1. Laboratorium mikrobiologiczne

Cel ćwiczenia

•

Zapoznanie się z regulaminem ćwiczeń

•

Poznanie podstawowego szkła i sprzętu mikrobiologicznego i sposobów sterylizacji

•

Zapoznanie się rodzajami i sposobem przygotowywania podłoży mikrobiologicznych oraz
metodami hodowli mikroorganizmów

•

Mikroskopy stosowane w badaniach mikrobiologicznych

Podstawowe szkło

•

Probówki bakteriologiczne (probówki Falcone)

•

Płytki (szalki) Petriego

•

Kolby Roux (inne butelki)

•

Kolby Erlenmayera

Sprzęt do szczepienia

•

Igła bakteriologiczna

•

Eza bakteriologiczna

•

Głaszczka Drygalskiego

•

Palnik

Sprzęt do hodowli

•

Termostat

•

Wytrząsarka

Sprzęt do sterylizacji

•

Suszarka do sterylizacji szkła

•

Autoklaw do sterylizacji podłoży

Metody sterylizacji

•

Fizyczne

•

Chemiczne

Metody fizyczne

•

Wysoka temperaturą (sucha - wyżarzanie, opalanie, gorące powietrze i parą wodną -
dekoktacja, pasteryzacja, tyndalizacja, para wodna pod zwiększonym ciśnieniem -
sterylizacja)

•

Promienie elektromagnetyczne: UV, radiacyjne (jonizujące)

•

Sączenie

Metoda chemiczna

•

Sterylizacja gazowa (tlenek etylenu w mieszaninie CO

2

, beta-propiolakton, ozon i chlor,

fluor -woda)

Kontrola sterylizacji

•

Sporotesty (sporal A do autoklawów, sporal S do suszarek np. stericon plus Bioindicator do
autoklawu zawiera przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus w fiolce 2 ml). Po
autoklawowaniu ampułki inkubuje się 48 godz. w temp. 60± 2

o

C. Nie wysterylizowane jako

kontrola. Jeśli kolor pozostanie czerwono-fioletowy to sterylizacja poprawna.

Dezynfekcja

•

Środki chemiczne (kwasy, zasady, środki utleniające, alkohole, aldehydy, związki fenoli i
ich pochodne, związki powierzchniowo czynne, jodofory, chloroheksydyna, sole metali
ciężkich)

•

Kontrola skażenia powierzchni i powietrza drobnoustrojami

Zastosowanie podłoży mikrobiologicznych

•

Izolacja

•

Różnicowanie

•

Identyfikacja

•

Namnażanie

•

Określenie właściwości fizjologicznych, biochemicznych i hodowlanych

Rodzaje podłoży ze względu na zawartość składników odżywczych

•

Minimalne

•

Pełne

•

Wzbogacone

Rodzaje podłoży ze względu na skład chemiczny

•

Naturalne

•

Półsyntetyczne

•

Syntetyczne

Rodzaje podłoży ze względu na konsystencję

•

Stałe (zaw. 1,5-2,0% agaru)

•

Półpłynne (0,1-0,7 agaru)

•

Płynne

•

Agar - uniwersalny środek zestalający pożywki mikrobiologiczne (z morskich krasnorostów
Selidum amansi)

•

Żelatyna (produkt hydrolizy kolagenu)

Rodzaje podłoży ze względu na przeznaczenie i zastosowanie

•

Namnażające

•

Wybiórcze

•

Namnażająco-wybiórcze

•

Izolacyjne

•

Różnicujące (identyfikacyjne, diagnostyczne)

•

Podłoża „transportowe"

Metody hodowli

•

Ze względu na rodzaj podłoża:

◦

hodowle płynne

◦

hodowle na podłożu stałym

Hodowle płynne

•

W probówkach

•

W kolbach

•

W butlach

•

W fermentorach

Hodowle na podłożach stałych

•

Na płytkach Petriego

•

Słupkach

•

Skosach

•

W butlach

Ze względu na czas hodowli oraz dostęp do składników pokarmowych

Hodowle okresowe (zamknięte) - czynniki ograniczające to wyczerpanie składników
pokarmowych, nagromadzenie metabolitów i zmiana równowagi jonowej (głównie pH)
Hodowle otwarte (ciągłe) - ciągła kontrola zużycie substancji odżywczych, przyrost liczby i masy
drobnoustrojów oraz stężenie metabolitów
Hodowle zsynchronizowane - wszystkie osobniki dzielą się jednocześnie (w tym samym czasie)

Ze względu na stosunek bakterii do tlenu

•

Hodowle tlenowców

•

Hodowle beztlenowców

Hodowle tlenowców

•

Hodowle powierzchniowe

•

Hodowle wgłębne (wytrząsarki, fermentory)

Hodowle beztlenowców

•

Metody fizyczne (warstwa oleju parafinowego, słój próżniowy, hodowla w atmosferze gazu
obojętnego, przy użyciu zestawu np. „Gas-Pak")

•

Metody chemiczne (podłoża zawierające substancje chemiczne absorbujące tlen np.
pirogallol, chlorek miedziowy lub związki chemiczne obniżające potencjał oksydo-
redukcyjny np. kwas askorbinowy, siarczyn sodowy)

•

Metody biologiczne - hodowla na tym samym podłożu tlenowca i beztlenowca

Mikroskopy do obserwacji mikrobiologicznych

•

Świetlny

•

Z ciemnym polem widzenia

•

Kontrastowo-fazowy

•

Ultrafioletowy

•

Fluorescencyjny

•

Polaryzacyjno-interferencyjny

•

Elektronowy transmisyjny

•

Skaningowy

Mikroskop świetlny

•

Najważniejsze pojęcia dla mikrobiologa to powiększenie mikroskopu i zdolność rozdzielcza

•

Powiększeniem mikroskopu to stosunek obrazu pozornego A", który widzimy w
mikroskopie do wielkości przedmiotu (iloczyn powiększenia okularu i powiększenia
obiektywu)

•

Zdolność rozdzielcza (najmniejsza odległość pomiędzy dwoma punktami, przy której
widzimy je w mikroskopie oddzielnie)

•

Olejek immersyjny pozwala zwiększyć zdolność rozdzielczą mikroskopu do 0,19
mikrometra zwiększając aperturę liczbową obiektywu (suchy - 0,3 mikrometra, „wodny" -
0,24 mikrometra)

•

Zastosowanie odpowiednich filtrów lub światła UV może zwiększyć zdolność rozdzielczą
do 0,17 mikrometra

Mikroskop z ciemny polem widzenia

•

Pole widzenia ciemne, a obserwowane obiekty - jasne
(kondensor ciemnego pola)

•

Stosowany olejek immersyjny (górna soczewka
kondensora a dolna pow. preparatu)

•

Zdolność rozdzielcza podobna jak w mikroskopie
świetlnym

•

Obserwacje żywych bakterii

Mikroskop kontrastowo-fazowy

•

Bezbarwne obiekty fazowe (przezroczyste) przekształcane
są w obiekty amplitudowe powodujące zmiany natężenia
światła widoczne dla oka przy zastosowaniu płytki
fazowej

•

Umożliwia obserwacje żywych bakterii a w szczególności
ich ruchu (bez wybarwiania)

Mikroskop ultrafioletowy

•

Stosowane są lampy rtęciowo-kwarcowe

•

Poprzez zastosowanie światła UV ( o krótszej fali)
zwiększona została zdolność rozdzielcza do 0,1
mikrometra

Ilustracja 1: krętki

Ilustracja 2: komórki drożdży

Ilustracja 3: dwie kolonie Streptomyces
sp.

Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)

•

Wykorzystywane zjawisko pobudzania świecenia
preparatów oświetlanych promieniami ultrafioletowymi
po wybarwieniu fluorochromami (barwniki wysyłające
światło o długiej fali po wzbudzeniu promieniami UV)
np. erytrozyną, oranżem akrydynowym, rodaminą

Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny

•

Służy do obserwacji przezroczystych i pochłaniających
światło obiektów

•

Zastosowany pryzmat, polaryzator i analizator

•

Oglądany przedmiot robi wrażenie przestrzennego

Inne mikroskopy

•

Mikroskop elektronowy - transmisyjny (wykorzystywane są trzy elektromagnesy i wiązka
elektronów a obraz przekazywany jest na ekran lub kliszę fotograficzną), zdolność
rozdzielcza 4-10 siatki platynowe zamiast szkiełka podstawowego, preparaty bardzo cienkie
do 0,5 mikrometra, obraz trójwymiarowy

•

Mikroskop skaningowy (elektrony przechodzą przez cały preparat a powstały obraz może
być fotografowany lub obserwowany na monitorze) obraz trójwymiarowy, zdolność
rozdzielcza 0,02 mikrometra, obserwacja bakterii i ich penetracji w komórkach gospodarza

Obrazy z mikroskopu transmisyjnego

Ilustracja 4: bakterie z
fluoryzującym na zielono
białkiem

Ilustracja 6: pączkujące
drożdże (przekrój)

Ilustracja 5: Salmonella sp.

Obraz z mikroskopu skaningowego

Ilustracja 7: Bacillus anthrax

Ilustracja 8: Enterococcus faecalis