradientowej, wymagane jest termostatowanie. Wymaga też zainstalowania pompy, która nie wykazuje pulsowania, albo trzeba tłumić pulsacje. Najbardziej uniwersalne są do: chromatografii żelowej- analiza polimerów;- Analiza substancji powierzchniowo czynnych;-cukrów i alkoholi.

FOTOMETR- do absorpcji w nadfiolecie(detektor UV)- działa na zasadzie pomiaru pochłaniania światła z zakresu UV. Jest najlepszy i najczęściej stosowany w HPLC.

a)detektor pracuje przy określonej długości fali 254nm- 60%związków przy tej długości fali pochłania promieniowanie, źródłem promieniowania lampy lub źródła fosforescencyjne. b)- pomiar absorpcja przy określonej długości fali; bardziej zaawansowany; ale rejestrowanie widm przy zatrzymywanym przepływie kłopotliwe. Najnowsze- rejestrowanie widm bez zatrzymania przepływu przy zastosowaniu szybko analizującego spektrometru. Nie jest wrażliwy na zmiany T i przepływu.

Wada: ograniczenie zastosowania tego detektora do związków, które pochłaniają w UV- związki zawierające wiązania nienasycone = i grupy chromo -CH=CH-; -N=N; =C=O. Należy uwzględnić absorpcję UV przez fazę ruchomą. Ważna jest granica pochłaniania w UV fazy ruchomej.

Im mniejsza długość fali granicznej ty bardziej czuły detektor. Detektory mają znacznie większą czułość w porównaniu do refraktometrów.

Detektor z matrycą diodową DAD. Matryca d- układ 211 diod, z których każda rejestruje pochłanianie przy innej długości fali. Można analizować i rejestrować pochłanianie przy dł. Fali 190-600nm.Czas analizy 10 milisekund. Detektor ten ma operację sprawdzania czystości piku - czy jeden czy dwa położone. Można korzystać z biblioteki widm. Są produkowane chromatografy cieczowe z detektorem masowym (detektor masowy wymaga próżni) → LCMS.

Chromatografia planarna- proces chromatografowania zamiast w kolumnie prowadzony jest na płaszczyźnie. Wykonuje się ją na bibule lub na cienkich warstwach sorbentów osadzonych na podłożu z płytek szklanych lub z folii aluminiowych albo polimerowych. Rozróżniamy w ten sposób chromatografię bibułową i cienkowarstwową(TLC). W chromatografii planarnej stosuje się takie same fazy ruchome jak w cieczowej chromatografii kolumnowej; dobór eluentu odbywa się na tych samych zasadach. Proces chromatografowania przeprowadza się w odpowiednich komorach chromat. Próbki rozdzielane nanosi się na płytkę w ilości 10^-4-2*10^-2 cm³; na jednej płytce można umieścić kilka próbek; płytki umieszcza się w komorze chromatograficznej, w której na dnie znajduje się rozpuszczalnik-eluent. W wyniku działania sił kapilarnych rozpuszczalnik jest wciągany w górę płytki. W wyniku ruchu rozpuszczalnika i oddziaływania substancji rozdzielanych z sorbentem następuje rozdzielenie składników na płytce i poszczególne składniki tworzą oddzielne plamki lub strefy. Im substancja bardziej oddziaływuje z fazą stacjonarną tym jej droga będzie dłuższa. Droga - charakteryzuje jakościowo związki. Analizę należy przeprowadzać w różnych warunkach.

Rys Płytka z chromatogramem rozwiniętym techniką TLC;1-punkty startowe, 2-czoło fazy ruchomej, A- odległość od punktu startu do środka plamki substancji, B-odległość od punktu startu do czoła fazy ruchomej, a,b,c,a1,b1,c1,a2,b2,c2 - substancje chromatografowane.

Współczynnik opóźnienia Rf - określa położenie substancji na chromatogramie. Jest to stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej (A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (B), czyli Rf=A/B. Współczynnik ten przyjmuje wartości od 0-1 i jest charakterystyczny dla danej substancji -jest taki sam w takich samych warunkach prowadzenia rozdziału chromatograficznego. Jest to odpowiednik czasu retencji.

K=(1-Rf)/Rf

K=(tr-tm)/tm stąd tr=tm(k+1)

Wizualizacja chromatogramów:

Płytkę po wyjęciu z komory wyciągamy, zaznaczamy dokąd doszedł rozpuszczalnik, jeżeli substancje analizowane są bezbarwne należy przprowadzić wizualizację: spryskuje się płytkę odczynnikami, które reagują z substancjami analizowanymi i powstaje barwny produkt.W tym celu zanurzamy płytki w odczynniku, a jeśli odczynnik jeest w fazie gazowej - w pojemniku -amoniak, pary jodu (żółte lub brązowe). Roztwory KmnO₄ w stęż.H₂SO₄ lub NaOH-utlenia związki oznaczane -na fioletowym tle brązowe plamki są produktami utleniania. Amoniakalny roztwór AgNO₃- łagodny utleniacz- plamki od pomarańczowych do czarnych.

Jeżeli analizujemy związki zawierające ..........................,to do wizualizacji stosuje się roztwór dinitrofenylohydrazyny. Często do wizualizacji stosuje się naświetlanie światłem UV 254nm-plamki uwidaczniają się tylko,gdy płytka znajduje się w świetle UV.

ANALIZA JAKOŚCIOWA W TLC(CHROMATOGRAFII PLANARNEJ)

Opiera się na charakterystycznych reakcjach chemicznych poszczególnych plamek, a także na porównaniu współczynnika opóźnienia R_f wzorca i badanej próbki.

ANALIZA ILOŚCIOWA W TLC.

Porównanie rozmiarów lub intensywności zabarwienia plamki z analogicznymi parametrami plamek wzorców.

DENSYTOMETRIA- mierzy się intensywność zabarwienia plamki za pomocą układu optyczno-elektronicznego, otrzymując wykres w postaci densytogramu. Chromatogramy plamkowe zostają przekształcone w chromatogramy pikowe.

Istota densytometrii- światło o odpowiedniej długości fali pada wzdłuż linii rozwijania chromat. na poruszającą się płytkę. Światło jest pochłaniane różnie przez adsorbent i przez plamki- światło odbite od próbki ma różną intensywność w zależności od miejsca, na które padło. Densytogram powstaje w wyniku rejestracji zmian intensywności odbitego światła przez układ diod i zapisania po elektronicznej obróbce w postaci pików.

PŁYTKI DO CHROMATOGRAFI CIENKOWARSTWOWEJ

Warstwę fazy stacjonarnej osadza się na podłożu ze szkła, folii aluminiowej albo tworzywa sztucznego. Płytki różnią się grubością warstwy adsorbentu (analityczne-cieńszy- 0,1-0,25mm; preparatywne- 0,5-2mm).Mogą to być płytki TLC albo wysokosprawne HPTLC z adsorbentem o drobniejszym uziarnieniu i węższych frakcjach sitowych. Produkowane są płytki zawierające czynnik fluoryzujący, oznaczane F₂₅₄. jako wskaźniki fluoryzujące- siarczek kadmu i krzemian cynku. Aby warstwa adsorbentu była trwała stosuje się środek wiążący, najczęściej gips razem ze skrobią.

Sorbenty w TLC- stosuje się takie same sorbenty jak w chromatografii kolumnowej: polarne hydrofilowe, lipofilowe, średniopolarne, normalny układ faz- żel krzemionkowy, odwrócony układ faz- fazy związane chemicznie, poliamid.

Komory: poziome, pionowe, ciśnieniowe.

Porównanie chromatografii cieczowej kolumnowej z TLC. Techniki te są dla siebie konkurencyjne. Zalety TLC w porównaniu do HPLC: analiza TLC nie wymaga szczególnego przygotowania próbki, zanieczyszczenia nie przeszkadzają, płytkę wykorzystuje się tylko raz; nie trzeba zatężać próbki, na TLC- kilkakrotnie nanosimy próbkę. W TLC można próbki nanosić na płytkę w dużej objętości Mogą być próbki rozcieńczone, bo rozpuszczalnik będzie usuwany. Na jednej płytce można analizować kilkanaście próbek jednocześnie. Metoda bardzo szybka. Nie trzeba zwracać uwagi na to, żeby faza ruchoma była odpowiednio dobrana do detektora. Jeżeli analizujemy substancje barwne można zobaczyć rozdział. Cena analizy TLC 20% ceny analizy HPLC. HPLC jest jednak bardziej dokładna niż TLC.

Technika TLC odgrywa dużą rolę w laboratoriach biochemicznych do identyfikacji białek, polipeptydów, aminokwasów i kwasów nukleinowych. Na płytkach cienkowarstwowych można uzyskać „mapy” aminokwasów uzyskane z hydrolizatorów białkowych, które mają istotne znaczenia w diagnostyce medycznej. Jest też stosowana w laboratoriach farmaceutycznych i do kontroli żywności.

---