II.2. WYPOSAŻENIE LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNEGO

2.1. Podstawowa aparatura mikrobiologiczna

Autoklaw

Urządzenie służące do sterylizacji niektórych pożywek oraz jałowienia drobnego sprzętu mikrobiologicznego (płytki Petriego, kolby, probówki, zlewki, butelki).

Rys.2. Widok ogólny autoklawu (1):

1. Gałka zaworu bezpieczeństwa,

2. Manometr komory sterylizacyjnej,

3. Manometr kotła,

4. Zawór trójdrożny manometru,

5. Termometr tarczowy wskazujący temperaturę w komorze,

6. Rączka zamka pokrywy,

7. Dźwignia zaworu sterującego,

8. Zawór doprowadzający parę do kotła,

9. Dźwignia zaworu selekcyjnego,

10. Wskaźnik poziomu wody w komorze

11. Zawór odpowietrzający komorę,

12. Zawór odprowadzający kondensat z komory sterylizacyjnej

Autoklaw to hermetycznie zamknięty kocioł stalowy o podwójnych ścianach i dnie, w którym uzyskuje się wysokie ciśnienie. Jest zaopatrzony w manometr, termometr, zawór bezpieczeństwa i elektryczny system grzewczy. Czynnikiem jałowiącym w autoklawie jest przegrzana nasycona para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. W aparacie gotująca woda doprowadza do nadciśnienia parę wodną, która ulega nasyceniu po zupełnym wyparciu powietrza. Manometr znajdujący się w obudowie wskazuje wzrost ciśnienia po zamknięciu zaworu odpowietrzającego. Większość podłoży wyjaławia się w temperaturze 121°C przez 20 – 30 min, pożywki zawierające cukry i inne składniki termowrażliwe - 117°C, a materiał zawierający drobnoustroje zakaźne w temperaturze 134°C.Ponieważ autoklaw to kocioł pracujący pod wysokim ciśnieniem, stąd osoby go obsługujące muszą przejść odpowiednie szkolenie. W przypadku zauważenia jakichkolwiek usterek (nieszczelności, niekontrolowany wzrost ciśnienia i temperatury) autoklaw należy natychmiast odłączyć od źródła zasilania i za pomocą zaworu bezpieczeństwa zredukować ciśnienie.

Pasteryzator

Typowym pasteryzatorem jest aparat Kocha. Jest to lekki, metalowy kocioł parowy z dodatkowym ażurowym dnem, pod którym znajduje się zbiornik z wodą. Kocioł przykryty jest luźną pokrywą z otworem na termometr i wylot pary wodnej. W obudowie znajduje się również wskaźnik poziomu wody. Źródłem wytwarzanej pary jest woda znajdująca się na dnie kotła, którą doprowadza do wrzenia system grzałek. Czynnikiem wyjawiającym jest bieżąca para wodna o temperaturze około 100^°C. Służy do wyjaławiania pożywek mikrobiologicznych zawierających termowrażliwe składniki. Wyjaławiany nateriał ustawia się na ażurowych półkach. Czas pasteryzacji zależy od objętości i rodzaju wyjaławianego materiału i wynosi od 15-60 min.

Rys.3. Aparat Kocha (10)

Suszarki

Zaopatrzone w termoregulator urządzenia ogrzewane energią elektryczną, służące do sterylizacji szkła laboratoryjnego i niektórych związków chemicznych oraz suszenia różnych substancji. Czynnikiem wyjaławiającym jest suche, gorące powietrze. Czas jałowienia w temperaturze 160⁰C trwa na ogół 2 godziny.

Termostaty (cieplarki)

Służą do hodowli drobnoustrojów. Są to specjalne szafki wykonane z blachy stalowej (lub drewna), zaopatrzone w płaszcz powietrzny lub wodny, który zapobiega utracie ciepła i niepożądanym wahaniom temperatury. W środku wyposażone są w ażurowe półki na hodowle mikroorganizmów. Termostaty są zasilane energią elektryczną, a wymagana temperatura jest ustawiana i utrzymywana dzięki tzw. termometrom kontaktowym.

Anaerostaty

Specjalne, hermetycznie zamykane aparaty do hodowli bakterii w warunkach beztlenowych. Zamiast powietrza mogą być wypełnione gazem obojętnym (CO₂ lub N₂) bądź też są zaopatrzone w pochłaniacze tlenu. Jest to najczęściej mieszanina węglanu potasowego, pirogallolu i ziemi okrzemkowej. Obecnie wiele firm wytwarzających produkty do diagnostyki mikrobiologicznej poleca specjalne zestawy do wytwarzania środowisk gazowych wśród których znajdują się: zestawy do uzyskiwania środowiska beztlenowego; zestawy do uzyskiwania atmosfery mikroaerofilnej; zestawy do hodowli organizmów wymagających do wzrostu CO₂.

Rys.4. Anaerostat (10) ---

1. Śruba mocująca.

2. Pokrywa.

3. Saszetka z substancją pochłaniającą.

4. Płytki Petriego.

5. Saszetka ze wskaźnikiem warunków beztlenowych

Wytrząsarki

Urządzenia umożliwiające hodowlę wgłębną drobnoustrojów w podłożach płynnych w warunkach tlenowych. Dzięki wytrząsaniu (rotacji) uzyskuje się lepsze napowietrzenie hodowli. W zależności od rodzaju ruchu wyróżniamy wytrząsarki:a) o ruchu posuwisto - zwrotnym z regulowaną amplitudą drgań, b) rotacyjne z regulowanym skokiem drgań

Temperaturę inkubacji utrzymuje własna komora cieplna (wodna – łaźnia bakteriologiczna lub powietrzna), a wytrząsarki bez komory umieszcza się w pomieszczeniach o regulowanej temperaturze. Stosowane są również do sporządzania rozcieńczeń glebowych lub rozcieńczeń z innych materiałów.

Boksy (szafy) laminarne

Służą do wykonywania posiewów i przeszczepów mikroorganizmów, zabezpieczając badany materiał przed przypadkowymi zanieczyszczeniami z powietrza oraz zapewniając bezpieczeństwo pracy osobom wykonującym te czynności. Są to boksy, w którym następuje przepływ powietrza w układzie liniowym (pionowo lub poziomo) z określoną szybkością. Jałowość powietrza w boksach oraz w pomieszczeniu ich usytuowania zapewniają zainstalowane w obudowy filtry powietrza. Mogą to być filtry absolutne typu HEPA, które w 99,9% zatrzymują cząstki o średnicy 0,3 µm lub filtry z węglem aktywnym absorbujące szkodliwe czynniki zawiesin koloidalnych oraz gazy. Dodatkowym wyposażeniem boksów jest lampa UV, palnik oraz szyba uchylna do ochrony badanego materiału i pracownika.

Rys.5. Szafa laminarna z poziomym przepływem powietrza (10) (powyżej)

Lampy bakteriologiczne

Są wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń, np. hal produkcyjnych, laboratoriów, kamer do szczepień. Źródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami rtęci, emitujące w 95% statyczne lub zabójcze promieniowanie o długości fali 258 nm. Ponieważ promieniowanie to charakteryzuje się słabą przenikliwością (nie przenika przez zwykłe szkło), stąd nie jest wykorzystywane do wyjaławiania szkła i podłoży agarowych.

Filtry

Ponieważ pory filtrów są mniejsze od wymiarów bakterii, są wykorzystywane do jałowienia „na zimno” płynnych produktów (podłoży, buforów, płynów ustrojowych i innych termowrażliwych składników podłoży. Można je również stosować w metodach wydzielania toksyn z hodowli płynnej, enzymów lub innych produktów metabolizmu, a także do oznaczania liczby drobnoustrojów występujących w płynach o niewielkim skażeniu (woda, wino, klarowne soki, itp.).

Sączenie przez filtry przebiega jednak bardzo wolno, dlatego też proces sączenia przeprowadza się w warunkach podciśnienia, wykorzystując w tym celu pompy próżniowe. W pracy mikrobiologicznej wykorzystuje się filtry:

Membranowe (rys.E) najczęściej stosowane. Charakteryzują się dużą zdolnością filtracyjną. Są wykonane z estrów lub octanów celulozy, polichlorku winylu lub teflonu o średnicy porów od 0,05 – 14,0 µm. Mają postać cienkiej, sprężystej błony. Dzięki zastosowaniu różnicy ciśnień (nad- i podciśnienie) charakteryzują się dużą szybkością przepływu (40 cm³/min/cm²).

Rys.6. Filtry mikrobiologiczne (16, 24)

Mikroskopy – sprzęt służący do badania morfologii komórki drobnoustrojów. Omówienie w kolejnym rozdziale skryptu.

2.2. Drobny sprzęt i szkło laboratoryjne

Igła preparacyjna – prosty drucik osadzony w oprawce, służący do posiewów wgłębnych bakterii, sporządzania preparatów mikologicznych. Może być zakończony haczykiem i wtedy służy do przeszczepiania grzybów.

Eza – wykonany ze specjalnego rodzaju stali, często platynowy i osadzony w oprawce drut zakończony oczkiem. Służy do posiewów, przesiewów, sporządzania preparatów mikroskopowych.

Rys.7. Igła, eza. głaszczka (21)

Głaszczka – szklany wygięty pręt służący do posiewów powierzchniowych, rozsiewania materiału biologicznego.

Płytki Petriego - dwie szklane (jednorazowe z tworzywa, najczęściej o Ø 10 cm) zachodzące na siebie szalki wykorzystywane do hodowli, liczenia i określania morfologii kolonii mikroorganizmów na pożywkach zestalonych.

Kolby, probówki szklane (ze szkła obojętnego i bez wygiętego kołnierzyka)– używane do wykonania rozcieńczeń, sporządzania i rozlewania pożywek, do posiewów i hodowli na pożywkach płynnym i zestalonych.

Rurki Durhama – małe szklane probóweczki (C), które zanurza się do góry dnem w probówkach z pożywką płynną (A). Służą do zbierania pęcherzyków gazu (B) wydzielanego podczas procesów fermentacyjnych przeprowadzanych przez drobnoustroje.

Rys.8. Probówka z płynnym podłożem i rurką Durhama (24)

Pipety szklane / miarowe (1–25 cm³) używane do posiewów ilościowych.

Pipety pasteurowskie – wykonane ze szkła sodowego, zabezpieczone wacikiem (1) szklane rurki (2) stosowane do posiewów płynnych.

Rys.9. Pipeta pasteurowska (2)

Komory - służą do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.

• Komora Thoma (hemocytometr) – szklana płytka z 2 wgłębieniami (głębokość 0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów o powierzchni 1/400 mm². Każdy z tych kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm³.

Rys.10. Komora Thoma (21)

• Komora Bürkera - szklana płytka z 2 wgłębieniami (0,1 mm) i siatką podzieloną na kwadraciki o boku 0,2 mm, powierzchni 0,04 mm² i objętości pod szkiełkiem nakrywkowym 0,004 mm³;

• Komora Howarda – szklana, gruba płytka z wyżłobionym dołkiem o głębokości 0,1 mm, który przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, posiadającym 25 przeźroczystych pól o średnicy 1,382 mm. Stosowana w analizach obecności grzybów pleśniowych w sokach.

Ponadto w pracowni mikrobiologicznej wykorzystuje się szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe, szkiełka z łezką (komora Lindnera) do preparatów przyżyciowych, kolby i czopy fermentacyjne, skalpele, pincety, szczypce, wanienki do barwienia, statywy na probówki, koszyki druciane i metalowe puszki do sterylizacji płytek Petriego i pipet.

II.3. METODY JAŁOWIENIA

W badaniach mikrobiologicznych ogromny wpływ na uzyskiwane wyniki ma higiena osobista oraz jałowość pomieszczeń, sprzętu i pożywek, które są wykorzystywane w pracy. W metodach jałowienia, wykorzystywanych również w medycynie, zakładach przetwórstwa rolno-spożywczego i w życiu codziennym, zastosowanie mają następujące procesy:

Dezynfekcja. Terminem tym określa się “proces zabicia wszystkich form wegetatywnych mikroorganizmów chorobotwórczych i niechorobotwórczych za pomocą metod fizycznych, chemicznych i mechanicznych”. Proces ten nie zapewnia całkowitej jałowości, gdyż pozostają aktywne formy przetrwalne bakterii.

Sterylizacja. W ujęciu mikrobiologicznym sterylizacja to „proces polegający na zabiciu wszystkich mikroorganizmów - niezależnie od stadium rozwojowego, a więc zarówno form wegetatywnych, jak też form przetrwalnych”.

Wyjaławianie przeprowadza się najczęściej przy użyciu metod fizycznych (temperatura, promieniowanie), mechanicznych (odfiltrowanie, odwirowanie) lub chemicznych.

3.1. Metody fizyczne

• Zastosowanie wysokich temperatur (na sucho lub na mokro):

Wyżarzanie i opalanie. Ezy i igły wyżarza się do czerwoności w świecącej części płomienia palnika spirytusowego lub gazowego. Czynność tą wykonuje się przed i po każdym ich użyciu. Wyloty probówek, kolb i wszelkich naczyń, które są zamykane korkami, opala się po otworzeniu w płomieniu palnika, co zapobiega zanieczyszczeniu hodowli. Pincety, skalpele, noże, bagietki, głaszczki opala się w płomieniu po uprzednim zanurzeniu w alkoholu.

Rys. 11. Wyżarzanie ezy i opalanie wylotu probówki (21)

Gotowanie. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe gotuje się w roztworze mydła lub środka myjącego, a następnie dokładnie płucze stosując na koniec wodę destylowaną. Po umyciu przechowuje się je na sucho w specjalnych pojemnikach, bądź też na mokro w 95% etanolu. Również metalowe narzędzia po oczyszczeniu można wygotować (20–30 minut) lub wyjałowić w autoklawie (temperatura 121⁰C, 20 minut).

Gorące i suche powietrze o temperaturze 160-180°C wykorzystuje się do wyjaławiania szkła oraz niektórych związków chemicznych np. węglanu wapnia, związków oleistych, wosku. Zabieg ten przeprowadza się w suszarkach laboratoryjnych.

Ponieważ szkło nowe lub nieużywane wykazuje odczyn alkaliczny stąd przed sterylizacją i użyciem należy je wygotować w wodzie z dodatkiem 1% HCl (30 min), wypłukać i ponownie wygotować w 1% roztworze Na₂CO₃ (30 minut). Po dokładnym wypłukaniu w wodzie bieżącej i destylowanej, wysuszeniu, pakuje się je w papier, folię aluminiową lub też umieszcza się w metalowych puszkach i sterylizuje przez 2 godz. w temperaturze 160°C.

Przed włożeniem do suszarki kolby, probówki i pipety zamyka się korkami. Z uwagi na możliwość samozapłonu i zwęglenia temperatury 180°C nie można przekraczać podczas sterylizacji probówek z korkami z waty lub ligniny oraz szkła opakowanego w papier. Wysokie temperatury obniżają także trwałość szkła laboratoryjnego, a niedokładne wysuszenie powoduje jego pękanie.

Rys.12. Płytki Petriego przygotowane do sterylizacji (2)

Gorąca bieżąca para wodna. Jest wykorzystywana w procesie pasteryzacji (łagodnej sterylizacji) w aparacie Kocha. Pasteryzacja polega na jednokrotnym ogrzaniu wyjaławianego materiału do temperatury ok.100°C. W procesie tym giną jedynie formy wegetatywne, natomiast nie ulegają zniszczeniu formy przetrwalne bakterii, które wytrzymują wielogodzinne gotowanie. Proces pasteryzacji stosuje się w przypadku podłoży mikrobiologicznych i produktów żywnościowych, których składniki w temperaturach powyżej 100°C mogą ulegać rozkładowi, a także konserw o pH poniżej 4,5 (mikroorganizmy acidofilne charakteryzuje obniżona odporność cieplna).

Większość podłoży mikrobiologicznych poddaje się działaniu temperatury w granicach 100°C przez od 15 - 30 minut. Wrażliwe na wysokie temperatury produkty (mleko, śmietanki, moszcz, soki, piwo i inne) wyjaławia się wykorzystując modyfikacje tego procesu. Jest to pasteryzacja:

• długotrwała (niska; LTLT – Low Temperature Short Time): temperatura 62 - 65°C / 20 - 30 minut;

• krótkotrwała (wysoka; HTST – High Temperature Short Time); temperatura 72°C / 15 sekund;

• momentalna: temperatura 85 - 90°C / 1 – 2 s.

Z praktycznego punktu widzenia pasteryzacja jest zabiegiem wystarczającym, jeśli następnie produkt zostanie schłodzony do 2-4°C i hermetycznie zamknięty, co uniemożliwia rozwój przeżywających ten zabieg mikroorganizmów.

Odmianą pasteryzacji jest tyndalizacja (pasteryzacja frakcjonowana). Jest to trzykrotna pasteryzacja przeprowadzana w odstępach co 24 godziny. W pierwszej fazie giną formy wegetatywne. Okres przerwy po pierwszej pasteryzacji pozwala na wykiełkowanie form przetrwalnych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy wegetatywne, które rozwinęły się z form przetrwalnych, a trzecia upewnia nas o zabiciu wszystkich drobnoustrojów.

Gorąca para wodna pod ciśnieniem. Aby uzyskać właściwy efekt sterylizacji w autoklawie proces musi przebiegać w optymalnej temperaturze, przy odpowiednim ciśnieniu i przez określony czas. Pomiędzy ciśnieniem a temperaturą wewnątrz autoklawu, a także pomiędzy temperaturą a efektem sterylizacji istnieją ścisłe zależności:przy nadciśnieniu:

0,0 atm. temperatura w autoklawie wynosi 100ºC

0,5 atm. - 111,7° (112°) C

1,0 atm. - 120,6° (121°) C

2,0 atm. - 133,9° (134°) C.

podobne efekty odkażania uzyskuje się stosując nw. temperatury i czas ekspozycji:

121°C przez 2 minuty;

110°C - 20 minut;

100°C - 200 minut.

Zatem im wyższe jest ciśnienie wewnątrz kotła tym wyższe są temperatury, a im wyższe temperatury tym krótszy okres sterylizacji. Stosując zwiększone ciśnienie, uzyskuje się zatem możliwość zniszczenia zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnych. Czas sterylizacji zależy także od objętości materiału i rodzaju przedmiotów poddawanych sterylizacji (tab.1).

Tab.1. Czas sterylizacji w zależności od objętości materiału

Objętość (cm^3)	Czas sterylizacji w temperaturze 121°C (min)
10 – 50 200 1000 2000 9000	12 – 14 12 – 15 20 – 25 30 – 35 50 – 55

Podłoża i produkty nie zawierające składników wrażliwych na wysokietemperatury sterylizuje się w autoklawie w temp. 121°C przez 15-20 min lub w temperaturze 117°C przez 15-30 minut. Procesowi sterylizacji poddaje się także konserwy o pH powyżej 4,5. Eliminacja form przetrwalnych zapobiega możliwości pojawienia się form wegetatywnych bakterii, które w warunkach niskiej kwasowości znajdują odpowiednie warunki do rozwoju.

Niektóre termowrażliwe produkty płynne (np. mleko) poddaje się sterylizacji błyskawicznej (UHT – Ultra High Temperature) w systemie przepływowym lub poprzez wtrysk pary wodnej o temperaturze 135-150°C w czasie od 2 - 9 s. Procedura ta niszczy formy wegetatywne i przetrwalne w stopniu zapewniającym trwałość handlową produktu (jeśli zostanie zapakowany w sterylnych warunkach).

Szkło używane, zawierające hodowle drobnoustrojów sterylizuje się w autoklawie w temperaturze co najmniej 134°C przez okres od 30–90 minut (w zależności od ilości i objętości sterylizowanego materiału). Po sterylizacji szkło należy opróżnić i umyć w wodzie z detergentem lub wygotować w roztworze mydła. Po dokładnym wypłukaniu w wodzie destylowanej sterylizujemy je ponownie w suszarce (160°C / 2 godz.).

• Zastosowanie promieniowania (UV, X i gamma).

W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długości fali 250-260 nm, a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowane przez kwasy nukleinowe. Źródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami rtęci, emitujące w 95% promieniowanie o długości fali 258 nm. Promieniowanie UV jest wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń o niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów ichłodni, ładowni statków, laboratoriów, kamer). Ponieważ charakteryzuje się słabą przenikliwością – nie przenika przez zwykłe szkło, stąd promieniowanie UV nie jest wykorzystywane do wyjaławiania szkła i podłoży agarowych w szklanych naczyniach.

Efekt biobójczy promieniowania zależy między innymi od objętości napromienianego powietrza, wielkości powierzchni, odległości i ustawienia lamp UV. Czas emisji promieniowania nie powinien być krótszy niż 30 min, odległość lampy od sterylizowanej powierzchni nie może przekraczać 3 m, a lampy winny być ustawione prostopadle do powierzchni.

Do sterylizacji sprzętu medycznego jednorazowego użytku, surowców i preparatów farmaceutycznych oraz utrwalania produktów spożywczych (świeżych i suszonych owoców i warzyw, mięsa drobiowego, ryb, przypraw i ziół, a zwłaszcza do niszczenia mikroorganizmów w zamkniętych pojemnikach, np. w konserwach) wykorzystuje się niekiedy promieniowanie jonizujące (X, gamma), które charakteryzuje się bardzo dużą przenikliwością, energią i aktywnością biologiczną. Ponieważ stosowanie dawek promieniowania pow.10 kGy (radiopasteryzacja, radiosterylizacja) powoduje zmiany właściwości organoleptycznych, odżywczych i zdrowotnych produktów, stąd do ich sterylizacji stosuje się dawki promieniowania nie przekraczające tej wartości (raduryzacja, radycydacja). Raduryzacja to zmniejszenie ogólnej liczby mikroorganizmów i zahamowanie rozwoju form przeżywających ten zabieg; radycydacja – zmniejszenie liczebności populacji mikroorganizmów patogennych (np. Clostridium, Salmonella) i zahamowanie produkcji toksyn bakteryjnych (np. jadu kiełbasianego przez Clostridium botulinum). Stosowanie tych metod jest dozwolone tylko w niektórych krajach UE.

3.2. Metody mechaniczne

• Filtrowanie. Zabieg ten stosujemy w przypadku. gdy mamy do czynienia z materiałami, które w podwyższonej temperaturze ulegają zmianom fizycznym i chemicznym. Są to zwykle pożywki zawierające witaminy, aminokwasy, surowicę, mocznik i termolabilne składniki dodawane do podłoży. Do wyjaławiania używa się najczęściej filtry membranowe o porach od 0,20-0,40 (0,75) µm średnicy. Ponieważ pory są mniejsze od wymiarów bakterii, odfiltrowane drobnoustroje osadzają się na filtrze, a uzyskany filtrat jest jałowy.

• Wirowanie jest zabiegiem dzięki któremu następuje oddzielanie komórek mikroorganizmów od zawiesiny. Wykonujemy je w wirówkach z regulowanymi obrotami i czasem działania, a materiał wirowany umieszcza się w specjalnie przygotowanych pojemnikach.

3.3. Metody chemiczne

Do sterylizacji podłóg, ścian i powierzchni roboczych, linii technologicznych, czy też maszyn lub ich części stosuje się także (zgodnie z zaleceniami producenta) różne środki dezynfekcyjne. Różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania. Aktywność biologiczna środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju związku chemicznego; gatunku mikroorganizmów, ich wieku i liczebności populacji; czynników środowiskowych - temperatura, kwasowość podłoża i obecność w nim innych związków chemicznych, zwłaszcza organicznych.

Mechanizm działania związany jest w pierwszym rzędzie ze strukturą chemiczną i właściwościami substancji biologicznie czynnej związku. W zależności od tych czynników, a także od koncentracji efektem może być zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów (działanie statyczne) lub w następstwie oddziaływania na zasadnicze struktury lub szlaki metaboliczne ich zabicie (działanie bakterio- lub grzybobójcze). Polegać ono może na: uszkadzaniu lub zmianie przepuszczalności ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej oraz wypływie do środowiska zewnętrznego składników komórki; utlenianiu struktur komórkowych i zakłóceniu procesów metabolicznych mikroorganizmów; tworzeniu kompleksów z białkami - blokowaniu grup funkcyjnych (-NH₂, -SH, -COOH); dezaktywacji enzymów; spowodowaniu koagulacji cytoplazmy i denaturacji białek (cytoplazmatycznych, enzymatycznych, kwasów nukleinowych).

Do związków chemicznych najczęściej stosowanych w dezynfekcji należą:

• Czwartorzędowe sole amoniowe (Sterinol, Dezogen). Charakteryzuje je szerokie spektrum działania (bakterie G+ i G-, grzyby pleśniowe, drożdże, wirusy), długotrwały efekt sterylizacyjny i przyjemny zapach. Ujemną stroną tych preparatów jest silna presja selekcyjna i możliwość uodpornienia się bakterii G- (np. Proteus vulgaris i Serratia marcescens), co wymusza konieczność przemiennego ich stosowania z preparatami o odmiennych mechanizmach działania (związkami nadtlenowymi, podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności związków organicznych i mydła.

• Związki nadtlenowe (kwas nadoctowy, nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasowy). Najpowszechniej stosowany kwas nadoctowy jest aktywny w stosunku do form wegetatywnych i przetrwalnych bakterii. Ponieważ związek ten nie wykazuje właściwości korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi na produkty nieszkodliwe (woda, tlen, kwas octowy) dla produktów spożywczych, może być stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych (np. w browarnictwie i winiarstwie) bez konieczności przepłukiwania ich wodą. Taka procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu, gdy jakość mikrobiologiczna będącej do dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto związek ten może być użyty do sterylizacji przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk.

• Alkohole (etanol, izopropanol). Charakteryzuje je szerokie działanie biobójcze (formy wegetatywne bakterii G+ i G-) uwarunkowane obecnością wody. Z tego też względu działają najsilniej jako 50-70% roztwór wodny. Aktywność alkoholi wzrasta wraz ze wzrostem liczby molowej i liczby C w łańcuchu, a maleje w obecności substancji organicznej. Są wykorzystywane do dezynfekcji systemów zamkniętych bez konieczności płukania wodą, powierzchni roboczych, sprzętu i rąk.

Wykorzystanie takich środków dezynfekcyjnych, jak: aldehydy (mrówkowy, glutarowy, formalina), związki fenolowe i pochodne fenoli (fenol, lizol, kwas karbolowy), związki chloru (podchloryn sodowy, chloramina T), jodofory (połączenia jodu z polimerami lub SPC), związki azotu (pochodne biguanidyny kw. glutaminowego i pirydyny), metale ciężkie, jest bardzo często ograniczone jedynie do dezynfekcji powierzchni roboczych nie mających kontaktu z żywnością, a w niektórych krajach zakazane. Wynika to z ich toksyczności (alergie, zakłócenia metabolizmu), wywoływania podrażnień skóry i błon śluzowych, słabej biodegradacji, długotrwałego przykrego zapachu, działania korozyjnego, wysokiej presji selekcyjnej i możliwości wykształcenia się form odpornych, uwarunkowania ich aktywności od czynników środowiskowych.

II.4. WARUNKI HODOWLI MIKROORGANIZMÓW

Skład ilościowy (liczebność) i jakościowy (różnorodność gatunkowa) mikroflory różnych środowisk jest odmienny, niekiedy nawet bardzo specyficzny. Zależy on od właściwości gatunkowych mikroorganizmów oraz od czynników ekologicznych: abiotycznych (fizycznych i chemicznych) oraz biotycznych (dodatnich i ujemnych, bezpośrednich i pośrednich oddziaływań jednych organizmów na drugie).

Tak silne oddziaływanie czynników środowiskowych na mikroorganizmy wynika z uproszczonej budowy, a zwłaszcza z ich ogromnej zbiorowej powierzchni czynnej (powierzchni styku ze środowiskiem). Wg Gołębiowskiej jeden organizm o objętości 1 cm³ ma powierzchnię styku ze środowiskiem ok. 6 cm², podczas gdy 1000 mld komórek bakteryjnych mieszczących się w 1 cm³ ma powierzchnię styku około 60 tys.cm².

Oddziaływanie poszczególnych czynników środowiskowych przebiega zgodnie z prawami, „minimum”, „maksimum” i „tolerancji”. To ostatnie mówi, że: „zarówno nadmiar, jak i niedobór jakiegoś czynnika, tak w sensie ilościowym, jak i jakościowym, poza granice tolerancji organizmu, powoduje zahamowanie wzrostu i rozwoju oraz śmierć komórki”.

Najważniejszymi czynnikami abiotycznymi wpływającymi na wzrost i rozwój drobnoustrojów, w tym także na podłożach mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych, są takie czynniki fizyczne (temperatura), chemiczne (kwasowość, tlenowość) a także zawartość składników odżywczych.

4.1. Temperatura

Mikroorganizmy rozwijać się mogą w bardzo szerokim zakresie temperatur, od – 23°C (silnie zasolone wody Antarktydy w których stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Corynebacterium i grzybów z rodzaju Sporobolomyces) do 113°C (gorące źródła, kominy termalne – Pyrodictium brockii). Większość mikroorganizmów rozwija się jednak w temperaturach od 10 – 37°C. W warunkach laboratoryjnych najczęściej stosowaną temperaturą hodowli bakterii jest zakres 30 – 37°C natomiast dla grzybów temperatura 20 – 25°C.

Ze względu na różnice w minimalnych, optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu, mikroorganizmy dzieli się na ogół na trzy grupy:

• Psychrofilne (-23-0; 15; 20°C). Do tej grupy zalicza się szereg drobnoustrojów zdolnych do rozwoju w środowiskach naturalnych o niskich temperaturach, jak rejony podbiegunowe, szczyty wysokich gór, dna oceanów, osady głębokich jezior. Bakterie tej grupy stanowią również poważny problem w przechowalnictwie. Występując w chłodniach i magazynach, na i w schłodzonych produktach mleczarskich, mięsnych i owocowo-warzywnych, wywierają niekorzystny wpływ na ich jakość i trwałość.

Najczęściej są to bakterie G- należące do rodzaju Pseudomonas oraz gatunki z rodzajów Vibrio, Aeromonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Chromobacterium i Flavobacterium. Wśród bakterii G+ dominują gatunki należące do rodzajów: Micrococcus, Bacillus i Arthrobacter oraz niektóre Lactobacillus.

Spośród drożdży są to przedstawiciele rodzajów Candida, Debaryomyces, Pichia, Rhodotorula i Thurolopsis, a spośród pleśni: Aureobasidium pullulans, Botrytis cinerea i Geotrichum candidum.

Szczególne niebezpieczeństwo zatruć pokarmowych stwarzają niektóre bakterie patogenne: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica i Bacillus cereus.

• Mezofilne (10-30; 20-37; 35-50°C). Grupa drobnoustrojów zdolna do wzrostu w umiarkowanych temperaturach. Do mezofili zalicza się większość drobnoustrojów występujących w środowisku (glebie, wodzie, na powierzchni ciała roślin i zwierząt). Są to na ogół mikroorganizmy saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka, wśród nich wywołujące zatrucia pokarmowe.

• Termofilne (25-45; 45-65/80; 60-90°C). Drobnoustroje o wysokich optymalnych temperaturach wzrostu. Podzielono je na dwie grupy. Pierwsza zwana termofilami - obejmuje mikroorganizmy o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 45°C. Druga grupa to hipertermofile o optymalnej temperaturze wzrostu dopiero powyżej 80°C.

Mikroorganizmy tej grupy są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Spotyka się je w gorących źródłach, w fermentujących resztkach roślinnych (tytoniu, sianie, nawozie i kiszonkach) oraz w przewodzie pokarmowym niektórych zwierząt. Niektóre bakterie, np. Desulfovibrio desulphuricans, rozwijają się w rurach wymienników ciepła powodując ich korozję.

Większość termofili to bakterie G+, przetrwalnikujące należące do rodzaju Bacillus (Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans). Obok nich są to przedstawiciele rodzajów: Clostridium (Clostridium thermosaccharolyticum), Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, Staphylococcus i inne. Liczba termofili wśród bakterii G- jest ograniczona. Znane są również termofilne promieniowce (Thermomonospora, Thermoactinomyces), bakterie zielone i sinice oraz liczne gatunki grzybów, np. Absidia ramosa, Aspergillus fumigatus.

4.2. Tlenowość - potencjał oksydacyjno-redukcyjny

W warunkach naturalnych z natlenieniem środowiska łączy się zagadnienie potencjału oksydacyjno-redukcyjnego (Eh) mierzonego w woltach lub miliwoltach. Przy lepszym natlenieniu wartości potencjału redox są dodatnie i wyższe (do +0,4), a przy gorszym są niższe i przybierać mogą wartości ujemne (-0,4). Zapewnienie mikroorganizmom odpowiedniego potencjału – tlenowości ma duże znaczenie w badaniach mikrobiologicznych, przemyśle fermentacyjnym i przechowywaniu żywności. W praktyce mikrobiologicznej, w zależności od wymagań mikroorganizmów, stosujemy metody hodowli w warunkach tlenowych lub beztlenowych.

Pod względem reakcji na natlenienie środowiska mikroorganizmy dzielimy na:

• Bezwzględne tlenowce (b.aeroby). Rozwijają się najlepiej przy wartościach Eh od +0,2 do +0,4 V. Obecność tlenu jest dla wzrostu i rozwoju tych mikroorganizmów niezbędna. Do tej grupy zalicza się liczne autotroficzne bakterie chemosyntetyzujące (bakterie nitryfikacyjne, Thiobacillus), wiele bakterii heterotroficznych (Pseudomonas, bakterie śluzowe), wiele gatunków grzybów pleśniowych i drożdży.

Liczne mikroorganizmy należące do tlenowców rozwijają się na w nieopakowanych produktach żywnościowych lub których opakowania zostały uszkodzone, są także wykorzystywane w procesach biotechnologicznych, np. produkcji kwasów organicznych, antybiotyków. Należą do nich bakterie z rodzaju Bacillus, pleśnie z rodzaju Aspergillus, Penicillium, promieniowce Streptomyces, Micromonospora, Nocardia.

• Względne beztlenowce. Do względnych beztlenowców należy wiele różnorodnych gatunków bakterii, grzybów i pierwotniaków. Obecność tlenu może być dla tych mikroorganizmów korzystna, brak tlenu nie wyklucza jednak możliwości ich rozwoju (np. bakterie Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella sp., Pseudomonas sp., drożdże Saccharomyces cerevisiae). Mikroorganizmy te zależnie od warunków wzrostu uzyskują energię zarówno na drodze oddychania tlenowego, jak i beztlenowego. Względne beztlenowce rozwijają się w produktach żywnościowych szczelnie opakowanych, ale nie odpowietrzonych, np. porcjowane kawałki mięsa, ryby na tackach w woreczkach z tworzyw sztucznych.

• Mikroaerofile. Rosną najlepiej gdy stężenie tlenu w środowisku ich bytowania jest mniejsze. Większe stężenia tlenu powodują zahamowanie wzrostu i zatrucie komórki (bakterie fermentacji mlekowej).

• Bezwzględne beztlenowce (b.anaeroby). Rozwijają się jedynie w środowisku beztlenowym przy ujemnych wartościach Eh (poniżej -0,2V). Energię uzyskują na drodze fermentacji lub oddychania beztlenowego.

Do grupy tej zalicza się: przetrwalnikujące laseczki (Clostridium) przeprowadzające fermentację masłową lub wytwarzające toksyny, które występują w odpowietrzanych konserwach oraz głębokich warstwach żywności, np. mięsie, serach; zasiedlające żwacz ziarniaki (Ruminococcus) i pałeczki (Bacteroides); bakterie metanogenne czynne w procesie beztlenowego oczyszczania ścieków).

Spośród grzybów jedynie nieliczne (Mucor) przeprowadzają w warunkach beztlenowych fermentację alkoholową.

4.2.1. Tlenowe metody hodowli mikroorganizmów to:

• Hodowle powierzchniowe – na powierzchni pożywek zestalonych;

• Hodowle statyczne –służą do badań morfologii, fizjologii, biochemii oraz otrzymywania czystych kultur;

• Hodowle wgłębne – wzrost mikroorganizmów zachodzi w całej objętości pożywki płynnej na skutek ciągłego ruchu pożywki wywołanego intensywnym mieszaniem lub wytrząsaniem;

• Hodowle ciągłe – wymagające stałego utrzymywania wzrostu drobnoustrojów przez sukcesywne zaopatrywanie hodowli w świeżą pożywkę, jednocześnie z fermentatora odprowadzana jest taka sama ilość podłoża zawierającego biomasę i szkodliwe metabolity.

4.2.2. Beztlenowe metody hodowli bakterii

Prowadzi się je eliminując ze środowiska hodowlanego tlen następującymi metodami:

• fizycznymi – np. wypompowanie tlenu ze środowiska lub przez hodowlę bakterii w pożywce płynnej zawierającej tkankę zwierzęcą (kawałki wątroby, nerki lub mięśnia sercowego np. pożywka Wrzoska) lub tkankę roślinną (marchew, ziemniak), które adsorbują tlen ze środowiska hodowlanego;

• chemicznymi – zastosowanie substancji wiążących tlen, np. podsiarczynu sodu, alkalicznego roztworu trioksybenzenu, a także środków chemicznych redukujących tlen glukoza, kwas askorbinowy, cysteina, siarczyn sodowy);

• biologicznymi – wspólna hodowla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych w dwóch oddzielonych od siebie częściach płytki Petriego szczelnie oklejonej parafilmem lub plasteliną. Wyrastający wcześniej organizm tlenowy wykorzystuje tlen ze środowiska umożliwiając rozwój organizmu beztlenowego (metoda Fortnera). Niezbędnym warunkiem prowadzenia tej metody jest zastosowanie składniku pożywki, która jest optymalna zarówno dla tlenowców jak i beztlenowców. Metodę tą można zastosować do hodowli beztlenowych bakterii amylolitycznych (Clostridium acetobutylicum, Clostridium pasterianum) w obecności Bacillus subtilis, Serratia marcescens lub Candida mycoderma.

4.3. Kwasowość - odczyn środowiska

pH lub stężenie jonów wodorowych jest jednym z czynników, który znacząco wpływa na ilościowy i jakościowy skład mikroflory w danym środowisku. Chociaż pH soku komórkowego mikroorganizmów utrzymuje się na poziomie bliskim obojętnemu, co zapobiega rozkładowi wrażliwych na działanie kwasów i zasad składników komórkowych, to mikroorganizmy charakteryzują się:

• różnymi wartościami punktów kardynalnych. Większości bakteriom odpowiada na ogół odczyn lekko zasadowy lub obojętny (pH 6,5-7,7). Grzyby pleśniowe i drożdże rozwijają się lepiej przy niższych wartościach pH (4-6).

• rozpiętością tolerowanych granic pH. Część drobnoustrojów rozwija się w dość wąskim zakresie pH (Streptococcus pneumoniae), natomiast inne (np. Aspergillus niger) w szerokim zakresie - pH od 1,5 – 11.

Biorąc pod uwagę reakcję drobnoustrojów na minimalne, optymalne i maksymalne stężenie jonów wodorowych podzielono je na:

• Alkalofile. Mikroorganizmy rozwijające się najlepiej w środowisku alkalicznym (optimum pH 8,0 – 11). Zalicza się do nich bakterie nitryfikacyjne (Nitrosomonas i Nitrobacter), wolno żyjące asymilatory azotu (Azotobacter), chorobotwórcze (Vibrio cholerae, Streptococcus pneumoniae), Enterococcus faecalis, promieniowce, przedstawiciele rodzaju Bacillus (rozwijają się jeszcze przy pH 11), a także niektóre glony rozwijające się przy pH 13.

• Neutrofile. Rozwijają się najlepiej przy pH od 6,5 – 7,5.

• Acidofile. Drobnoustroje środowisk kwaśnych (optimum pH 2,0 – 5,0). Zalicza się do nich, grzyby pleśniowe z rodzajów: Aspergillus, Oospora, Penicillium, drożdże Saccharomyces oraz bakterie fermentacji octowej, fermentacji mlekowej, a zwłaszcza bakterie siarkowe (Thiobacillus thiooxidans, Ferrobacillus thiooxidans), które utleniając związki siarki do kwasu siarkowego rozwijają się przy jego stężeniu dochodzącym do 10% i przy pH poniżej 0,8 (kw.siarkowy w akumulatorach).

Odczyn środowiska wpływa nie tylko na wzrost drobnoustrojów, ale modyfikuje także biochemizm komórki – zdolność do produkcji toksyn, kierunek procesów fermentacyjnych. Wobec silnej reakcji mikroorganizmów na pH, znajomość punktów kardynalnych i regulowanie odczynu środowiska jest ważnym zabiegiem w wielu procesach badawczych i technicznych. Ma kapitalne znaczenie przy:

• Przygotowywaniu podłoży agarowych dla hodowli mikroorganizmów. Pamiętać należy, że kwasowość podłoża zależy od jego temperatury. Obniżenie pH zwiększa wrażliwość mikroorganizmów na wysokie temperatury, co jest wykorzystywane w procesie pasteryzacji produktów owocowo-warzywnych;

• Zabezpieczaniu produktów żywnościowych poprzez obniżenie pH do 3,5 – 4,2 (większość ma odczyn słabo kwaśny), przed szkodliwym działaniem drobnoustrojów saprofitycznych, chorobotwórczych, toksynotwórczych, w szczególności wytwarzających formy przetrwalne.

4.4. Składniki odżywcze

Metabolizm komórki opiera się na dwóch przeciwstawnych procesach, które łączy proces wytwarzania, gromadzenia i przekazywania energii. Są to:

• Anabolizm (asymilacja) – pobieranie z otoczenia i synteza na drodze redukcji związków o dużej złożoności (małej entropii), przy wykorzystaniu energii zgromadzonej w ATP, która następnie jest magazynowana w postaci wiązań chemicznych wytworzonych związków organicznych.

• Katabolizm (dysymilacja) - powstawanie na drodze biologicznego utleniania substratu związków o małej złożoności (dużej entropii), z jednoczesnym uwolnieniem energii i wydaleniem na zewnątrz powstałych, niekiedy szkodliwych dla mikroorganizmów metabolitów.

Przebieg tych procesów, warunkujących prawidłowy wzrost i rozwój mikroorganizmów, zależy od: stałego i bezawaryjnego dopływu z otaczającego środowiska mineralnych i organicznych związków, stanowiących materiał budulcowy lub źródło energii; nakładów energii i obecności odpowiednich enzymów, od których zależy przebieg reakcji metabolicznych; planu, który zapisany jest w układzie genetycznym każdego organizmu.

4.4.1. Skład chemiczny mikroorganizmów

Skład chemiczny drobnoustrojów jest zbliżony do składu chemicznego innych organizmów. Około 80% stanowi woda, która z jednej strony jest środowiskiem wewnętrznym komórki, w którym przebiega szereg reakcji chemicznych, a z drugiej odgrywa czynną rolę w tych reakcjach. Do innych bardzo ważnych związków organicznych wytwarzanych w komórce zaliczyć należy białka, węglowodany, lipidy, kwasy nukleinowe i deoksynukleinowe.

Wykres 1. Przeciętny skład chemiczny suchej masy komórki drobnoustrojów (4)

Najważniejszymi pierwiastkami organogenicznymi, wchodzącymi w skład struktur komórkowych są: węgiel (50-65%), azot (6-12%), tlen (30%) i wodór (7%) i inne (1,5-15%). Do pozostałych ważnych pierwiastków życia, występujących w stanie wolnym lub w postaci związków mineralnych albo organicznych, zalicza się:

• makroelementy (od 10^-4 do 10^-3 mola) - składniki strukturalne komórki, odpowiedzialne z utrzymanie właściwego ciśnienia osmotycznego w komórce (P, K, Ca, S, Fe, Mg);

• mikroelementy (od 10^-8 do 10^-6 mola) - będące w pierwszym rzędzie składnikami enzymów (Mn, Cu, Co, Bo, Zn, Ni, Mo);

• witaminy (kilka ppm) - będące składnikami lub prekursorami enzymów;

• substancje wzrostowe, które stymulują wzrost i rozwój, lecz nie wchodzą w skład enzymów (np. aminokwasy, aminy, sterole, zw. pirymidynowe, puryny, itp.).

Zapotrzebowanie i rodzaj wykorzystywanych związków (mineralne, organiczne) przez poszczególne rodzaje mikroorganizmów jest odmienne i waha się niekiedy w szerokich granicach. Wśród mikroorganizmów występować mogą bowiem zarówno prototrofy (np. Escherichia coli, Psudomonas sp.), które dysponując kompletnym zestawem enzymatycznym z prostych związków wytworzyć mogą wszystkie niezbędne do życia związki organiczne, jak również auksotrofy (np. drożdże, bakterie fermentacji mlekowej) wymagające obecności w środowisku określonych związków organicznych (aminokwasów, substancji wzrostowych, itp.). Z tego też powodu wszystkie niezbędne dla prawidłowego wzrostu i rozwoju składniki winny być zawarte w podłożach mikrobiologicznych.

4.4.2. Skład pożywek hodowlanych

Pożywki hodowlane zwane inaczej podłożami mikrobiologicznymi służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Stosując różne podłoża możemy prowadzić izolację mikroorganizmów, różnicować je, namnażać oraz identyfikować.

Podstawowym materiałem budulcowym komórki, stanowiącym szkielet każdego związku, są proste związki węgla, które równocześnie dostarczają energię potrzebną do syntezy (za wyjątkiem CO₂). Węgiel jest zatem atrybutem zarówno pokarmu, jak również energii. Biorąc pod uwagę pochodzenie i formę wykorzystywanego C mikroorganizmy dzielimy na typy pokarmowe:

• autotrofy (organizmy samożywne) – pobierające C w formie utlenionych zw. mineralnych (nieorganicznych) – CO₂, H₂CO₃. Zalicza się do nich niektóre bakterie i wszystkie glony;

• heterotrofy (organizmy cudzożywne) – wymagające obecności w środowisku zredukowanych związków organicznych zawierających C (np. węglowodanów). Są to w większości bakterie i wszystkie grzyby.

Organizmy tej grupy dzielimy na:

• saprotrofy – wykorzystujące martwą materię organiczną,

• biotrofy – pobierające związki wytwarzane przez organizmy żywe. W obrębie tych ostatnich wyróżnia się organizmy pasożytnicze będące sprawcami chorób roślin, zwierząt i człowieka oraz symbiotyczne, których współżycie przynosi obu partnerom korzyści.

Wykres 2. Dostępność różnych źródeł energii i węgla dla heterotrofów (8)

Pochodzenie poszczególnych składników podłoży jest różne np.:

• źródłem węgla i energii są najczęściej węglowodany (np. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza), a także glicerol, mannitol oraz niektóre kwasy organiczne. Dodaje się je w ilości 0,5-2%.

• źródłem azotu – oprócz bakterii, które wiążą azot z atmosfery, uniwersalnym źródłem azotu jest dodawany do pożywek pepton (łańcuch polipeptydowych i wolnych aminokwasów otrzymywany przez rozkład hydrolityczny białka pod wpływem działania trypsyny, pepsyny bądź 20% HCl). Innym źródłem azotu stosowanym w sztucznych podłożach są różne ekstrakty (mięsny, drożdżowy}, a także sole amonowe, wodorotlenek amonu oraz azotany. Często dodaje się czyste białko, bądź wolne aminokwasy.

Oprócz tych składników w podłożach powinny znajdować się:

• składniki mineralne – należą do nich zarówno sole mineralne, jak i pierwiastki śladowe. Sole dodawane do pożywki to: fosforan potasu utrzymujący właściwy odczyn pH (zwiększona pojemność buforowa), a także NaCl (sól kuchenna, dodawana w ilości 3-5g/l) reguluje ciśnienie osmotyczne.

• pierwiastki – dodawane do podłoża należą do następujących grup: pierwiastki biogenne: O,H, P,S (składniki budulcowe komórki), pierwiastki biorące udział w procesach życiowych komórki: Na, K, Mg, Ca, Fe, mikroelementy biorące udział w reakcjach komórkowych: Zn, Mn, Cu, Co.

• substancje wzrostowe – są to zarówno roztwory syntetyczne witamin, a także ekstrakty roślinne i zwierzęce oraz sok pomidorowy, wyciąg glebowy, brzeczka słodowa, wyciąg ziemniaczany.

• substancje różnicujące i wybiórcze – składniki różnicujące to te, które po dodaniu do pożywki ulegają pod wpływem wzrostu drobnoustrojów rozkładowi (np. cukry – następuje zmiana barwy pożywki) lub też wskazują na obecność produktów metabolizmu bakterii (np. wytwarzanie siarkowodoru, tworzenie indolu).

Składniki wybiórcze natomiast dodaje się po to, żeby hamując wzrost pewnych grup mikroorganizmów umożliwić jednocześnie rozwój flory pożądanej (mogą to być: sole kwasów żółciowych, fiolet krystaliczny, błękit brylantowy, antybiotyki).

• czynniki zestalające – w przypadku pożywek o konsystencji stałej dodaje się do podłoża agar (jest to polisacharyd, który ma właściwości żelujące, dodaje się go w ilości 1,5-3%) lub żelatynę (substancja białkowa, bogata w kolagen, dodaje się w ilościach 12-15%).

4.4.3. Podział pożywek hodowlanych

Podłoża hodowlane podzielić możemy biorąc pod uwagę:

• skład chemiczny:

• naturalne – bulion, mleko, brzeczka słodowa, melasa buraczana

• syntetyczne – złożone z odczynników chemicznych o ściśle znanym składzie ilościowym i jakościowym

• półsyntetyczne – przygotowane z odczynników chemicznych z dodatkiem pojedynczego składnika naturalnego (wyciąg mięsny, mleko, serwatka, wyciągi roślinne: ziemniaczany, pomidorowy, melasa buraczana, namok kukurydziany, brzeczka słodowa).

• cel hodowli:

• namnażające – służące do otrzymania biomasy drobnoustroju (np. zbuforowana woda peptonowa dla pałeczek Salmonella i pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek z grupy coli, podłoże Czapka lub Sabuoroda do hodowli grzybów)

• selektywne – zawierają zarówno składniki odżywcze jak i wybiórcze (np. fiolet krystaliczny jest składnikiem wybiórczym w podłożu do hodowli bakterii z grupy coli, pH kwaśne podłoża pozwala na wzrost grzybów, hamując wzrost bakterii).

• różnicujące – zawierają substancje diagnostyczne, pozwalające stwierdzić w środowisku obecność drobnoustrojów określonych rodzajów (np. podłoże Endo do hodowli bakterii coli, agar z krwią do hodowli paciorkowców hemolizujących, agar SS do hodowli bakterii Salmonella, Schigella, podłoże Blickfeldta do wykrywania bakterii kwaszących, podłoże Wrzoska do oznaczania bakterii beztlenowych).

• wymagania pokarmowe drobnoustrojów:

• ogólne (zwykłe) – do hodowli drobnoustrojów heterotroficznych o niewielkich wymaganiach pokarmowych, prototroficznych (bulion odżywczy, agar odżywczy)

• wzbogacone – do hodowli drobnoustrojów o zwiększonych wymaganiach hodowlanych, auksotroficznych (np. bulion odżywczy z dodatkiem substancji wzrostowych; agar wzbogacony z dodatkiem glukozy)

• wybiórcze – do izolacji ściśle określonych grup drobnoustrojów. Do podłoża dodaje się składnik, który w przypadku hodowli mieszanej pozwala na wzrost tylko tych mikroorganizmów, które tolerują ten składnik (pożywka Kesslera –Swenartona z fioletem krystalicznym dla hodowli bakterii z grupy coli).

• różnicujące – do identyfikacji drobnoustrojów w hodowli mieszanej. Określone grupy mikroorganizmów różnicuje się na podstawie rozkładu przez nie substratów wprowadzonych do podłoża (podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową do identyfikacji bakterii z grupy coli; podłoże z mannitolem do identyfikacji gronkowców)

• konsystencję:

• płynne – służą głównie do namnażana drobnoustroju (np. bulion)

• półpłynne - zawierają agar w ilości 0,15—0,5% i służą do hodowli organizmów o mniejszym zapotrzebowaniu na tlen oraz do badania ruchu bakterii

• stałe – jako czynnik zestalający stosuje się agar, bądź żelatynę, służą do różnicowania i izolowania bakterii i grzybów, a także hodowli i liczenia bakterii.

4.4.4. Rodzaje pożywek stosowanych w mikrobiologii (przykłady):

• Pożywki ogólnego zastosowania

• bulion zwykły, odżywczy, brzeczka słodowa

• agar zwykły, odżywczy, bulion z agarem

• żelatyna

• Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii:

• podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira)

• podłoża dla pałeczek z grupy coli (z żółcią i zielenią brylantową, Kesslera-Swenartona, Endo)

• podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu)

• podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem)

• Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży:

  • podłoże Sabourauda

  • brzeczka agarowa

  • pożywka Czapka – Doxa

  • podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.